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ULTRARIPA® Kit 应用数据

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ULTRARIPA® Kit 应用数据



◆评价ULTRARIPA® Kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的能力


（数据提供：东京大学 大学院药学系研究科 卫生化学教室）

　　用PBS清洗COS-1细胞后，用SDS buffer、1％ Triton X-100 buffer，ULTRARIPA® Kit A buffer以及ULTRARIPA® Kit B buffer溶解，离心（14,000 rpm, 5 min, 4°C）。分离可溶性组分和不溶性组分。不溶性组分用等量的SDS-PAGE sample buffer变性溶解。通过SDS-PAGE / Western印迹评价脂筏标记物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1％Triton X-100和RIPA缓冲液中，大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜组分中，然而在ULTRARIPA® Kit B缓冲液中几乎全部溶解了。


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各缓冲液的成分：

●　 SDS buffer（2％SDS, 1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）
●　

ULTRARIPA® Kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH8.0)，150 mM NaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate)
●　 ULTRARIPA® Kit B buffer （不公开成分）
●　 1％ Triton X-100 (1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）

 

◆用ULTRARIPA® Kit观察NGF刺激依存的Integrin的脂筏转换


（数据提供：国立精神·神经医疗研究中心 神经研究所 疾病研究第五部）

使用的样本：小鼠来源原代培养DRG神经细胞（DIV13，～106 cells/35 mm dish）

目标蛋白：Integrinβ1, Flotillin 1

 

步骤：

1．在存在和不存在50ng/mL NGF的情况下培养神经细胞（各准备2个样品）

2．用PBS清洗COS-1细胞后，添加150 μL ULTRARIPA® Kit A-buffer，并在冰上孵育

3．离心分离可溶性组分①和不溶性组分

4．准备的2个A-buffer不溶性组分的样品，其中一个管添加150 μL 1× SDS sample buffer使其完全溶解②

5．添加150 μL B-buffer至另一管A-buffer不溶性组分中，悬浮沉淀物

6．离心并分离B-buffer可溶性组分③和不溶性组分

7．添加150 μL 1× SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性组分中，使其完全溶解④


结果：

　　与NGF刺激中未看到Flutillin的波动相比，观察到了Integrinβ1通过NGF浓缩在RIPA不溶性部分中。


ULTRARIPA® Kit 应用数据

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◆使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物


（本数据是在Funakoshi与学习院大学理学部 高岛明彦教授，住冈晓夫助教共同研究下取得）

■  直接添加B-buffer验证溶解效率

使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分*

*P2模组分的回收步骤


　　从小鼠脑组织切除海马体以及大脑皮质，添加匀浆缓冲液（10 mM HEPES (pH 7.4), 0.32 M Sucrose, protease inhibitors）并用Dounce型匀浆器破碎。

　　低速（×1,000 g）10分钟离心组织破碎液，去除沉淀的核组分（P1组分）。

　　上清（S1）组分用中速（×13,200 g）20分钟进一步离心，去除上清（S2）组分，回收沉淀的膜（P2）。

 

使用缓冲液条件：

SDS：2％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

1％ Triton：1％ TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

ULTRARIPA® Kit

A-buffer(RIPA)：1％ NP-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

B-buffer：非公开

 

步骤：

1． 添加各缓冲液100 mL至P2组分中，在冰上进行超声处理

2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，沉淀不溶性组分，回收各可溶性组分

3． 添置100 μL 2% SDS缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。

 

结果：

　　在经过验证的所有神经突触相关蛋白中，ULTRARIPA® Kit B-buffer的溶解效率比1％Triton X-100和RIPA缓冲液（A-buffer）高。


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■  验证神经细胞膜来源RIPA不溶性组分的B-buffer溶解效率

使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分


步骤：

1． 添加200 μL A-buffer（RIPA）至P2膜组分，在冰上进行超声处理

2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，除去可溶性组分，单独分离不溶性组分。

3． 添加200 mL 2% SDS，A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性组分，在冰上进行超声处理

4． 离心（×100,000 g）各溶液，并分离可溶性组分和不溶性组分

5． 为了检测B-buffer不溶性组分中残留的蛋白，添加2% SDS至B-buffer组分中使其完全溶解

 

结果：

发现B-buffer能够溶解神经细胞膜的RIPA不溶性组分中包含的大多数蛋白。

此外，还可以高效提取NMDA型谷氨酸受体亚基的GluN1和GluN2B。

另一方面，尽管PSD 95的可溶性有所提高，但发现它仍残留在B-buffer的不溶性组分中。

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■  使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触蛋白复合物

使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的P2膜组分

目标：NMDA型谷氨酸受体NMDAR（GluN1/GluN2B）

          AMPA型谷氨酸受体 AMPAR（GluA1/GluA2）

 

步骤：

1．  添加ULTRARIPA® Kit B-buffer至P2膜组分，在冰上进行超声处理；
2．  高速离心（×100,000 g）破碎液，获取可溶性组分；
3． 

添加1 μg对照IgG或抗GluN2B抗体或GluA2/3抗体至100 μL可溶性组分，并在4°C下反应1小时后，添加20μL bed vol Protein A磁珠并反应1小时；
4．  用PBST（0.05% Tween20 in PBS）清洗磁珠3次；
5．  添加1×SDS-PAGE样本缓冲液，在100°C加热条件下洗脱。


结果：

使用ULTRARIPA® Kit B-buffer，NMDAR，AMPAR都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。

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＊SYN (Synaptophysin)

相关产品信息请点击文字：UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装


UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装 UltraRIPA kit for Lipid Raft

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UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装
UltraRIPA kit for Lipid Raft

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UltraRIPA kit for Lipid RaftUltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装 UltraRIPA kit for Lipid Raft

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代 RIPA 缓冲液



　　与常规的非变性细胞裂解缓冲液（RIPA buffer, 1% Triton X-100 等）相比，这款缓冲液套装（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏（Lipid Raft）蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中，在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取，有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。

　　※本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。

 


◆细胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）


　　裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候，经常会使用 RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）缓冲液和1% Triton X-100 缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小，适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分析。另一方面，与具有很强的蛋白质变性作用的 SDS 缓冲液相比，增溶能力较弱，完全不能溶解以脂筏（Lipid Raft）为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏，故其又被称为 Detergent Resistant Membrane（DRM）。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。

 

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　　脂筏（Lipid Raft）是由胆固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI锚定蛋白（GPI anchor protein）和棕榈酰化（palmitoylation）蛋白质组成的细胞膜构造，被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫突触是脂筏的代表性例子。

 

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脂筏示意图



◆特点


●

操作简单，能快速提取脂筏蛋白

●

使用两种类型的缓冲液（A buffer，B buffer）进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白

●

Buffer 提取的任何蛋白质都不会失活

●

A buffer 和一般的 RIPA buffer 成分相同＊。B buffer 含有表面活性剂，可以通过透析除去

●

适用于哺乳动物细胞/组织

●

使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA 法）、SDS-PAGE 和 Western blot 等

＊

1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate

 

◆缓冲液套装组成


　　●　A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

　　●　B buffer（10 mL）

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◆使用方法


1、 用 A buffer 溶解组织或培养细胞。
※ 为了提高溶解效率，推荐使用均质或超声波破碎设备。
2、

进行离心分离，使 A buffe r中可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀）分离，分别回收。上层清液 A buffer 可溶性组分中主要含有胞浆蛋白和非脂筏蛋白。
3、 往沉淀的 A buffer 不溶性组分中加入 B buffer，形成悬浊液。
4、 进行离心分离，与步骤2一样分离出可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀），分别回收。上层清液的 B buffer 可溶性组分中含有脂筏蛋白。
5、 可应用于各种实验。
※ A buffer 和 B buffer 不可用于 Bradford 法蛋白质定量。蛋白质定量请使用 BCA 检测。
※ 使用本品 A buffer 和 B buffer 进行两个阶段的提取是最适宜的，也有只对细胞使用 B buffer 进行溶解和提取的例子。具体请参照以下例子。

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UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比较


蛋白分离

蛋白结构

蛋白功能

应用

胞质蛋白

膜蛋白

非脂筏蛋白

脂筏蛋白

＞1%SDS buffer

○

○

○

╳

╳

SDS-PAGE

RIPA   buffer

○

○

╳

○

○

酶分析法测定

免疫沉淀

SDS-PAGE等

UltraRIPA

○

○

○

○

○

◆应用例


从脂筏中提取总蛋白


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　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer 进行提取。提取后的总蛋白用 SDS-PAGE/银染色检测（左），用 BCA 法定量蛋白质（右）。相对于具有很强的蛋白质变性作用的２% SDS 缓冲液，UltraRIPA kit 能够提取 70% 以上的蛋白质。

　　※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。

脂筏标记蛋白的提取


　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer，提取后进行 SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行 Western blot 检测。


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脂筏标记蛋白的免疫沉淀


　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分，通过 B buffer 提取脂筏标记蛋白。对 buffer 提取物使用脂筏标记蛋白 PSD95 的抗体和Ｇ蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗 PSD95 抗体通过 Western blot 检测进行确认。


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提取的蛋白质的酶活性测定


　　用１%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和２%SDS 溶解 CHO 细胞，测定溶解物中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。２%SDS 具有很强的蛋白质变性作用，在几乎完全失活的情况下，１% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和 UltraRIPA kit B buffer 所得的酶活性大致相同。


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从脂筏中提取功能蛋白


　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分。用 A buffer 分三次冲洗不溶性组分，消除 RIPA 可溶性组分中脱磷酸酶的活性。往不溶性组分中分别添加２% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和 B buffer，测定各种提取物的总脱磷酸化酶活性。下图是各缓冲液从 RIPA 不溶性组分中提取的蛋白质的量（左轴：黑）和所检测的脱磷酸酶的活性（右轴：红）的示意图。２% SDS buffer 能够从 RIPA 不溶性组分中很好地提取蛋白质，但容易导致蛋白质变性，完全失去脱磷酸化活性。RIPA buffer 不能提取蛋白质，活性也无法检测。UltraRIPA kit B buffer 所提取的蛋白质大约为２% SDS buffer 的 70%，且可以检测出较强的脱磷酸化活性。

 

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UltraRIPA kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的可能性评价

※数据提供：东京大学药学院研究生院保健化学系


　　用 PBS 冲洗 COS-1 细胞，分别使用 SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和 UltraRIPA kit B buffer裂解，通过离心分离（14,000 rpm，5 min，4℃）可溶性组分和不可溶性组分。不可溶性组分用等量的 SDS-PAGE 样品缓冲液变性溶解。脂筏标记 Flotilin1 的可溶部分通过 SDS-PAGE/western blot 测定。使用１% Triton X-100 和 RIPA buffer，大部分的 Flotilin 1 不溶性膜组分没有被溶解，而 UltraRIPA kit B buffer 几乎可以全部溶解。


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◆各buffer组成


● SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）
●

UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl，

0.5％ Sodium Deoxycholate)
● UltraRIPA kit B buffer (成分保密)
● 1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150mM NaCl）

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相关资料


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UltraRIPA kit for Lipid Raft

Q-1．

如果单独使用Ｂ缓冲液，溶解效率是否高于 RIPA 缓冲液？

A-1．

Ｂ缓冲液的溶解活性比 RIPA（Ａ缓冲液）高。本试剂盒的操作分为２个阶段，首先将 RIPA 不溶性组分回收并用Ｂ缓冲液将其溶解，并以浓缩和简单提取 RIPA 不溶性组分中含有的脂筏蛋白为目的而进行第２阶段的操作。但是，如果是直接用Ｂ缓冲液处理样本的时候，溶解率的确比 RIPA 高。

Q-2．

使用 ULTRARIPA® Kit 是否只可以提取脂筏蛋白？

A-2．

多数研究认为，脂筏的细胞膜穴样内陷和神经突触中含有的组成蛋白不能用 Triton X-100 等温和的表面活性剂溶解，因此认为表面活性剂的不溶性组分（DRM）是生化脂质筏。本产品着眼于 RIPA 不溶性组分富含的脂筏蛋白，用Ｂ缓冲液进一步使其溶解，使得脂筏蛋白在非变性状态下溶解。因此，即使不是脂筏，只要是不溶于 RIPA 的样本，都可以使用本试剂盒进行检测（关于核蛋白的污染参见 Q-3）。本试剂盒使用溶解能力较高的 RIPA 缓冲液作为Ａ缓冲液，但是也可以用１% Triton X-100 等的裂解缓冲液代替 RIPA 缓冲液。

Q-3．

推荐使用均质或超声破碎设备，单独使用涡旋和移液是否不够充分？

A-3．

本产品采用Ａ缓冲液溶解后离心，并回收 RIPA 不溶性组分这样简单的步骤。因此，如果有细胞/组织的未破碎物或核残留的话，则可能污染 RIPA 不溶性组分。特别是 RIPA 缓冲液的核溶解效率较弱，如果不添加物理破碎，则核可能会大量残留在 RIPA 不溶性组分中。另一方面，由于Ｂ缓冲液的核溶解率较高，如果有核残留的话就会释放出 DNA，使溶液变浑浊。在Ａ缓冲液溶解时进行超声处理的话可以破坏核以及使基因组 DNA 片段化。核的污染可能会影响后续的应用，因此，我们强烈推荐使用均质或超声破碎设备。

Q-4．

Ｂ缓冲液的成分是什么种类的表面活性剂。听说表面活性剂的种类会影响电泳，我想知道它的成分。

A-4．

非常抱歉，Ｂ缓冲液的成分是非公开的。 我们无法告诉您表面活性剂的种类。然而，我们可以确定Ｂ缓冲液不会影响电泳。

Q-5．

几乎无法看见Ａ不溶性组分。即使添加了Ｂ缓冲液也无法获取蛋白质量，怎么办？

A-5．

RIPA 缓冲液可以溶解90~95%包括膜蛋白在内的总蛋白（根据组织/细胞种的不同多少会有点差别）。因此，考虑蛋白质总量时，RIPA 不溶性组分中含有的蛋白为样本总体的10%以下。肉眼无法看见 RIPA 不溶性组分时，需要增加细胞数/组织量。想要提高Ｂ缓冲液溶解组分蛋白浓度时，减少添加至 RIPA 不溶性组分的Ｂ缓冲液的量就可以得到改善。我们建议您可以设置如下的阳性对照。
探讨样本量的阳性对照实验

需要准备的试剂：２% SDS缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,150 mM NaCl，２% SDS）

步骤：回收 RIPA 不溶性组分后，添加２%SDS缓冲液，通过进行蛋白质定量检测，可以预估 RIPA 不溶性组分中含有的蛋白质总量。

Q-6．

在Ａ缓冲液溶解组分中可以观察到脂筏标记物，有什么改善的方法吗。

A-6．

我们无法保证在其他方法中作为脂筏标记物被检测出的蛋白能否在Ａ缓冲液不溶性组分中获得。特别是根据脂筏标记物的不同，细胞种类/组织，有无外部信号也会有变动。我们会根据以下案例提供相关的改善方法，请酌情参考。

例1：不溶于1％Triton X-100，但用RIPA缓冲液可以检测出可溶性组分。

改善方法：可能是由于RIPA缓冲液（1%NP-40，0.1% SDS,0.5% sodium deoxycholate）的提取效率比1％Triton X-100强，所以能将其溶解。这时候，可以通过用1％Triton X-100缓冲液代替A缓冲液来浓缩以及溶解目的蛋白。

例2：离心条件不足时，虽然不溶解，但是不沉淀。

改善方法：虽然我们推荐的离心条件为10,000×g，但是根据目的蛋白的不同，离心10,000×g可能不足。这时，也有把离心条件调整为20,000×g之后得到改善的案例。因此，我们建议您可以探讨一下离心条件。

Q-7．

用B缓冲液洗脱的蛋白可以用于质谱分析吗？

A-7．

B缓冲液溶解的蛋白经过SDS-PAGE分离后，可以通过一般的蛋白质组学分析的顺序（切割凝胶，在凝胶中进行胰蛋白酶消化，提取肽以及脱盐操作）进行分析。

Q-8：

用B缓冲液提取后，我想用适合试验的缓冲液来置换它。 可以通过透析去除B缓冲液的表面活性剂吗？

A-8：

B缓冲液含有的表面活性剂可以通过透析去除。请使用孔径为5 kDa的透析膜。但是，也有根据蛋白质的不同，在去除表面活性剂时也可能会聚集或变性，需要添加别的表面活性剂到透析缓冲液中。建议进行预实验。

参考文献



1.

Taruno A, Sun H, Nakajo K, et al. Post-translational palmitoylation controls the voltage gating and lipid raft association of CALHM1 channel. [J]. Journal of Physiology, 2017, 595(18).

2.

Tan, H.R., Tan, J. R., Ng, Y. Y., Chua, J. E., Chew, W. S., & Muralidharan,S., er al. (2017). Enriched Expression of Neutral Sphingomyelinase 2 in the Striatum is Essential for Regulation of Lipid Raft Content and Motor Coordination. Molecular Neurobiology, 55(7), 5741–5756.

3.

Yusuke, T. , Busra, A. , Mihail, S. , Nurhan, O. , & Shigeaki, S. . (2018). Extracellular glucose level regulates dependence on GRP78 for cell surface localization of multi-pass transmembrane proteins in Hela cells. FEBS Letters.
4.

Araki, K. , Kawauchi, K. , Sugimoto, W. , Tsuda, D. , Oda, H. , & Yoshida, R. , et al. (2019). Mitochondrial protein e2f3d, a distinctive e2f3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells. Communications biology, 2, 3.
5.
Kishimoto, S. , & Fukushima, S. . (2018). Abstract 5837: acquired resistance to anticancer drug of high glucose-exposed hepg2. Cancer Research, 78(13 Supplement), 5837-5837.

产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
F015 UltraRIPA kit for Lipid Raft 1kit － －