AteloGene^® siRNA 活体转染试剂盒

AteloGene^® Quick Gelation

◆原理

　　AteloGene^® 的主要成分是 Atelocollagen（去端肽胶原），将合成的 siRNA/miRNA 通过适当混合，形成 siRNA/miRNA 的 Atelocollagen 复合体，该复合物可有效导入细胞，因此适用于活体内转染。

◆制备

　　siRNA/Atelogene 复合物的制备极其简单：取等体积的 AteloGene^® 与 siRNA/miRNA 溶液混合后，注射到小鼠即可。

　　*siRNA/miRNA 溶液体积：局部 5-10 μM，全身 20-40 μM siRNA

siRNA被高效导入组织

　　Atelocollagen 和 25 μg 的 siRNA 混合后，通过尾静脉注射，24小时后，可在不同组织中检测到 RNA 的存在。 

操作步骤

         AteloGene™ 和合成的小 RNA 即混即用：

         ●　专门用于 siRNA/miRNA 体内转染

         ●　保护 小RNA 不被RNase降解，延长作用时间

         ●  “AteloGene™”无毒性，其组成成分去端肽胶原具有高生物相容性

         ●　使用 “AteloGene™ Local Use”，局部给药，给药后，会在体内形成局部凝胶，保持 siRNA停留在给药部位。

         ●　使用“AteloGene™ Systemic Use”，通过尾静脉注射，全身给药。 给药后，不会在体内形成凝胶，尾静脉注射，通过血液循环，siRNA

               被有效的输送到全身。 

◆案例、应用

【转染人 RGM249 基因的３种小分子 RNA 后肿瘤明显减小】

　　从人 RGM249 基因的小分子 RNA 中，选择三种 siRNAs 和 AteloGene^® Local Use 试剂混合，注射到人恶性黑色素瘤皮下肿瘤模型鼠中。
　　４周后观察到，注射 siRNA 和 AteloGene^® 混合物的模型鼠其皮下肿瘤扩散明显减少。

【已报道的 AteloGene^® 系列转染案例】

◆产品列表

*标准操作中，每小鼠最大注射剂量为 200 μL；客户可根据实际注射部位调整使用量 10~200 μL。
*以最大剂量计，每 Kit 至少可注射12次

常见问题

Q1：   Atelocollagen（去端肽胶原）与普通天然胶原的区别

A1：   Atelocollagen（去端肽胶原）是一种通过蛋白酶溶解的胶原蛋白，其物理性质与未经过蛋白酶作用的天然胶原蛋白几乎相同。

          同时，Atelocollagen 还具有更优越的特性：

          低抗原性

          Atelocollagen 是经过蛋白酶处理的小牛皮来源的高纯度I型胶原蛋白。胶原蛋白分子在Ｎ端和Ｃ端具有一段氨基酸序列，称为端肽，胶原

          蛋白的抗原性多来自于此。 Atelocollagen 通过蛋白酶的作用，去掉了端肽，故具有低免疫原性。

          高纯度

          Atelocollagen 的纯度极高。该特性得益于蛋白酶处理过程，该处理在提取去端肽胶原的过程中，因为蛋白酶的作用也分解了其他蛋白污

          染物。

          高度生物相容性

          Atelocollagen 可生物降解，因此可用于各种领域，如医药，医疗器械，作为化妆品原理，及细胞培养研究。

          高度可塑性

          去端肽胶原可被改造成许多不同的物理性状，如膜、海绵状结构、带状结构、粉末和凝胶。我们可利用去端肽胶原的这一特性，生产适用

          于任何领域的物理性状。例如，去端肽胶原不溶于中性水，但可以通过改变性状，使其溶于中性水中。同样，可以利用去端肽胶原的这一

          特性，将其作为凝固剂或抗凝剂，并可以控制其被人体吸收的速率。

          安全性

          我们精确管理每一只用于生产去端肽胶原的牛，以确保原料的安全性。

          A. 我们使用的牛真皮来自澳大利亚国家畜牧业溯源系统，牛龄为６月或更小的牛犊。

          B. 我们不使用动物饲料喂养牛羊，只用无疯牛病的安全饲料。

          C. 我们只使用牛皮的真皮层，其被归于“无传染性”类（WHO对传染性海绵状脑病组织感染性分布准则）。

          　 收集的过程中，我们非常小心防止真皮层与危害部位接触，如大脑和脊柱。

          D. 我们能够对胶原蛋白生产的原料进行溯源。

Q2：  转染试剂盒内的去端肽胶原溶液和医用级别的去端肽胶原溶液有何区别？

A2：  我们对试剂盒内的去端肽胶原浓度以及缓冲液成分进行了优化，以提高siRNA的转染效率；使用的去端肽胶原与医用级别的制造工艺相同，

          故该转染试剂盒对试验动物非常安全，且具有高度生物相容性。

Q3：  AteloGene^® 活体转染的优势

A3：  AteloGene^® 和合成的小RNA即混即用

          ●　专门用于 siRNA/miRNA 体内转染

          ●　保护小 RNA 不被 RNase 降解，延长作用时间

          ●　AteloGene^® 无毒性，其组成成分去端肽胶原具有高生物相容性

          ●　使用 AteloGene^® Local Use，局部给药，给药后，会在体内形成局部凝胶，保持 siRNA 停留在给药部位。

          ●　使用 AteloGene^® Systemic Use，通过尾静脉注射，全身给药。 给药后，不会在体内形成凝胶，尾静脉注射，通过血液循环，siRNA

            　被有效的输送到全身。

Q4：  AteloGene^® 与 siRNA 复合物在血液中稳定吗？

A4：  我们已经证明，AteloGene^® 与 siRNA 复合物能够抵御如RNA酶等物质的作用。

          Atelocollagen 和 25 μg 的 siRNA 混合后，通过尾静脉注射，24小时后，可在不同组织中检测到 RNA 的存在。

          参考文献 : Takeshita F, et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors 

                           by using atelocollagen in vivo. (2005) Proc Natl Acad Sci USA. 102(34):12177-12182.

Q5：  能否使用市面上，传统的胶原蛋白进行 siRNA 转染？

A5：  我们不建议这样做，因为您需要根据具体条件进行额外的实验。

Q6：  AteloGene^® QG 与 AteloGene^® 两款产品有何区别？

A6：

          AteloGene^® QG与AteloGene^® 凝胶形成时间对比：

Q7：   能否使用 AteloGene^® 转染体外培养细胞？

A7：   AteloGene^® 是专门为体内转染而研发的，因此我们不建议您用于体外实验。

          体外转染研究，推荐您使用 Cosmo Bio 的 GenomONE™ 仙台病毒包膜转染试剂盒，可转染 DNA、siRNA、ODN、蛋白抗体等分子；该

          产品使用安全，可替代传统的病毒转染及脂质体转染方法。GenomONE™ 的更多资料，请向我司索取。

Q8：  AteloGene^® 能否用于质粒 DNA 转染？

A8：  AteloGene^® 是专门用于siRNA转染的产品，因此我们不建议您用于质粒 DNA 转染。

          以下两篇是使用 AteloGene^® 转染质粒DNA的文献，供您参考：

          a.      内皮功能障碍研究，静脉注射

                   Shinozaki K, et al. (2005)Cardiovasc Pharmacol. 46(4):505-512.

          b.      脑胶质瘤研究，肿瘤内给药

                   El Sayed SM, et al. (2012) Cancer Gene Ther. 19(1):1-18.

Q9：  能否提供免费试用装，用于评估产品效果？

A9：  我们无法提供免费试用装。

        （AteloGene^® 已有大量文献和研究证明其有效性，如果您需要相关领域的运用情况，请查看文献列表）

Q10：AteloGene^® 与 siRNA 复合物在血液中稳定吗？

A10：我们已经证明，AteloGene^® 与 siRNA 复合物能够抵御如 RNA 酶等物质的作用。

          具体请参考“RNAi 效率”相关文献。

          Takeshita F, et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. (2005) 

          Proc Natl Acad Sci USA. 102(34):12177-12182."

Q11： 试剂盒组成？

A11： 1 Kit 按照最大剂量计算，至少可用 10 次。

           – 预充式注射器 600 µL×２ （每只注射器内预填充的“AteloGene^®”至少可给药５次）

           – 10×siRNA 缓冲液: 3 mL×１瓶

           – 无菌水：3 mL×１瓶

           – 微型管：2.0 mL×2管

           – 一次性注射器: 1 mL×2只

           – 18G 注射、抽吸用针头：４只

           – 26G 注射针头: 2只

           – 说明书：１份

Q12： AteloGene^® 如何使用？

A12： 具体操作请参照产品说明书。

          1) 准备AteloGene^®

              将预充式注射器内的AteloGene^® 转移到微管中，并放置于冷却设备上保持低温。

          2) 准备siRNA溶液

              根据局部给药和全身给药的情况，分别准备 600 µL 5-10 µM 或 20-40 µM siRNA 溶液，并保持低温。

          3) 制备 AteloGene^® 与 siRNA 的混合溶液

              将 siRNA溶液（步骤2）缓慢加入 AteloGene^®（步骤１），通过上下旋转混合，得到 AteloGene^® 和 siRNA 混合物，以上操作均在

              冷却设备中进行。

          4) 消除气泡及准备给药

              将第３步得到的混合物离心，去除气泡后，吸入一次性注射器内。

          <局部给药>

              注射 AteloGene^® 和 siRNA 复合物使其包裹整个靶标部位。每只小鼠的标准剂量为 200 µL 复合物。

          ●　局部给药案例

              皮下肿瘤给药

              a. 如有必要，请麻醉动物。

              b. 在距肿瘤边缘 5 mm 的位置插入针头，针头截面向上。

              c. 将针头平行于皮肤插入距离肿瘤 2~3 mm 的位置，然后缓慢的注射 200 µL AteloGene^® 和 siRNA 复合物。使复合物包裹住整个

                 肿瘤。

          <全身给药>

              每只小鼠的标准剂量为 200 µL AteloGene^® 和 siRNA 复合物。

              每次注射的上限是 200 µL，请确保不会超过这个剂量。

              a. 如有必要，请麻醉动物。

              b. 固定小鼠。

              c. 用浸润乙醇的棉签擦拭消毒小鼠尾巴。

              d. 将针头插入尾部静脉1/4-1/3处，该部位应该是完全膨胀。

              e. 确认针头插入了正确的部位，然后缓慢的注入 200 µL AteloGene^® 和 siRNA 复合物。

              f.  确认小鼠恢复正常。

Q13：  储存注意事项

A13：  产品需储存于2-10℃（不可冷冻）。

           ★ 当温度高于20℃时，AteloGene^® 会发生凝胶化和热变性，如果产品已经发送凝胶化和热变性，请立即停止使用。

           ★ 冷冻 AteloGene^® 会导致混合物中产生分散性气泡，请勿使用冷冻后的 AteloGene^® 进行实验。

Q14：  产品有效期

A14：  产品生产后３年有效。

Q15：  使用注意事项

A15：1) 该试剂仅供科研使用，禁止用于人体实验。请勿用于科研以外的任何目的。

          2) 务必在使用前仔细阅读说明书，制造商不对超出说明书使用方法得到的结果承担任何责任。

          3) 转染效率取决于siRNA序列、靶基因的表达水平、不同组织和给药方式等多方面因素，可能并不总是得到预期的效果。

              实验前，请您调查好给药后的作用持续时间及分析方法。

Q16：  操作注意事项

A16：  在洁净的环境下进行所有步骤：

          ●　使用恰当的方法消除 RNA 酶，避免的 siRNA 的降解。

          ●　在储存过程中，10×siRNA 缓冲液可产生结晶。如出现这种情况，使用之前将其加热到约 37℃，使之完全溶解。

          ●　使用 AteloGene^® 和 siRNA 的混合物前，确保气泡已完全消除。