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品牌：FUJIFILM Wako
CAS No.： 储存条件：2-10℃ 纯度：– |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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349-90873 |
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特点：
● 标记的物质可以在大约2个小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 标记的物质可以用所附的保存溶液保存。
试剂盒内含
产品概述
ICG（吲哚菁绿）是一种花青颜料，也用于肝功能和肝储备测试的色素负载测试中，并且在近红外区域具有荧光。激发波长在774nm附近，荧光波长在805nm附近，并且具有即使在体内使用也不容易被血红蛋白干扰的荧光特性。因此，期望将其应用于使用近红外荧光的体内荧光成像。 ICG标记试剂盒-NH2是用于标记具有氨基基团的蛋白质（尤其是抗体）的试剂盒。套件随附的NH2-Reactive以及已发布的荧光素标记套件–NH2（代码：LK01），HiLyte FluorTM 555标记套件–NH2（代码：LK14），HiLite FluorTM 647标记套件–NH2（代码：LK15）由于ICG在分子中具有活性酯，因此仅通过与具有氨基的分子混合即可形成稳定的共价键。当将ICG标记在蛋白质上时，可以使用随附的过滤管轻松去除抑制标记反应和未反应的NH2反应性ICG的低分子量化合物（例如Tris）。对于ICG标记的IgG，荧光波长为774/805nm。
该试剂盒包含标记所需的试剂和用于储存准备好的ICG标记产品的溶液。
原理
操作步骤
使用注意事项:
如果样品中含有分子量>10,000的物质 (多肽、其它蛋白等)，有阻碍标记反应的可能性。在标记前需要先纯化，如果样品是抗体，可用 IgG Purification Kit (AP01，AP02)纯化，如果样品中有小的不溶物质，离心后取上清液来标记。
操作步骤：
a) 蛋白溶液量要≤100ul，如果抗体浓度<0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总蛋白量达到50-200ug。
b) 如果溶液在离心后仍然残留在膜上，继续离心5min或提高转速。
c) NH2-Reactive ICG在管子的底部，加10ul DMSO到管子的底部，用移液器反复吹打溶解。由于NH2-Reactive ICG会被DMSO中的水分水解，在制备好NH2-Reactive ICG溶液后马上进行第4步操作。
d) 如果蛋白总量达到200ug，请加入全部NH2-Reactive ICG溶液。
e) 我们推荐用WS Buffer保存标记产物，但也可以根据下一步实验要求选择合适的缓冲液。
产品优势
1）标记的物质可以在大约2个小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）标记的物质可以用所附的保存溶液保存。
ICG标记实验例
图. 小鼠尾静脉注射ICG抗体的荧光成像图小鼠皮下肿瘤模型在注射了ICG抗体 (50ug) 48h后，有明显的迹象表明抗体在肿瘤中有选择性地聚集。
仪器：活体成像仪 (Clairvivo OPT，岛津制作所)
小鼠：BALB/c(nu/nu) 纯合子裸小鼠 (母，11周)
肿瘤细胞：HeLa细胞 (在右腋皮下移植后4周)
检测条件：Ex=785nm，Em=845/55nm
抗体：整合素α2抗体 曝光时间：10s
荧光特性
常见问题Q&A
| Q1: 标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法。 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使用50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
参考文献
| 1) M. Ogawa, C. A. S. Regino, J. Seidel, M. V. Green, W. Xi, M. Williams, N. Kosaka, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “Dual-Modality Molecular Imaging Using Antibodies Labeled with Activatable Fluorescence and a Radionuclide for Specific and Quantitative Targeted Cancer Detection”, Bioconjugate Chem., 2009, 20(11), 2177. |
| 2) M. Ogawa, N. Kosaka, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “In vivo Molecular Imaging of Cancer with a Quenching Near-Infrared Fluorescent Probe Using Conjuates of Monoclonal Antibodies and Indocyanine Green”, Cancer Res., 2009, 69(4), 1268. |
| 3) N. Kosaka, M. Ogawa, P. L. Choyke and H. Kobayashi, “Clinical implications of near-infrared fluorescence imaging in cancer”, Future Oncology, 2009, 5(9), 1501. |
| 4) 伊藤進, 六車直樹, 林重仁, 日下至弘, 多田津昌也, 多田津陽子, 岡本耕一, 井本佳孝, 稲山久美, 坂東輝美, 田岡聡子, 高川真由子, 矢野充保, 伊井邦雄, 長尾善光, 佐野茂樹, 芝村誠一, 島田典昭, 石田和彦, 中村一成, “赤外線蛍光内視鏡の原理と臨床応用”, Biomedical THERMOLOGY, 2003, 23(2), 77. |
| 5) S. Ito, N.Muguruma, S. Hayashi, S. Taoka, T. Bando, K. Inayama, M. Sogabe, T. Okahisa, S. Okamura, H. Shibata, T. Irimura, K. Takesako and S. Shibamura, “Development of Agents for Reinforcement of Fluorescence on Near-infrared Ray Excitation for Immunohistological Staining”, Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 613. |
| 6) S. Ito, N. Muguruma, Y. Kakehashi, S. Hayashi, S. Okamura, H. Shibata, T. Okahisa, M. Kanamori, S. Shibamura, K. Takesako, M. Nozawa, K. Ishida and M. Shiga, “Development of Fluorescence-Emitting Antibody Labeling Substance by Near-Infrared Ray Excitation”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 2689. |
| 7) K. Inayama, S. Ito, N. Muguruma, Y. Kusaka, T. Bando, Y. Tadatsu, M. Tadatsu, K. Ii, S. Shibamura and K. Takesako, “Basic Study of an Agent for Reinforcement of Near-infrared Fluorescence on Tumor Tissue”, Digestive and Liver Disease, 2003, 35, 88. |
| 8) S. Ito, N. Muguruma, S. Hayashi, S. Taoka, T. Bando, Y. Kusaka, M. Yano, S. Ichikawa, A. Hiasa, T. Omoya, H. Honda, I. Shimizu, K. Ii, K. Nakamura, K. Takesako, Y. Goto and S. Shibamura, “Visualization of Human Gastric Cancer with a Novel Infrared Fluorescent Labeling Marker of Anti-carcinoembryonic Antigen Antibody in vitro”, Dig. Endosc., 2000, 12, 33. |
| 9) S. Taoka, S. Ito, N. Muguruma, S. Hayashi, Y. Kusaka, K. Ii, K. Nakamura, K. Imaizumi, K. Takesako and S. Shibamura, “Reflected Illumination-type Imaging System for the Development of Infrared Fluorescence Endoscopy”, Dig. Endosc.,1999, 11(4), 321. |
| 10) S. Ito, N. Muguruma, S. Hayashi, S. Taoka, A. Tsutsui, T. Fukuda, T. Okahisa, Y. Ohkita, H. Matsunaga, I. Shimizu, K. Nakamura, K. Imaizumi, K. Takesako and S. Shibamura,”Development of an Imaging System Using Fluorescent Labeling Substances Excited by Infrared Rays”, Dig. Endosc., 1997, 9, 278. |
| 11) S. Ito, N. Muguruma, Y. Kusaka, M. Tadatsu, K. Inayama, Y. Musashi, M. Yano, T. Bando, H. Honda, I. Shimizu, K. Ii, K. Takesako, H. Takeuchi and S. Shibamura, “Detection of Human Ganstric Cancer of Resected Specimens Using a Novel Infrared Fluorescent Anti-Human Carcinoembryonic Antigen Antibody with an Infrared Fluorescence Endoscope in Vitro”, Endoscopy, 2001, 33(10), 849. |
| 12) N. Muguruma, S. Ito, T. Bando, S. Taoka, Y. Kusaka, S. Hayashi, S. Ichikawa, Y. Matsunaga, Y. Tada, S. Okamura, K. Ii, K. Imaizumi, K. Nakamura, K. Takesako and S. Shibamura, “Labeled Carcinoembryonic Antigen Antibodies Excitable by Infrared Rays: a Novel Diagnostic Method for Micro Cancers in the Digestive Tract”, Internal Medicine, 1999, 38(7), 537. |
| 13) T. Bando, N. Muguruma, S. Ito, Y. Musashi, K. Inayama, Y. Kusaka, M. Tadatsu, K. Ii, T. Irimura, S. Shibamura and K. Takesako, “Basic Study on a Labeled anti-mucin Antibody Detectable by Infrared-fluorescence Endoscopy”, J. Gastroenterol., 2002, 37, 260. |
| 14) N. Muguruma, S. Ito, S. Hayashi, S. Taoka, H. Kakehashi, K. Ii, S. Shibamura and K. Takesako, “Antibodies Labeled with Fluorescence-agent Excitable by Infrared Rays”, J. Gastroenterol., 1998, 33, 467. |
| 15) 伊藤進, 六車直樹,“不可視情報の画像化－新しい内視鏡診断学の展望 (5)赤外蛍光を用いた微小癌診断”, 臨牀消化器内科, 1999, 14(8), 1205. |
| 16) W. Aung, A. Tsuji, H. Sudo, A. Sugyo, T. Furukawa, Y. Ukai, Y. Kurosawa and T. Saga, “Immunotargeting of Integrin α6β4 for Single-Photon Emission Computed Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer Model”, Molecular Imaging, 2016, 15, 1. |
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特点：
● R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 也可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白，它的荧光强度要比化学荧光探针，如荧光素和罗丹明高得多。因此，用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。R-藻红蛋白(R-PE)是一种藻胆蛋白，它在578nm附近有橙色荧光，激发波长为488nm。R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH能够简便快速地制备被R-PE标记的IgG，SH-reactive R-PE（该试剂盒的成分之一）具有一个马来酰亚胺基，不需任何活化就能够轻易地与靶分子中的巯基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube能够快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了标记所需的全部溶液，包括制备带有SH的还原型IgG所需的还原剂以及储存标记产物的Storage buffer。
*R-PE: R-Phycoerythrin(R-藻红蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者R-Phycoerythrin-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）用移液器使溶液混合，然后8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将150μl WS buffer加入到Reducing agent中并用移液器吹打数次使其溶解。
（4）从步骤3所得的溶液中，取100μl转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吹打数次后，37℃培养30分钟。
（6）将100μl RA solution加入到管中，8,000-10,000g离心10分钟。弃滤液，加入200μl RA solution，再离心一次。b）
（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive R-PE并吹打其溶解。
（8）将所得的SH-reactive R-PE溶液转移到被还原的IgG所集中的过滤管的膜上。
（9）用移液器吹打数次后，37℃培养1小时。
（10）加入150μl WS buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c）将该溶液转移至0.5ml试管中，在0-5℃下保存。d）
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个R-PE分子。没有被结合的R-PE可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常R-PE标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1）R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）也可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6）带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
*还原剂经过优化，可减少IgG的制备。 当使用具有除IgG以外的S-S键的样品时，由于S-S键的断裂，标记分子的活性可能会丢失。请在确认不会发生因还原引起的失活后使用。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明，可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
| Q2:在与IgG反应后，未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基？ |
| A:没有。反应过程中，活性酯基完全被水解了 |
| Q3:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
|
Q4:荧光蛋白分为三种，每种的波长特征是什么？ |
| A:别藻蓝蛋白（缩写：APC）激发波长：650nm发射波长：660nm
B-藻红蛋白（缩写：B-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm R-藻红蛋白（缩写：R-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm |
| Q5:标记反应过程中，NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
| A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断，因此不会有低聚物生成。 |
|
Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
|
A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
|
Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
|
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
|
Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer？ |
| A:是的，要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
|
Q10:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息
特点：
● R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
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试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白，它的荧光强度要比化学荧光探针，如荧光素和罗丹明高得多。因此，用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。R-藻红蛋白(R-PE)是一种藻胆蛋白，它在578nm附近有红色荧光，激发波长为488nm。R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2能够简便快速地制备被R-PE标记的IgG，NH2-reactive R-PE（该试剂盒的成分之一）具有一个活性的酯基团，不需任何活化能够轻易地与靶分子中的氨基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube用来快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了包括标记产物的储存液等用于R-PE标记的所需的全部试剂。
*R-PE: R-Phycoerythrin(R-藻红蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者R-Phycoerythrin-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作概述
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟后，加入100μl Washing buffer再离心一次。b）
（3）完成离心后，将10μl Reaction buffer加入到NH2-reactive R-PE中并用移液枪吹打使其溶解。
（4）将含有NH2-reactive R-PE的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吸取溶液吹洗净整个滤膜表面，然后将过滤管放入培养箱中，37℃培养2小时。
（6）将190μl WS buffer加入到过滤管中并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。c） 将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个R-PE分子。没有被结合的R-PE可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常R-PE标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1）R-PE标记的产品可以在约2.5小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）带有R-PE标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明，可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
| Q2:在与IgG反应后，未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基？ |
| A:没有。反应过程中，活性酯基完全被水解了 |
| Q3:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
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Q4:荧光蛋白分为三种，每种的波长特征是什么？ |
| A:别藻蓝蛋白（缩写：APC）激发波长：650nm发射波长：660nm
B-藻红蛋白（缩写：B-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm R-藻红蛋白（缩写：R-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm |
| Q5:标记反应过程中，NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
| A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断，因此不会有低聚物生成。 |
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Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
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A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
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Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
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A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
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Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer？ |
| A:是的，要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
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Q10:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
1) K.R. McCarthy, A. Watanabe, M. Kuraoka, K.T. Do, C.E. McGee, G.D. Sempowski, T.B. Kepler, A.G. Schmidt, G. Kelsoe and S.C. Harrison, “Memory B Cells that Cross-React with Group 1 and Group 2 Influenza A Viruses Are Abundant in Adult Human Repertoires”, Immunity., 2018, 48, (1), 174.
2) K.Y Su, A. Watanabe, C.H. Yeh, G. Kelsoe, M. Kuraoka, “Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs”, J. Immunol.., 2016, 197, (10), 4163.
3) T. Tsujikawa, T. Yaguchi, G. Ohmura, S. Ohta, A. Kobayashi, N. Kawamura, T. Fujita, H. Nakano, T. Shimada, T. Takahashi, R. Nakao, A. Yanagisawa, Y. Hisa, Y. Kawakami, “Autocrine and paracrine loops between cancer cells and macrophages promote lymph node metastasis via CCR4/CCL22 in head and neck squamous cell carcinoma”, Int. J. Cancer., 2013, 132, (12), 2755.
4) Y. Inaguma, Y. Akahori, Y. Murayama, K. Shiraishi, S. Tsuzuki-Iba, A. Endoh, J. Tsujikawa, A. Demachi-Okamura, K. Hiramatsu, H. Saji, Y. Yamamoto, N. Yamamoto, Y. Nishimura, T. Takahashi, K. Kuzushima, N. Emi, Y. Akatsuka, “Construction and molecular characterization of a T-cell receptor-like antibody and CAR-T cells specific for minor histocompatibility antigen HA-1H”, Gene Ther.., 2014, 21, (6), 575.
5) A. Watanabe, K. R. McCarthy, M. Kuraoka, A. G. Schmidt, Y. Adachi, T. Onodera, K. Tonouchi, T. M.Caradonna, G. Bajic, S. Song, C. E. McGee, G. D. Sempowski, F. Feng, P. Urick, T. B. Kepler, Y. Takahashi, S. C. Harrison, and G. Kelsoe, ‘Antibodies to a Conserved Influenza Head Interface Epitope Protect by an IgG Subtype-Dependent Mechanism.’, Cell.., 2019, 177, (5), 1124.
关联产品
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特点：
● APC标记的产品可以在大约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50-200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 可以使用随附的保存溶液保存APC标签。
试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白，它的荧光强度要比化学荧光探针，如荧光素和罗丹明高得多。因此，用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。别藻蓝蛋白(APC)是一种藻胆蛋白，它在660nm附近有红色荧光，激发波长为488nm。Allophycocyanin Labeling Kit-SH能够简便快速地制备被APC标记的IgG，SH-reactive APC（该试剂盒的成分之一）具有一个马来酰亚胺基，不需任何活化就能够轻易地与靶分子中的巯基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube能够快速交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了标记所需的全部溶液，包括制备带有SH的还原型IgG所需的还原剂以及储存标记产物的Storage buffer。
*APC: Allophycocyanin (别藻蓝蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者Phycobiliprotein-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）用移液器使溶液混合，然后8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将150μl WS buffer加入到Reducing agent中并用移液器吹打数次使其溶解。
（4）从步骤3所得的溶液中，取100μl转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吹打数次后，37℃培养30分钟。
（6）将100μl RA solution加入到管中，8,000-10,000g离心10分钟。弃滤液，加入200μl RA solution，再离心一次。b）
（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive APC并吹打其溶解。
（8）将所得的SH-reactive APC溶液转移到被还原的IgG所集中的过滤管的膜上。
（9）用移液器吹打数次后，37℃培养1小时。
（10）加入150μl WS buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c）将该溶液转移至0.5ml试管中，在0-5℃下保存。d）
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个APC分子。没有被结合的APC可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常APC标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1）APC标记的产品可以在大约2.5小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50-200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）还可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6）可以使用随附的保存溶液保存APC标签。
*还原剂针对减少IgG的制备而优化。当使用带有除IgG以外的S-S键的样品时，由于S-S键的断裂，可能会失去待标记分子的活性。请在确认不会发生因还原引起的失活后使用。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明，可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
| Q2:在与IgG反应后，未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基？ |
| A:没有。反应过程中，活性酯基完全被水解了 |
| Q3:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
|
Q4:荧光蛋白分为三种，每种的波长特征是什么？ |
| A:别藻蓝蛋白（缩写：APC）激发波长：650nm发射波长：660nm
B-藻红蛋白（缩写：B-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm R-藻红蛋白（缩写：R-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm |
| Q5:标记反应过程中，NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
| A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断，因此不会有低聚物生成。 |
|
Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
|
A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
|
Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
|
A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
|
Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer？ |
| A:是的，要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
|
Q10:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
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特点：
● APC标记的产品可以在约2.5小时内制备。
● 可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 可以使用附带的保存溶液保存APC标签。
试剂盒内含
产品概述
藻胆蛋白是一种从蓝藻和真核藻类中得到的荧光蛋白，它的荧光强度要比化学荧光探针，如荧光素和罗丹明高得多。因此，用藻胆蛋白标记的抗体和其他分子在做流式细胞术和免疫染色时具有很高的灵敏度。别藻蓝蛋白（APC）是一种藻胆蛋白，它在660 nm附近有红色荧光。Allophycocyanin Labeling Kit-NH2能够简便快速地制备被APC标记的IgG，NH2-reactive APC（该试剂盒的成分之一）具有一个活性的酯基团，不需任何活化就能够轻易地与靶分子中的氨基形成共价键。试剂盒中的Filtration tube用来交换缓冲液和浓缩样品IgG溶液。该试剂盒中包含了标记产物的Storage buffer等用于APC标记的所需的全部试剂。
*APC: Allophycocyanin (别藻蓝蛋白)
原理
荧光特性
操作步骤
使用注意事项:
1. 用该试剂盒标记的蛋白质的分子量应当>50,000。
2. 在标记过程中，IgG或者Phycobiliprotein-IgG标记物始终在过滤管的滤膜上。
3. 如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits (不包含于本试剂盒中) 来纯化。
4. 如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
标记IgG操作步骤
（1）将100μl WS buffer以及含有100μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000 g离心10分钟后，加入100μl WS buffer再离心一次。b）
（3）离心完成后，将10μl Reaction buffer加入到NH2-reactive APC中并用移液器吹打使其溶解。
（4）将含有NH2-reactive APC的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吸取溶液吹洗净整个滤膜表面，然后将过滤管放入培养箱中，37℃培养2小时。
（6）将190μl WS buffer加入到过滤管中并用枪吹打10到15次来回收标记产物。c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100μg。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记后产物的浓度为1.4-1.8mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-2个APC分子。没有被结合的APC可能会干扰正常的免疫试验。如果需要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常，APC标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
产品优势
1）APC标记的产品可以在约2.5小时内制备。
2）可以标记分子量为50,000或更高的蛋白质。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
5）可以使用附带的保存溶液保存APC标签。
常见问题Q&A
| Q1:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000且具有活性氨基结构。参照IgG的标记操作说明，可以标记0.5-1 nmol的蛋白样品。 |
| Q2:在与IgG反应后，未标记的NH2-reactive APC是否仍含有活性酯基？ |
| A:没有。反应过程中，活性酯基完全被水解了 |
| Q3:标记小分子蛋白质（分子量50,000或以下）的方法 |
| A:由于该试剂盒中包含的过滤管是分子量截断值为30K的超滤过滤器，因此我们建议使50,000或分子量更大的蛋白质，并留有余量。
当标记分子量为50,000或更小的蛋白质时，可以通过更换为分子量分数较小的超滤过滤器来标记甚至很小的蛋白质，如下所示。 —————————————— PALL Nanocep 3K产品编号OD003C33 PALL Nanocep 10K产品编号OD010C33 —————————————— 离心所需的时间可能比试剂盒中随附的过滤器要长，因此请注意离心时间。 |
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Q4:荧光蛋白分为三种，每种的波长特征是什么？ |
| A:别藻蓝蛋白（缩写：APC）激发波长：650nm发射波长：660nm
B-藻红蛋白（缩写：B-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm R-藻红蛋白（缩写：R-PE）激发波长：564nm发射波长：575nm |
| Q5:标记反应过程中，NH2-reactive APC是否会形成一些低聚物 |
| A:不会。由于NH2-reactive APC中的所有氨基都被阻断，因此不会有低聚物生成。 |
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Q6:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
|
A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000且具有活性巯基结构或者可被还原且不会失活的二硫化物。参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品。 |
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Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
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A:不行。寡核苷酸或者寡肽可能因为分子量太小而不能存在于滤膜上。 |
| Q8:每个IgG能够标记多少个APC分子 |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个APC分子。 |
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Q9:是否必须要使用试剂盒所包含的WS Buffer？ |
| A:是的，要用WS Buffer来制备标记产物的储存液。但是，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来稀释储存液。 |
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Q10:标记产物能保存多久？ |
| A:在4℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。 |
参考文献
1) H. Shinohara, T. Yasuda, Y. Aiba, H. Sanjo, M. Hamadate, H. Watarai, H. Sakurai and T. Kurosaki, “PKCβ Regulates BCR-mediated IKK Activatioin by Facilitating the Interaction between TAK1 and CARMA1”, J. Exp. Med., 2005, 202(10), 1423.
2) E. Grace Suto, Y. Mabuchi, N. Suzuki, K. Suzuki, Y. Ogata, M. Taguchi, T. Muneta, I. Sekiya and C. Akazawa, “Prospectively isolated mesenchymal stem/stromal cells are enriched in the CD73+ population and exhibit efficacy after transplantation”, Sci. Rep.., 2017,(7), 4838.
3) H. Fujii, Y. Ikeuchi, Y. Kurata, N. Ikeda, U. Bahrudin, P. Li, Y. Nakayama, R. Endo, A. Hasegawa, K. Morikawa, J. Miake, A. Yoshida, K. Hidaka, T. Morisaki, H. Ninomiya, Y. Shirayoshi, K. Yamamoto, I. Hisatome, “Electrophysiological properties of prion-positive cardiac progenitors derived from murine embryonic stem cells”, Circ. J.., 2012,76, (12), 2875.
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特点：
● 可以在大约3个小时内制备ALP标记的产品。
● 可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 只需与SH反应性ALP混合即可形成ALP标签。
● 还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 带有ALP标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备酶免疫分析 (EIA) 所需的碱性磷酸酶标IgG以及竞争性EIA所需的碱性磷酸酶标抗原。该试剂盒中的SH-reactive ALP能够与含有SH的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂，包括还原剂和储存用缓冲液。SH-reactive ALP可以和靶分子形成共价键，还原剂能够在IgG分子上建立自由巯基。当碱性磷酸酶标IgG用于EIA时，SH-reactive ALP的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。
* ALP：Alkaline Phosphatase (碱性磷酸酶)
原理
操作步骤
使用注意事项:
1. 所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。
2. 所需标记的较小的氨基化合物的分子量要<5,000。
3. 标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
4. 如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化 (不包含于此试剂盒中)。
5. 如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。
6. 如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶SH-reactive ALP放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl Solution A以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）用移液器使溶液混合，8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将150μl Solution A加入到Reducing agent中并用移液器吹打使其溶解。
（4）将100μl步骤3所得溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养30分钟。
（6）将100μl Solution B加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟。除去滤液，加入200μl Solution B，再离心一次。b）
（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive ALP中并用移液器吹打使其溶解。
（8）将SH-reactive ALP溶液移到被还原的IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（9）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养1小时。
（10）加入150μl Storage buffee并吹打10-15次来回收标记产物。c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管，将其储存在0-5℃。d）
a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个还原后的IgG分子上被标记上2到4个碱性磷酸酶分子。没有被结合的碱性磷酸酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常碱性磷酸酶标记后的还原型IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以在-20℃下存放。但还要注意样品自身是否稳定。
标记小分子操作步骤：
（1）用Reaction buffer制备50μl，1mM的巯基化合物溶液，a）并将该溶液加入到SH-reactive ALP管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。
（2）将100μl Solution A加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
（3）在8,000-10,000g离心10分钟，b）弃滤液，向管中加入200μl Solution A。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g离心10分钟。b）
（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）如果巯基化合物在水溶液中无法溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl与45μl Reaction buffer混合。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记后产物的浓度大约为400-500μg/ml（10-12.5μM）。1-2个靶分子能够和1个碱性磷酸酶分子结合。
d）建议用Storage Buffer来回收标记产物，也可以选择其它合适的缓冲液。
产品优势
1）可以在大约3个小时内制备ALP标记的产品。
2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）只需与SH反应性ALP混合即可形成ALP标签。
5）还可以通过使用附着的还原剂*标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
7）带有ALP标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1: 能够使用这个试剂盒标记F(ab’)2吗？ |
| A:可以标记。请参照标记IgG的操作说明，回收率通常都超过80%。 |
| Q2:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
| A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000或者<5,000且具有活性巯基结构。如果分子量>50,000，参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品来标记。如果分子量<5000，参照标记小分子的操作说明。如果分子量>5,000且<50,000，请咨询我们的客户服务。Email：info@dojindo.cn 免费电话：800-988-0083 |
| Q3: 能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:可以，只要它的分子量<5,000且具有活性巯基。可以参照标记小分子的操作说明。 |
| Q4: LK13所能标记的最小的IgG的量是多少？ |
| A:最小量为50 μg。标记50 μg与200 μg之间的IgG，在灵敏度和本底上没有太大的区别。但是，在步骤8，使用SH-reactive ALP溶液时，用量缩小为原来的1/5，还是能够标记10 μg的IgG。 |
| Q5: 每个IgG能够标记多少碱性磷酸酶分子？ |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个碱性磷酸酶分子。 |
| Q6: 标记蛋白质之前是否必须先使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性巯基的小分子并且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右，则没有必要使用过滤管。只需要将样品溶液和Solution B混合，再把混合液加入到SH-reactive ALP管中即可。 |
| Q7:是否必须要使用试剂盒所包含的Storage Buffer？ |
| A:不一定要使用试剂盒所包含的Storage Buffer。可以选择任何适用于该试验的缓冲液。 |
| Q8:我的样品中含有小的不溶物，我该怎么办？ |
| A:低速离心后用上清液来标记。 |
| Q9:标记反应结束后，未标记的SH-reactive ALP是否仍然含有活性马来酰亚胺？ |
| A:不含有。几乎100%的SH-reactive ALP都被用于了IgG或者小分子的标记。 |
| Q10:Storage Buffer中是否含有动物产品或者高分子聚合物？ |
| A:Storage Buffer中不含有任何动物产品，高分子聚合物或者重金属离子。 |
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特点：
● 可以在大约3个小时内制备ALP标记的产品。
● 可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● 只需与NH2反应性ALP混合即可形成ALP标签。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● 带有ALP标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备酶免疫分析 (EIA) 所需的碱性磷酸酶标IgG以及竞争性EIA所需的碱性磷酸酶标抗原。该试剂盒中的NH2-reactive ALP能够与含有NH2的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂，包括储存用缓冲液。NH2-reactive ALP不需任何活化就可以和靶分子结合。因此，当碱性磷酸酶标IgG用于EIA时，NH2-reactive ALP的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。
*ALP：Alkaline Phosphatase (碱性磷酸酶)
备注：经过同仁化学研究所的长期稳定性考验，代码为LK12的产品在0-5℃未开封的条件下由原来可以保存半年延长至一年。
原理
操作步骤
使用注意事项:
1.所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。
2.所需标记的较小的氨基化合物的分子量要<5,000。
3.标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
4.如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化 (不包含于此试剂盒中)。
5.如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。
6.如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶NH2-reactive ALP放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl Washing buffer以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟后，加入100μl Washing buffer再离心一次。b）
（3）将10μl Reaction buffer加入到NH2-reactive ALP中并用移液器吹打使其溶解。
（4）将含有NH2-reactive ALP的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吸取溶液吹洗净整个滤膜表面，然后将过滤管放入培养箱中，37℃培养2小时。
（6）加入190μl Storage buffer 并吹打10到15次来回收标记产物。c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记后共轭物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1到3个碱性磷酸酶分子。没有被结合的碱性磷酸酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常，碱性磷酸酶标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以在-20℃下存放。但还要注意样品自身是否稳定。
标记小分子操作步骤：
（1）用Reaction buffer制备50μl，1mM的氨基化合物溶液，a）并将该溶液加入到NH2 -Reactive ALP管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。
（2）将100μl Washing Buffer加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
（3）在8,000-10,000g离心10分钟，b）弃滤液，向管中加入200μl Washing Buffer。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g离心10分钟。b）
（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。c）将此溶液转移至微型管中，并储存于0-5℃下 d）。
a）如果氨基化合物在水溶液中无法溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl与45μl Reaction buffer混合。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5 min或者适当增加转速直至膜上没有残留液体。
c）标记后产物的浓度大约为400-500μg/ml（10-12.5μM）。1-2个靶分子能够和1个碱性磷酸酶分子结合。
d）建议用Storage Buffer来回收标记产物，也可以选择其它合适的缓冲液。
产品优势
1）可以在大约3个小时内制备ALP标记的产品。
2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）只需与NH2反应性ALP混合即可形成ALP标签。
5）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
6）带有ALP标签的产品可以与随附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1: 能够使用这个试剂盒标记Fab或者Fab’吗？ |
| A:可以标记。并且回收率通常都超过80%。 |
| Q2:能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000或者<5,000且具有活性氨基结构。如果分子量>50,000，参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品用LK12来标记。如果分子量<5,000，参照标记小分子的操作说明。如果分子量>5,000且<50,000，请咨询我们的客户服务。Email：info@dojindo.cn 免费电话：800-988-0083 |
| Q3: 能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:可以，只要它的分子量<5,000且具有活性氨基。可以参照标记小分子的操作说明。 |
| Q4:LK12所能标记的最小的IgG的量是多少？ |
| A:最小量为50 μg。标记50 μg与200 μg之间的IgG，在灵敏度和本底上没有太大的区别。尽管这个试剂盒也能标记10 μg的IgG，但是本底会较高。 |
| Q5: 每个IgG能够标记多少碱性磷酸酶分子？ |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个碱性磷酸酶分子。 |
| Q6:标记反应结束后，未反应的NH2-reactive ALP是否还具有活性？ |
| A:没有了。NHS在反应过程中会完全被水解。 |
| Q7:标记反应过程中，NH2-reactive ALP是否会形成一些低聚物？ |
| A:不会。由于NH2-reactive ALP中的所有活性氨基都被阻断，因此不会有低聚物生成。 |
| Q8:是否必须要使用试剂盒所包含的Storage Buffer？ |
| A:不一定要使用试剂盒所包含的Storage Buffer。可以选择任何适用于该试验的缓冲液。但是，Storage Buffer能够提高标记产物的稳定性。 |
| Q9:Storage Buffer中是否含有动物产品或者高分子聚合物？ |
| A:Storage Buffer中不含有任何动物产品，高分子聚合物或者重金属离子。 |
参考文献
1) B. Pandey, A.V. Demchenko, K.J. Stine, “Nanoporous gold as a solid support for protein immobilization and development of an electrochemical immunoassay for prostate specific antigen and carcinoembryonic antigen”, Microchim Acta., 2012, 179, (1-2), 71.
2) M. Watanabe, I. Takemasa, N. Kaneko, Y. Yokoyama, E. Matsuo, S. Iwasa, M. Mori, N. Matsuura, M. Monden, and O. Nishimura, “Clinical significance of circulating galectins as colorectal cancer markers”, Oncol. Rep.., 2011, 25, (5), 1217.
3) Y. Matsumae, Y. Takahashi, H. Shiku and T. Matsue, “Quantitative Real‐Time Monitoring of Antibody‐Induced Internalization of Epidermal Growth Factor Receptor on Single Living Mammalian Cells Using Scanning Electrochemical Microscopy”, ChemElectroChem., 2018, 5, (20), 3096.
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特点：
● POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。
● 可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● POD标记的产品只需与NH2-反应性过氧化物酶混合即可形成。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● POD标签可以用随附的保存溶液保存。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备酶免疫分析 (EIA) 所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的NH2-reactive peroxidase具有琥珀酰亚胺基 (NHS)，它能够与含有NH2的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的所有试剂，包括储存用缓冲液。标记过程相当简单：只需将IgG和NH2-reactive peroxidase混合并且在37℃下培养2小时。NH2-reactive peroxidase不需任何活化就可以和靶分子形成共价键。NHS与辣根过氧化物酶之间的距离大约为1.2nm，为辣根过氧化物酶分子半径的一半。因此，当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时，NH2-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。由于NH2-reactive peroxidase自身的氨基已经被阻断，因此自身不会发生反应。
原理
操作步骤
使用注意事项:
1.所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。
2.所需标记的较小的氨基化合物的分子量要<5,000。
3.标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
4.如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化（不包含于此试剂盒中）。如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。
5.如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶NH2-reactive peroxidase放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl Washing buffer以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000g离心10分钟后，加入100μl Washing buffer再离心一次。b）
（3）将10μl Reaction buffer加入到NH2-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。
（4）将含有NH2-reactive peroxidase的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吸取溶液吹吸净整个滤膜表面，然后将过滤管放入培养箱中，37℃培养2小时。
（6）将100μl Washing buffer加入到过滤管中。如果滤液的体积超过300μl，在进行步骤7前需要先丢弃滤液。
（7）8,000-10,000g离心10分钟。b）
（8）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。如果在聚积过程中，滤液体积达到或超过了400μl，则需在进行下一步离心前将滤液除去。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-3个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常，辣根过氧化物酶标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
标记小分子操作步骤：
（1）用Reaction buffer制备50μl，1mM的氨基化合物，a）并将该溶液加入到NH2-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。
（2）将100μl Washing buffer加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
（3）在8,000-10,000g 离心10分钟，b）弃滤液，向管中加入200μl Washing buffer。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g 离心10分钟。b）
（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收抗体。c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）如果氨基化合物在水溶液中无法溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl 与45μl Reaction buffer混合。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度大约为400-500μg/ml (10-12.5μM)。1-2个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。
d）标记后的小分子在0-5℃下能够存放至少6个月。
产品优势
1）POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。
2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）POD标记的产品只需与NH2-反应性过氧化物酶混合即可形成。
5）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
6）POD标签可以用随附的保存溶液保存。
常见问题Q&A
| Q1: 标记反应结束后，未反应的NH2-reactive peroxdase是否还具有活性？ |
| A:没有了。它在反应过程中会完全被水解。 |
| Q2: 标记反应过程中，NH2-reactive peroxdase是否会形成一些低聚物？ |
| A:不会。由于NH2-reactive peroxdase中的所有氨基都被阻断，因此不会有低聚物生成。 |
| Q3: 是否必须要使用试剂盒所包含的Storage Buffer？ |
| A:不一定要使用试剂盒所包含的Storage Buffer。可以选择任何适用于该实验的缓冲液。但是，Storage Buffer能够提高标记产物的稳定性。 |
| Q4:Storage Buffer中是否含有动物产品或者高分子聚合物？ |
| A:Storage Buffer中不含有任何动物产品，高分子聚合物或者重金属离子。 |
| Q5: 能够使用这个试剂盒标记Fab或者Fab’吗？ |
| A:可以标记。并且回收率通常都超过80%。 |
| Q6:能够用这个试剂盒标记其它蛋白质吗？ |
| A:可以。只要标记分子的分子量>50,000或者<5,000且具有活性伯胺或仲胺结构。如果分子量>50,000，参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品用LK11-10来标记。 如果分子量<5,000，参照标记小分子的操作说明。如果分子量>5,000且<50,000，请咨询我们的客户服务。Email：info@dojindo.cn 免费电话：800-988-0083 |
| Q7:能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:可以。只要它的分子量小于5,000且具有活性伯胺或仲胺。可以参照标记小分子的操作说明。 |
| Q8:LK11所能标记的最小的IgG的量是多少？ |
| A:最小量为50 μg。标记50 μg与200 μg之间的IgG，在灵敏度和本底上没有太大的区别。尽管这个试剂盒也能标记10 μg的IgG，但是本底会较高。 |
| Q9:每个IgG能够标记多少辣根过氧化物酶分子？ |
| A:每个IgG平均能标记上1-3个辣根过氧化物酶分子。 |
参考文献
1) 広田次郎, 清水眞也, “キットを用いたモノクローナル抗体への迅速・簡便なペルオキシダーゼ標識法”, 動物衛生研究所研究報告, 2005, 111, 37.
2) A. Miyagawa-Yamaguchi, N. Kotani, and K. Honke, “Expressed Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Horseradish Peroxidase Identifies Co-Clustering Molecules in Individual Lipid Raft Domains”, PLoS ONE., 2014, 9, (3), e93054.
3) J. Zhang, D. Klufas, K. Manalo, K. Adjepong, J.O. Davidson, G. Wassink, L. Bennet, A.J. Gunn, E.G. Stopa, K. Liu, M. Nishibori, and B.S. Stonestreet, “HMGB1 Translocation After Ischemia in the Ovine Fetal Brain”, J. Neuropathol. Exp. Neurol.., 2016, 75, (6), 527.
4) M. Okumura, T. Ozawa, H. Hamana, Y. Norimatsu, R. Tsuda, E. Kobayashi, K. Shinoda, H. Taki, K. Tobe, J. Imura, E. Sugiyama, H. Kishi, and A. Muraguchi, “Autoantibodies reactive to PEP08 are clinically related with morbidity and severity of interstitial lung disease in connective tissue diseases”, Eur. J. Immunol.., 2018, 48, (10), 1717.
5) R. Sugisawa, G. Komatsu, E. Hiramoto, N. Takeda, K. Yamamura, S. Arai, and T. Miyazaki, “Independent modes of disease repair by AIM protein distinguished in AIM-felinized mice”, Sci. Rep.., 2018, 8, 13157.
6) S. Takatsuka, T. Inukai, S. Kawakubo, T. Umeyama, M. Abe, K. Ueno, Y. Hoshino, Y. Kinjo, Y. Miyazaki, and S. Yamagoe, “Identification of a Novel Variant Form of Aspergillus fumigatus CalC and Generation of Anti-CalC Monoclonal Antibodies”, Med Mycol J., 2019, 60, (1), 11.
7) T. Sasaki, K. Liu,T. Agari, T. Yasuhara, J. Morimoto, M. Okazaki, H. Takeuchi, A. Toyoshima, S. Sasada, A. Shinko, A. Kondo, M. Kameda, I. Miyazaki, M. Asanuma, CV. Borlongan, M. Nishibori, and I. Date, “Anti-high mobility group box 1 antibody exerts neuroprotection in a rat model of Parkinson’s disease”, Exp. Neurol.., 2016, 275, 220.
8) T. Tsumuraya, I. Fujii, M. Inoue, A. Tatami, K. Miyazaki, and M. Hirama, “Production of monoclonal antibodies for sandwich immunoassay detection of ciguatoxin 51-hydroxyCTX3C”, Toxicon., 2006, 48, (3), 287.
9) W. Jin, K. Yamada, M. Ikami, N. Kaji, M. Tokeshi, Y. Atsumi, M. Mizutani, A. Murai, A. Okamoto, T. Namikaw, Y. Baba, and M. Ohta, “Application of IgY to sandwich enzyme-linked immunosorbent assays, lateral flow devices, and immunopillar chips for detecting staphylococcal enterotoxins in milk and dairy products”, J. Microbiol. Methods., 2013, 92, (3), 323.
10) W.W.P.N. Weerakoon, M. Sakase, N. Kawate, M.A. Hannan, N. Kohama, and H. Tamada, “Plasma IGF-I, INSL3, testosterone, inhibin concentrations and scrotal circumferences surrounding puberty in Japanese Black beef bulls with normal and abnormal semen”, Theriogenology., 2018, 114, (1), 54.
11) Y. Watanabe, Y. Kazuki, K. Kazuki, M. Ebiki, M. Nakanishi, K. Nakamura, M. Yoshida Yamakawa,H. Hosokawa, T. Ohbayashi, M. Oshimura, and K. Nakashima, “Use of a Human Artificial Chromosome for Delivering Trophic Factors in a Rodent Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis”, Mol Ther Nucleic Acids., 2015, 4, (10), e253.
12) Y.S. Kim, D.H. Jung, I.S. Lee, B.J. Pyun and J.S. Kim, “Osteomeles schwerinae extracts inhibits the binding to receptors of advanced glycation end products and TGF-β1 expression in mesangial cells under diabetic conditions”, Phytomedicine., 2016, 23, (4), 388.
13) S .Kon, M. Honda, K. Ishikawa, M. Maeda and T. Segawa, “Antibodies against nephronectin ameliorate anti-type II collagen-induced arthritis in mice.’, FEBS Open Bio., 2019,10.1002/2211-5463.12758.
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特点：
● POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。
● 可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
● 可以标记50至200μg的蛋白质。
● POD标记的产品只需与SH反应过氧化物酶混合即可形成。
● 还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
● 可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
● POD标签可与随附的存储溶液一起存储。
试剂盒内含
产品概述
该试剂盒主要用于制备酶免疫分析（EIA）所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的SH-reactive peroxidase能够与含有巯基的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂，包括还原剂和储存用缓冲液。SH-reactive peroxidase可以和靶分子形成共价键，还原剂能够在IgG分子上建立自由巯基。当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时，SH-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。
原理
操作步骤
使用注意事项:
1.所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。
2.所需标记的较小的巯基化合物的分子量要<5,000。
3.标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。
4.如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化（不包含于此试剂盒中）。
5.如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。
6.如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶SH -reactive peroxidase放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤：
（1）将100μl Solution A以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）用移液器使溶液混合，8,000-10,000g离心10分钟。b）
（3）将150μl Solution A加入到Reducing agent中并用移液器吹打使其溶解。
（4）将100μl步骤3所得溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（5）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养30分钟。
（6）将100μl Solution B加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟。除去滤液，加入200μl Solution B，再离心一次。b）
（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。
（8）将SH-reactive peroxidase溶液移到被还原的IgG所集中的过滤管的滤膜上。
（9）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养1小时。
（10）将100μl Solution A加入到试管中，8,000-10,000g离心10分钟。b）
（11）加入200μl Storage buffer并吹打10-15次来回收标记产物。c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管，并储存于0-5℃。
a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。如果在聚积过程中，滤液体积超过了400μl，则需在进行下一步离心前将滤液除去。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个还原后的IgG分子上会被标记 上1到2个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。
d）通常辣根过氧化物酶标记后的还原型IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。另外，还要注意样品自身是否稳定。
标记小分子操作步骤：
（1）用Reaction buffer制备50μl，1 mM的巯基化合物溶液，a）并将该溶液加入到SH-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。
（2）将100μl Solution A加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。
（3）在8,000-10,000g离心10分钟，b）弃滤液，向管中加入200μl Solution A。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g离心10分钟。b）
（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10-15次来回收抗体。c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。d）
a）如果巯基化合物无法在水溶液中溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl 与45μl Reaction buffer混合。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）标记产物的浓度大约为400-500μg/ml（10-12.5μM）。1到2个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。
d）标记后的小分子在0-5℃下能够存放至少6个月。
产品优势
1）POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。
2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。
3）可以标记50至200μg的蛋白质。
4）POD标记的产品只需与SH反应过氧化物酶混合即可形成。
5）还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。
6）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。
7）POD标签可与随附的存储溶液一起存储。
常见问题Q&A
| Q1: 能够使用这个试剂盒标记F(ab’)2吗？ |
| A:可以标记。请参照标记IgG的操作说明，回收率通常都超过80%。 |
| Q2: 能够用这个试剂盒标记其他蛋白质或者多肽吗？ |
| A:可以，只要标记分子的还原型分子量>50,000或者<5,000且具有活性巯基结构。如果分子量.>50,000，参照IgG的标记操作说明，使用0.5-1 nmol蛋白样品用 LK09-10来标记。如果分子量<5,000，参照标记小分子的操作说明。如果分子量>5,000且<50,000，请咨询我们的客户服务。Email：info@dojindo.cn 免费电话 ：800-988-0083 |
| Q3: 能够使用这个试剂盒标记寡核苷酸或者寡肽吗？ |
| A:可以，只要它的分子量小于5,000且具有活性巯基。可以参照标记小分子的操作说明。 |
| Q4:LK09所能标记的最小的IgG的量是多少？ |
| A:最小量为50 μg。标记50 μg与200 μg之间的IgG，在灵敏度和本底上没有太大的区别。但是，在步骤8，使用SH-reactive peroxidase溶液时，用量缩小为原来的1/5，也能够标记10 μg的IgG。 |
| Q5: 每个IgG能够标记多少辣根过氧化物酶分子？ |
| A:每个IgG平均能标记上1-2个辣根过氧化物酶分子。 |
| Q6:标记蛋白质之前是否必须先使用过滤管？ |
| A:如果蛋白溶液中不含有带有活性巯基的小分子并且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右，则没有必要使用过滤管。只需要将样品溶液和Solution B混合，再把混合液加入到SH-reactive peroxidase管中即可。 |
| Q7:是否必须要使用试剂盒所包含的Storage Buffer？ |
| A:不一定要使用试剂盒所包含的Storage Buffer。可以选择任何适用于该试验的缓冲液。但是，Storage Buffer能够提高标记产物的稳定性。 |
| Q8:我的样品中含有小的不溶物，我该怎么办？ |
| A:低速离心后用上清液来标记。 |
| Q9:标记反应结束后，未标记的SH-reactive peroxidase是否仍然含有活性马来酰亚胺？ |
| A:不含有。几乎100%的SH-reactive peroxidase都被用于了IgG或者小分子的标记。 |
| Q10:Storage Buffer中是否含有动物产品或者高分子聚合物？ |
| A:Storage Buffer中不含有任何动物产品，高分子聚合物或者重金属离子。 |
参考文献
| 1) 広田次郎, 清水眞也, “キットを用いたモノクローナル抗体への迅速・簡便なペルオキシダーゼ標識法”, 動物衛生研究所研究報告, 2005, 111, 37. |
| 2) K. Inoue, A. Sugiyama, P. C. Reid, Y. Ito, K. Miyauchi, S. Mukai, M. Sagara, K. Miyamoto, H. Satoh, I. Kohno, T. Kurata, H. Ota, A. Mantovani, T. Hamakubo, H. Daida and T. Kodama, “Establishment of a High Sensitivity Plasma Assay for Human Pentraxin3 as a Marker for Unstable Angina Pectoris”, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2007, 27, 161. |
| 3) N. Esaki, Y. Ohkawa, N. Hashimoto, Y. Tsuda, Y. Ohmi, R. H. Bhuiyan, N. Kotani, K. Honke, A. Enomoto, M. Takahashi, K. Furukawa, and K. Furukawa, “ASC amino acid transporter 2, defined by enzyme-mediated activation of radical sources, enhances malignancy of GD2-positive small-cell lung cancer.”, Cancer Sci.., 2018, 109, (1), 141. |
| 4) G.W.Zhanga, S.J.Lai, Y.Yoshimura, and N.Isobe, “Messenger RNA expression and immunolocalization of psoriasin in the goat mammary gland and its milk concentration after an intramammary infusion of lipopolysaccharide”, Vet. J.., 2014, 202, (1), 89. |
| 5) G-W. Zhang, S-J. Lai, Y. Yoshimura, and N. Isobe, “Expression of cathelicidins mRNA in the goat mammary gland and effect of the intramammary infusion of lipopolysaccharide on milk cathelicidin-2 concentration”, Vet. Microbiol.., 2014, 170, (1-2), 125. |
| 6) H. Tateno, S. Saito, K. Hiemori, K. Kiyoi, K. Hasehira, M. Toyoda, Y. Onuma, Y. Ito, H. Akutsu, and J. Hirabayashi, “α2–6 sialylation is a marker of the differentiation potential of human mesenchymal stem cells”, Glycobiology., 2016, 26, (12), 1328. |
| 7) K. Iizumi, H. Kawasaki, A. Shigenaga, M. Tominaga, A. Otsu, A. Kamo, Y. Kamata, K. Takamori, and F. Yamakura, “Tryptophan nitration of immunoglobulin light chain as a new possible biomarker for atopic dermatitis”, J Clin Biochem Nutr., 2018, 63, (3), 197. |
| 8) K. Morioka, K. Fukai, K. Yoshida, R. Yamazoe, H. Onozato, S. Ohashi, T. Tsuda, and K. Sakamoto, “Foot-and-Mouth Disease Virus Antigen Detection Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Multiserotype-Reactive Monoclonal Antibodies”, J. Clin. Microbiol.., 2009, 47, (11), 3663. |
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