Wako实验动物生化检测LabAssay系列试剂盒（二）

　　使用LabAssay™ 系列细胞生物学用定量检测试剂盒，只需少量样品就可进行检测，并且一次可进行多个样品的测定。

　　目前LabAssay™ 系列有白蛋白与球蛋白比值检测试剂盒、肌氨酸酐定量检测试剂盒、葡萄糖定量检测试剂盒、游离脂肪酸定量检测试剂盒、磷脂定量检测试剂盒、甘油三酯定量检测试剂盒、碱性磷酸酶定量检测试剂盒、胆固醇定量检测试剂盒、尿酸定量检测试剂盒共9种试剂盒可供选择。

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【LabAssay™ ALP（碱性磷酸酶定量检测试剂盒）详细资料】

别名：Alkaline Phosphatase Assay Kit

摘要

　　碱性磷酸酶的活性检测试剂盒。常用于检测培养的成骨细胞、实验动物血清和骨组织中的碱性磷酸酶活性。

　　碱性磷酸酶(ALP)广泛分布于肝脏、骨、小肠之中。特别在骨代谢研究领域方面被用作为骨形成指标之一。本品是用p–硝基苯磷酸作为底物的碱性磷酸酶检测试剂盒，利用微孔板，可进行多种样品的检测。

【检测原理】 

　　样品在含有p-硝基苯磷酸的碳酸盐缓冲液(pH9.8)中反应，在样品中的碱性磷酸酶作用下，p-硝基苯磷酸分解为p-硝基酚和磷酸。生成的p-硝基酚为碱性，呈黄色。根据测量其405nm的吸光值，计算出样品中碱性磷酸酶的活性。

■LabAssay™ ALP [p-硝基苯磷酸基质法]

【性能】
・检测范围：>0.06 mmol/L
・标准曲线范围：0～0.5 mmol/L
・再现性：C.V.<10%

【试剂盒组成】
・底物———————20片（溶解时：p-硝基苯磷酸二钠  6.7mmol/L)
・底物溶解液——-100mL×1瓶（2.0mmol/L氯化镁含有0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH9.8)
・反应终止液——-100mL×1瓶（0.2mol/L氢氧化钠溶液）
・标准液—————10mL×1瓶（0.5mmol/L  p-硝基酚溶液）

【试剂的配制】

1）底物缓冲液：1片底物溶解于5mL底物溶解液中。

2）反应终止液：直接使用。

3）系列稀释标准液：将标准液用蒸馏水依次稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L等2倍率稀释液系列。

【标准操作法】

　　向96孔微孔板内添加100μL底物缓冲液和20μl样品，在微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，37℃孵育15分钟。

　　　添加80μL反应终止液，在微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，用酶标仪测量405nm处的吸光值。同样方法进行空白(蒸馏水)对照和标准品的检测。

【活性单位的定义】
　　在pH9.8，37℃情况下，1分钟内生成1nmol p-硝基酚所需的酶的活性为1个活力单位（U）。

活性（U/μl）= C/15 ×a　
　C：由标准曲线得到的OD值(A实验值减去A空白值)，计算p-硝基酚浓度(mmol/L=nmol/μl)       15：反应时间(min.)
　a：样品的稀释倍数

当样品为成骨细胞时，本试剂盒使用前需要预处理

・在48孔板上进行细胞培养后，除去培养基，用PBS冲洗感光板，各孔添加150μL 0.05%的曲拉通X，进行冻结→融化→冻结→融化操作。4℃，15,000rpm离心15分钟处理，将上清液移到新的辅助管，以此作为样品。

(注1）48孔板：培养时，一般不采用96孔板，多使用48孔板。

(注2) 曲拉通X的作用：溶解细胞膜，回收蛋白(细胞内含有ALP蛋白)的试剂。

(注3) 反复的冻结融化：原理不明，但这样做似乎可以提高ALP活性。

(注4) 也有不使用曲拉通X，用超声波降解法(超声波处理)对细胞造成物理性休克得到溶解产物的方法。

(注5) 曲拉通X的添加量：以150μL为例，孔中细胞约为20,000cell。

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【LabAssay™ Cholestero（胆固醇定量检测试剂盒）详细资料】

摘要

　　胆固醇是生物细胞膜的主要成分，是众多动物合成甾族化合物的前体物质。

　　本品是利用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠(DAOS)，通过酶浅蓝色显色反应，检测血清等样品中胆固醇量的试剂盒。与微孔板配套使用，可进行多样品检测。

【检测原理】

　　样品中的胆固醇酯类在胆固醇酯酶作用下，被分解为游离胆固醇和脂肪酸。在这里生成的游离胆固醇与既存的游离胆固醇类一起被胆固醇氧化酶氧化，产生过氧化氢。生成的过氧化氢，在过氧化物酶作用下，与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠(DAOS) 及4-氨基安替比林定量氧化缩合，产生浅蓝色色素。测量这个浅蓝色色素的吸光值，即可计算出样品中的胆固醇浓度。

■LabAssay™ 胆固醇[胆固醇氧化酶、DAOS法]

胆固醇是动脉硬化等血管疾病的致病原因之一。

【试剂盒组成】

・缓冲液—————————–150mL×2瓶(MES缓冲液)
・显色剂———————-150mL用×2瓶

(溶解时：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，DAOS，4-氨基安替比林，抗坏血酸氧化酶)
・标准液—————————10mL用×1瓶

【性能】
・灵敏度
蒸馏水作为样品时，吸光值在0.11以下。

特定浓度的标准液(200mg/dl) 作为样品时，吸光值为0.13～0.65。
・特异性
可检测1,000mg/dl的总胆固醇浓度。

【检测波长】
主波长：600nm, 副波长：700nm

【试剂的配制】
■显色剂：将1瓶显色剂(150mL用)溶解于1瓶缓冲液(150mL)中。

配制后，以2～10℃保存，可保存3星期。

【标准操作法】

向微孔板内添加2μL样品和300μL显色剂，充分混合，在37℃孵育5分钟。以此作为对照空白值，测量样品及标准液的吸光值。

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Wako实验动物生化检测LabAssay系列试剂盒（一）

　　使用LabAssay™ 系列细胞生物学用定量检测试剂盒，只需少量样品就可进行检测，并且一次可进行多个样品的测定。

　　目前LabAssay™ 系列有白蛋白与球蛋白比值检测试剂盒、肌氨酸酐定量检测试剂盒、葡萄糖定量检测试剂盒、游离脂肪酸定量检测试剂盒、磷脂定量检测试剂盒、甘油三酯定量检测试剂盒、碱性磷酸酶定量检测试剂盒、胆固醇定量检测试剂盒、尿酸定量检测试剂盒共9种试剂盒可供选择。

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【LabAssay™ Creatinine（肌氨酸酐定量检测试剂盒）详细资料】

肌氨酸酐是肌肉中肌酸与ATP发生反应后所生成的代谢产物。

肌氨酸酐大部分在肾脏循环时被过滤，不再被吸收而被排出体外。肾功能障碍和肌肉中能量代谢变化时，样品中肌氨酸酐的量发生变化。

【检测原理】

向样品中加入除蛋白剂，离心分离，回收上清。上清中加入苦味酸及氢氧化钠溶液，在碱性条件下，肌氨酸酐和苦味酸发生缩合，产生橙红色的缩合物。测量这个橙红色缩合物的吸光值，计算样品中的肌氨酸酐浓度。

■LabAssay™ 肌氨酸酐[Jaffe′法]研究试剂

肌氨酸酐是由存在于肌肉、神经内的磷酸肌酸直接产生，或由肌酸脱水产生，经肾毛细血管球过滤后被排除体外的代谢产物。利用Jaffe法，在碱性条件下，通过检测苦味酸与肌氨酸酐反应生成的橙红色色素检测样品中肌氨酸酐含量。

【特点】
・蒸馏水作为样品时，吸光值为0.010～0.020。
・使用已知浓度的血清进行检测时，在已知浓度的±10%以内。

【试剂盒组成】
・除蛋白剂…150mL×1瓶
・苦味酸…50mL×1瓶
・0.75mol/L 氢氧化钠溶液…50mL×1瓶
・标准液 (肌氨酸酐10mg/dl)…15mL×1瓶

【试剂的制备】
●除蛋白剂・苦味酸・0.75mol/L 氢氧化钠溶液:全部都可以直接使用
●标准液: 附带的标准液可直接使用，或稀释后作为系列标准液。

【标准操作法】
将300μL除蛋白剂和50μL样品在样品管中混合，室温放置10分钟，离心分离(2,500rpm以上反应10分钟)，回收上清。

向酶标板的孔中加入100μL上清，再加入50μL苦味酸和50μL 0.75mol/L氢氧化钠溶液，在25～30℃反应20分钟。

作为空白对照，检测样品及标准液的吸光值。

【检测波长】 520nm 

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【LabAssay™ NEFA（游离脂肪酸定量检测试剂盒）详细资料】

摘要：

游离脂肪酸(NEFA)是脂肪细胞中的中性脂肪被分解后由血中被释放出来的物质，在血清中与白蛋白结合，被末梢组织搬运，成为末梢组织重要的能源来源。

检测游离脂肪酸的量，可用于调节由脂肪组织释放到肝脏的物质，有利于掌握类脂化合物代谢的动态。

【检测原理】 

样品中的游离脂肪酸(NEFA)在辅酶A与(CoA)腺嘌呤核苷-5'-三磷酸二钠(ATP)的存在下，受酰基-CoA合成酶(ACS)作用，生成酰基-CoA、AMP及焦磷酸(PPi)。生成的酰基-CoA在酰基-CoA氧化酶(ACOD)的作用下被氧化，同时生成2,3-反式-烯酰-CoA及过氧化氢。生成的过氧化氢在过氧化物酶(POD)的作用下，与3-甲基-N-乙基-N- (β-羟乙基甲基)-苯胺(MEHA)及4-氨基安替比林发生定量性氧化缩合，生成青紫色色素。测量这个青紫色色素吸光值，即可计算出样品中的NEFA浓度。

【特点】
・以实验动物为对象的生物化学检测试剂
・用微孔板检测，可用少量样品一次检测多个样品

※本品为研究试剂，不可用于诊断。

■LabAssay™ NEFA [ACS・ACOD法] 研究试剂

在血中游离脂肪酸(NEFA:Non-Esterified Fatty Acid)，与白蛋白结合，被末梢组织搬运，成为末梢组织重要的能源来源。游离脂肪酸的浓度，可用于调节由脂肪组织释放到肝脏的物质，在末梢组织中的消耗。

本品可根据测量氧化缩合生成的青紫色色素的吸光值，检测样品中游离脂肪酸的量。

【特点】
・蒸馏水作为样品时，吸光值在0.07以下。
・检测已知浓度血清样品时，浓度为已知浓度±15%以内。

【检测波长】波长:550nm

【试剂盒组成】
・显色剂A…10mL用×6瓶 ,
・显色剂A溶解液…65mL×1瓶 ,
・显色剂B…20mL用×6瓶,
・显色剂B溶解液 …130mL×1瓶,
・标准液(油酸 1mEq/L)…10mL×1瓶

使用方法

【试剂的配制】
●显色试剂A:
1瓶显色剂A(10mL用)溶解于10mL显色剂A溶解液中，得到显色试剂A。
●显色试剂B:
1瓶显色剂B(20mL用) 溶解于20mL显色剂B溶解液中，得到显色试剂B。
●标准液:
附带的标准液可直接使用，也可经稀释作为标准系列使用。

【标准操作法】

向微孔板内添加4μL样品和80μL显色试剂A，充分混合，在37℃加热10分钟。加入160μL显色试剂B，在37℃加热10分钟。以此作为对照空白值，测量样品及标准液的吸光值。

【检测波长】
550nm (进行双波长检测时，主波长为546nm,副波长为660nm)