该试剂盒主要用于制备酶免疫分析 (EIA) 所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的NH₂-reactive peroxidase具有琥珀酰亚胺基 (NHS)，它能够与含有NH₂的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的所有试剂，包括储存用缓冲液。标记过程相当简单：只需将IgG和NH₂-reactive peroxidase混合并且在37℃下培养2小时。NH₂-reactive peroxidase不需任何活化就可以和靶分子形成共价键。NHS与辣根过氧化物酶之间的距离大约为1.2nm，为辣根过氧化物酶分子半径的一半。因此，当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时，NH₂-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。由于NH₂-reactive peroxidase自身的氨基已经被阻断，因此自身不会发生反应。

使用注意事项:

1.所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。

2.所需标记的较小的氨基化合物的分子量要<5,000。

3.标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。

4.如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化（不包含于此试剂盒中）。如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。

5.如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶NH₂-reactive peroxidase放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤：

（1）将100μl Washing buffer以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。^a）

（2）8,000-10,000g离心10分钟后，加入100μl Washing buffer再离心一次。^b）

（3）将10μl Reaction buffer加入到NH₂-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。

（4）将含有NH₂-reactive peroxidase的溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。

（5）用移液器吸取溶液吹吸净整个滤膜表面，然后将过滤管放入培养箱中，37℃培养2小时。

（6）将100μl Washing buffer加入到过滤管中。如果滤液的体积超过300μl，在进行步骤7前需要先丢弃滤液。

（7）8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（8）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收标记产物。^c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。^d）

a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。如果在聚积过程中，滤液体积达到或超过了400μl，则需在进行下一步离心前将滤液除去。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个IgG分子上会被标记上1-3个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。

d）通常，辣根过氧化物酶标记后的IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。

标记小分子操作步骤：

（1）用Reaction buffer制备50μl，1mM的氨基化合物，^a）并将该溶液加入到NH₂-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。

（2）将100μl Washing buffer加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。

（3）在8,000-10,000g 离心10分钟，^b）弃滤液，向管中加入200μl Washing buffer。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g 离心10分钟。^b）

（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10到15次来回收抗体。^c）将溶液转移至0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。^d）

a）如果氨基化合物在水溶液中无法溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl 与45μl Reaction buffer混合。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记产物的浓度大约为400-500μg/ml (10-12.5μM)。1-2个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。

d）标记后的小分子在0-5℃下能够存放至少6个月。

1）POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。

2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）POD标记的产品只需与NH₂-反应性过氧化物酶混合即可形成。

5）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

6）POD标签可以用随附的保存溶液保存。

1) 広田次郎, 清水眞也, “キットを用いたモノクローナル抗体への迅速・簡便なペルオキシダーゼ標識法”, 動物衛生研究所研究報告, 2005, 111, 37.

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8) T. Tsumuraya, I. Fujii, M. Inoue, A. Tatami, K. Miyazaki, and M. Hirama, “Production of monoclonal antibodies for sandwich immunoassay detection of ciguatoxin 51-hydroxyCTX3C”, Toxicon., 2006, 48, (3), 287.

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该试剂盒主要用于制备酶免疫分析（EIA）所需的辣根过氧化物酶标IgG以及竞争性EIA所需的辣根过氧化物酶标抗原。该试剂盒中的SH-reactive peroxidase能够与含有巯基的蛋白质或者其他分子反应。该试剂盒包含了标记过程中所需的全部试剂，包括还原剂和储存用缓冲液。SH-reactive peroxidase可以和靶分子形成共价键，还原剂能够在IgG分子上建立自由巯基。当辣根过氧化物酶标IgG用于EIA时，SH-reactive peroxidase的高效性足以使它在标记后省去纯化的过程。即使在标记后需要有一个高纯度的精制过程，也只要用亲和柱或凝胶渗透柱就能简单达到目的。在标记小分子的时候，使用试剂盒中包含的过滤管即可除去分子量较大的分子。

使用注意事项:

1.所需标记的较大的蛋白质的分子量要>50,000。

2.所需标记的较小的巯基化合物的分子量要<5,000。

3.标记过程中，标记前后的IgG总是在过滤管的滤膜上。

4.如果IgG溶液含有其它分子量超过10,000的蛋白质，如BSA或凝胶，在使用该试剂盒标记前请先纯化IgG溶液。IgG溶液能够使用IgG纯化试剂盒来纯化（不包含于此试剂盒中）。

5.如果IgG溶液中含有小的不溶物，离心后提取上清液来标记。

6.如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的酶SH -reactive peroxidase放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持酶的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。

标记IgG操作步骤：

（1）将100μl Solution A以及含有50-200μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。^a）

（2）用移液器使溶液混合，8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（3）将150μl Solution A加入到Reducing agent中并用移液器吹打使其溶解。

（4）将100μl步骤3所得溶液转移到IgG所集中的过滤管的滤膜上。

（5）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养30分钟。

（6）将100μl Solution B加入到过滤管中，8,000-10,000g离心10分钟。除去滤液，加入200μl Solution B，再离心一次。^b）

（7）将50μl Reaction buffer加入到SH-reactive peroxidase中并用移液器吹打使其溶解。

（8）将SH-reactive peroxidase溶液移到被还原的IgG所集中的过滤管的滤膜上。

（9）用移液器吹打数次，然后在37℃下培养1小时。

（10）将100μl Solution A加入到试管中，8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（11）加入200μl Storage buffer并吹打10-15次来回收标记产物。^c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管，并储存于0-5℃。

a）推荐的IgG的量为100μg，样品溶液的体积不应超过100μl。如果抗体浓度低于0.5mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到50-200μg。如果在聚积过程中，滤液体积超过了400μl，则需在进行下一步离心前将滤液除去。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记产物的浓度为0.5-1.3mg/ml。在进行后续的酶免疫，免疫印迹，免疫转染试验前先要将标记后的IgG稀释至适当的浓度。每个还原后的IgG分子上会被标记 上1到2个辣根过氧化物酶分子。没有被结合的辣根过氧化物酶不会干扰正常的免疫试验。如果一定要纯化的话，可以使用凝胶渗透柱或亲合柱。

d）通常辣根过氧化物酶标记后的还原型IgG在Storage buffer中，0-5℃下至少能够保存2个月，如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇（终浓度：50%），并在-20℃下存放。另外，还要注意样品自身是否稳定。

标记小分子操作步骤：

（1）用Reaction buffer制备50μl，1 mM的巯基化合物溶液，^a）并将该溶液加入到SH-reactive peroxidase管中。吹打数次使其充分混合，然后置于37℃下培养1小时。

（2）将100μl Solution A加入到反应液中并将整个溶液全部移入过滤管中。

（3）在8,000-10,000g离心10分钟，^b）弃滤液，向管中加入200μl Solution A。再重复该过程一次，然后再在8,000-10,000g离心10分钟。^b）

（4）加入200μl Storage buffer并用移液器吹打10-15次来回收抗体。^c）将此溶液转移至一支0.5ml的试管中，并储存于0-5℃下。^d）

a）如果巯基化合物无法在水溶液中溶解，可以用DMSO使其溶解，制备成10mM的溶液，取5μl 与45μl Reaction buffer混合。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）标记产物的浓度大约为400-500μg/ml（10-12.5μM）。1到2个靶分子能够和1个辣根过氧化物酶分子结合。

d）标记后的小分子在0-5℃下能够存放至少6个月。

1）POD标记的产品可以在大约3个小时内制备。

2）可以标记高分子量化合物（MW> 50,000）和低分子量化合物（MW <5,000）。

3）可以标记50至200μg的蛋白质。

4）POD标记的产品只需与SH反应过氧化物酶混合即可形成。

5）还可以通过使用附着的还原剂标记不具有游离SH基团的蛋白质。

6）可以通过使用过滤管的分离操作以高回收率获得标记物质。

7）POD标签可与随附的存储溶液一起存储。