激酶分析筛选试剂盒

Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit 是富士胶片和光与日本东京大学新药研究机构共同研发的 ADP 荧光检测试剂盒。拥有高通量筛选（HTS）所必须的高灵敏度、高准确度、低成本、简便等特性。本产品不仅可检测激酶，同时可用于检测产生 ADP 的酶（如 ATP 酶、乙酰基— CoA 羧化酶）的活性。

◆原理

本试剂盒通过酶偶联反应简单、高灵敏度的定量检测 ADP 。通过激酶反应产生的 ADP 用红色荧光物质试卤灵定量。

◆优点、特色

●   适合终点（endpoint）和实时实验

●   优异的 Z'-factor 数据（数据差异小）

●   高灵敏度检测 ADP 量

●   检测直到 ADP 30 μmol/L 仍可保持线性关系

●   一步反应，检测时间短（~30分钟）

●   成本较低

与传统方法（发光）比较

试剂名称	Fluorospark® Kinase	传统发光法（Ａ公司）
原理	ADP 定量（荧光）   （直接定量生成的 ADP）	ADP 定量（发光）   （需要把生成的 ADP 变换成 ATP 再定量）
操作顺序	１步	２步
所需时间	30 分钟	70~100 分钟
ADP 定量范围	~30 μmol/L	~1 mmol/L
价格	低成本	高成本
优点	Z'-factor 数值高   适合实时、终点反应	动态范围大   S/B 比高

 

◆试剂盒组成

No. 试剂	用途	1,000次
底物液	2×制备检测液	9 mL
酶液		500 μL
刃天青液		100 μL
还原封闭剂		400 μL
D 终止液	停止偶联反应	10 mL
10 mmol/L ATP 溶液	激酶反应，制作标准曲线	100 μL
10 mmol/L ADP 溶液	制作标准曲线	100 μL

◆案例、应用

【实验流程（终点（endpoint）法）】

　　激酶反应液里添加等量的2×检测液（使用时制备）即可检测激酶活性

【制作 ADP 标准曲线】

用 0、10、20、30 μmol/L ADP 制作标准曲线。

　　

良好的线性关系可定量最多至 30 μmol/L 的 ADP。

【低浓度 ADP 区域里定量】

制作各 ATP/ADP 浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L）里底物变换率 0-10% 标准曲线

　　

ATP/ADP标准曲线里底物变换率低（=ADP浓度低）时线性关系依然较好

 

【荧光信号的稳定性】

20 μmol/L ADP 和 2x检测液混合，在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为100%，相关变动表格如下。

　　ADP和2×检测液混合后，在30分~7小时内的荧光信号十分稳定。

【数据：Z'-factor 实测值】

定量与各 ATP/ADP 浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L），5%底物变换率相当的 ADP 时，本试剂盒方法与传统发光法的 Z'-factor 比较。

　　Z'-factor：Fluorospark^® Kinase >传统发光法（Ａ公司）

　　在各ATP浓度里，5%低底物变换率也有优异的 Z'-factor。

什么是 Z'-facotr
　　

Z'-facotr 是一个关于信号区间和变异的组合，它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用 Z'-factor = 1 – (3×SDH + 3×SDL)/(AvH-AvL) 公式计算（SDH 和 SDL 为阳性对照和阴性对照的方差，AVH 和 AVL 为阳性对照和阴性对照的平均值）。

Z-factor	Interpretation
1.0	理想情况下等于 1.0。Z factor 永远不可能超过 1.0。
0.5 – 1.0之间	较好的实验。
0 – 0.5 之间	临界的实验（较差的实验）。
小于0	阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。

【制作抑制曲线】

　　

制作 cAMP- 依赖性蛋白激酶（PKA）抑制剂 H-89 的抑制曲线

　　（PKA 0.02 U/μL，ATP 5 μmol/L，Kemptide 125 μg/mL 及各浓度的 H-89）

　　Fluorospark^® Kinase 与传统发光法（Ａ公司）有几乎相同的 IC₅₀ 值。

　　（本方法得到的 H-89 IC₅₀值与文献值*（IC₅₀=40nmol/L）几乎相同）

　　* Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).

【实验流程（实时法）】

　　

通过实时检测荧光强度，实时检测激酶活性。

【ADP 定量反应时间的比较（实时检测）】

　　

对各浓度 ADP［ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）］进行实时检测。

　　Fluorospark^® Kinase 在约十分钟内完成 ADP 定量反应。背景（ADP=0 μmol/L）信号稳定。

【实时检测添加 DTT 的影响】

　　

ADP=2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）里添加还原剂 DTT（0.1、1 mmol/L），进行实时检测。

　　Fluorospark^® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高，结果依然稳定。

【通过实时检测计算 PKA 的 Km（ATP）值】

　　

在各种 ATP 浓度下通过实时检测计算出 PKA 反应速度，并求取 ATP 的 PKA（Km 值）。

　　（PKa 0.02 U，各浓度的 ATP 及 Kemptide 100 μg/mL）

　　根据实时检测进行酶的动力学分析。

　　（本方法得到的 Km 值与文献值**（3~15 μmol/L）几乎相同）

　　** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).

相关资料

Fluorospark® Kinase　ADP Multi-Assay Kit.pdf

说明书.pdf

＜Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit　参考资料＞
1)　Kumagai, K. et al.: Anal. Biochem., 447, 146-155 (2014).
2)　东京大学新药研究机构网址 http://www.ddi.u-tokyo.ac.jp/