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特点：
● 检测结果的重现性好
● 可作为线粒体活性的指标
● 多角度了解细胞代谢变化
规格性状
| 100 tests | ・Fluorescent Dye ・α-KG Standard ・Enzyme Mix ・Coenzyme ・Assay Buffer ・lysis Solution ・Control Buffer ・ALT Solution ・Reaction Buffer |
×1 300 μl×1 ×1 ×1 6.5 ml×1 2 ml×1 25 ml×1 35 μl×1 5 ml×1 |
产品概述
α-酮戊二酸(α-KG)是TCA循环中重要的中间体。它被作为进入TCA循环的葡萄糖代谢物增加的指标以及谷氨酰胺代谢(Glutaminolysis,一种谷氨酰胺底物与α-KG反应的通路)增加的指标。α-KG在神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的产生中起着重要作用，不仅如此它还担负着一定的清除细胞内的活性氧的功能，是非常重要的细胞代谢指标之一。
检测原理
α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric可以定量检测α-酮戊二酸(α-KG)。通过检测反应生成的试卤灵(Resorufin)的荧光(Ex：530 – 560 nm、Em：580 – 600 nm)对细胞内的α-KG进行定量。另外，本试剂盒还可以通过使用96孔板进行多样品检测。
检测操作
整个操作过程，从细胞的前处理到荧光酶标仪检测，只需要按照操作说明书的步骤添加试剂即可检测细胞内α-酮戊二酸(α-KG)的浓度。而且，本试剂盒专门针对同类型检测方法中普遍存在的结果重现性差的问题进行了优化，即使是第一次做α-KG检测实验的科研人员也可以放心使用。
► 结果重现性高的两个秘诀
1) 样品的前处理
同类型的检测试剂盒在样品前处理时需要微量的pH调节、过滤膜过滤等操作，这是导致结果重现性差的原因之一。而同仁化学研究所的α-KG检测试剂盒，只需要按照说明书添加试剂，可以大幅减少前处理过程中产生的操作误差。
2) α-Ketoglutarate的检测
其他检测试剂盒使用与上图相同的原理，但是由于①和②的两步反应同时在96孔板里进行，这是造成误差的另一个重要原因。而同仁化学研究所的试剂盒将这两步反应分开进行，进一步降低了误差。
标准曲线的作成例
本试剂盒附带α-KG的标准品，可以通过制作标准曲线来定量的检测样品中的α-KG浓度。如果样品中的α-KG浓度高于20 μmol/l，请预先稀释样品再检测。
实验例
Doxorubicin(DOX)刺激引起的细胞内代谢变化
阿霉素(Doxorubicin, DOX)可以作用于 细胞周期的G2/M期，停止细胞的增殖并且细胞衰老，利用DOX作用于A549细胞，会导致胞内α-KG浓度增加。另外通过SG 03 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal检测细胞衰老、C548 Cell Cycle Assay Solution Deep Red / C549 Cell Cycle Assay Solution Blue检测细胞周期、MT09 JC-1 MitoMP Detection Kit检测线粒体膜电位的结果如下：
Sulfasalazine(SSZ)引起的细胞内代谢变化
Sulfasalazine(SSZ)可以抑制细胞的胱氨酸/谷氨酸转运体(xCT)。用SSZ刺激A549细胞后，细胞内的α-KG、ATP、GSH、细胞放出的谷氨酸等变化用下列方法进行了检测。结果发现，SSZ刺激后细胞内的ATP、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸的放出量均减少，而细胞内的α-KG和ROS水平增加。
<使用产品>
・细胞内ATP：CK18 Cell Counting Kit-Luminescence
・细胞内GSH：G263 GSSG/GSH Quantification Kit II
・细胞内ROS：R252 ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-
・胞外谷氨酸：G269 Glutamate Assay Kit-WST
<实验条件>
细胞：A549细胞(1 x 106 cells) 暴露时间： 48 h
参考文献) Shogo Okazaki et al., “Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma”. Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.
NASH诱导小鼠的肝脏组织的代谢变化
NASH(非酒精性脂肪肝)的病变组织中有ATP、α-KG、NAD的量减少的特点。使用4周龄的高脂肪食物投喂(引发NASH)的1型糖尿病模型小鼠(STAM模型)的肝脏组织，检测其中的ATP、α-KG、NAD水平的变化。结果显示，NASH诱导后10周龄的小鼠组中ATP、α-KG、NAD的浓度降低。
※详细的实验步骤请参考FAQ“是否有检测组织的实验例
<使用产品>
・组织内ATP：CK18 Cell Counting Kit-Luminescence
・组织内NAD：N509 NAD/NADH Assay Kit-WST
<实验参考文献>
| ATP | Francesco Bellanti, et al., “Synergistic interaction of fatty acids and oxysterols impairs mitochondrial function and limits liver adaptation during nafld progression”, Redox Biology, 2018, 15, 86-96. |
| α-KG | Jianjian Zhao, et al., “The mechanism and role of intracellular α-ketoglutarate reduction in hepatic stellate cell activation”, Bioscience Reports, 2020, 40, (3). |
| Ali Canbay, et al., “L‑Ornithine L‑Aspartate (LOLA) as a Novel Approach for Therapy of Non‑alcoholic Fatty Liver Disease”, Drugs, 2019, 79, 39-44. | |
| NAD | Jinhan He, et al., “Activation of the Aryl Hydrocarbon Receptor Sensitizes Mice to Nonalcoholic Steatohepatitis by Deactivating Mitochondrial Sirtuin Deacetylase Sirt3”, Mol. and Cell. Biol., 2013, 33, (10), 2047-55. |
常见问题Q&A
| Q1：每个试剂盒可以检测所少个样品？ |
| A1：如果标准曲线和样品都采用3个复孔来计算，可以检测12个样品。具体的96孔板的样品孔排列实例请见说明书。 |
| Q2：是否可以用黑色孔板以外的孔板（透明板或白色板）？ |
| A2：用透明板或白色板无法准确的绘制标准曲线，请使用黑色96孔板进行实验 |
| Q3：检测时样品没有显色，可能的原因有哪些？ |
| A3：本试剂盒对α-KG的检测范围是0.2 μmol/l以上，样品中的α-KG浓度如果低于0.2 μmol/l无法检测出来。可以尝试降低样品前处理时的稀释倍率。 |
| Q：配置好的Working Solution能否保存？ |
| A：配置好的Working solution无法保存，请现配现用。另外，Working solution遇光不稳定，配制好后请用铝箔纸包裹避光。※避光、室温的条件下可保存2小时左右。 |
| Q：检测样品是否可以保存？ |
| A：操作说明书上的“—定量细胞内α-KG的样品制备—”的步骤5中得到的前处理样品在-20℃可以保存10天。冷冻保存后的样品会发生沉淀，请离心后取上清作为检测样品。※加入20 μl Lysis solution, 吹打混匀后8,000xg离心10 min，取上清。 |
| Q：是否有组织样品的检测实例？ |
| A：有小鼠肝脏组织的检测实例。 |
具体的实验步骤如下：
碱性提取法提取的肝脏样品中的代谢指标检测
1.取大约100 mg小鼠肝脏组织样品加至500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液中。
※必须使用经过灌流操作完全脱血的组织样品，否则残留的血液会影响检测结果。
2.用Dounce型组织研磨器研磨肝脏组织。
3.将研磨后的样品回收至微管中，用500μl预冷的0.5 mol/ KOH水溶液清洗研磨器，并将清洗后的液体也
一起转移到回收样品的微管中(共约1 ml)。
4.向回收样品的微管中加入1 ml预冷的超纯水，充分混合后在冰浴上静置5 min(共约2 ml)。
※由于溶液的粘性较高，有时会出现离心后难以分离的情况。此时，用25 g左右的细针头注射器不断
吸取/推出(大约20-30次)，直到可以顺畅的吹打溶液为止。
5.离心机12,000xg，4 ℃离心5 min。
α-KG检测用样品的制备
6.取900μl上一步操作(步骤5)得到的溶液，加入200μl 1mol/l KH2PO4水溶液进行中和，混匀后在冰浴上
静置5 min。
7.离心机12,000xg，4 ℃离心5 min，取1 ml上清液至新的微管中作为检测样品。
<检测时的注意事项>
※组织提取的样品无法保存，请在当天内完成检测。
※枪头中残留的样品溶液时造成误差的原因之一，吸取样品溶液时尽量缓慢，减少枪头中残留的样品溶液。
※在稀释标准品和样品的时候，使用0.5 mol/l KOH水溶液和1mol/l KH2PO4水溶液按照9:5比率混合的溶液。
<检测实例>
诱导非酒精性脂肪肝的小鼠肝脏组中α-KG量的变化
