Cyto-ID® 检测试剂盒 Q&A
Q: Cyto-ID® 自噬检测试剂与活细胞孵育的最长时间是多少(几分钟/几小时/几天)?
A: 我们建议37℃孵育不超过30分钟。很多实验表明,孵育1小时不会伤害细胞。孵育超过1小时,一些细胞看上去状态不好。
Q: 是否可用荧光显微镜观察3D培养细胞的自噬?
A: 我们没有用该染料染过3D细胞,但是一小撮细胞是可以染色的。活体组织的话,由于染料的渗透性不好,不能进入样本的内部,所以效果
不理想。染白细胞是可以。
Q: 用双重染料染在37℃孵育30分钟后,细胞状态不好开始皱缩。有些细胞也从板上脱离,阳性对照和 DMSO 对照没有观察到特异性染色。
A: 对于比较敏感的细胞,优化流程如下:
1. 使用 PBS/5%FBS 或者完全培养基作为 assay buffer,最好不含酚红。
2. 如果细胞状态仍然不好,建议染色时间缩短至15~20分钟。
3. 减少染料的浓度至 1000× 稀释。需要显微镜观察时延长荧光照射的时间。
4. 可能光褪色会导致信号模糊。建议使用封片剂防止光褪色。
Q: 用流式检测的话,样品在用 Cyto-ID® 自噬检测试剂孵育后多久可用流式观察?操作手册是说30分钟。是否可以在检测之前短暂的将样品
放置在冰上?
A: 可以将样品放在冰上延长孵育的时间。一般的经验法则,尽可能缩短活细胞与染料的结合。缺氧,低温或者其他应激状态也可以诱导自噬。
Q: GFP-Certified™ 细胞凋亡/坏死检测试剂盒(ENZ-51002),Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)是否可以同时染色,检测细胞
凋亡,坏死和自噬?
A: GFP-Certified™ 细胞凋亡/坏死检测试剂盒(ENZ-51002)和Cyto-ID® 检测试剂盒(ENZ-51031)不能配合使用,因为细胞凋亡和自噬
检测的染料都发绿色荧光。这两个试剂盒可以平行使用。比如,用十字孢碱(Staurosporine)处理细胞,一部分样品用GFP-CertifiedTM
细胞凋亡/坏死检测试剂盒检测,一部分样品用Cyto-ID® 检测试剂盒检测。
Q: Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)的Cyto-ID® 自噬检测试剂能否与ProteoStat® 蛋白聚集检测(ENZ-51023)的ProteoStat®
检测试剂联合使用?
A: Cyto-ID® 绿色自噬检测试剂与 ProteoStat® 检测试剂发的荧光颜色不同,他们可用于同一实验,客户需要优化实验流程。
Q: Cyto-ID® 自噬检测试剂的原理是什么?
A: 染料是申请专利的。该染料是阳离子两性示踪剂(CAT)染料,跟很多阳离子化合物一样可以快速进入细胞。染料穿过细胞膜双分子层后被
动扩散,不需要蛋白结合 或者转运子活性。可滴定部分的筛选使的染料不会再溶酶体聚集,能够标记自噬通道相关的液泡。另外,染料的
发射光密度增强后可以标记自噬液泡相关片层膜结构。我们可以提供染料染自噬液泡的相关数据。
诱导自噬溶酶体,比如用氯喹或者 baflimyocin 处理后,会导致荧光变亮(250~300%)。雷帕霉素诱导自噬后能够用 3-MA 抑制。在
EBSS 中氨基酸缺乏会导致1小时后在自噬液泡中染料的积累,这种积累是可逆的(补充营养后即可恢复)。我们有一系列用于研究自噬的
化合物(Screen-Well® Autophagy library)
Q: 与单丹磺酰尸胺(MDC)相比,Cyto-ID® 自噬检测试剂有哪些优势?
A: MDC 需要 365 nm UV荧光照明,与通常流式配置的488n激发源不兼容。Cyto-ID® 自噬染料是488 nm激发波长,绿色的发射荧光,可以
高亮自噬通道不同的液泡成分。需要注意的是,与 lysomotrophic 染料不同,MDC,LysoTrackerTMRed,吖啶橙主要是染溶酶体的,
Cyto- ID®自噬染料只能染一点点溶酶体,主要是染自噬溶酶体和早期自噬部分的选择标记物。
Q: 与GFP-LC3转染细胞相比,Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)的优势是什么?
A: Cyto-ID® 检测试剂盒(ENZ-51031)的最大优势是不用转染细胞。转染很短暂,不同实验需要再购买相关试剂。由于细胞过表达,会导
致 GFP-LC3 聚集,结果呈假阳性。转染效率低于100%,有些细胞不会表达必要的 GFP 组件。该试剂盒检测的自噬,细胞群的一致性会更
好。不需要每个细胞系都进行转染。也可以标记原代。细胞原代细胞不容易进行转染。
Q: 有哪些细胞系或者原代细胞可用 Cyto-ID® 自噬检测试剂?
A: 用该试剂盒见检测过的代表性的细胞和细胞系包括肝细胞,SK-N-SH 神经瘤细胞,CHO 细胞,骨肉瘤来源细胞,黑素留细胞,乳腺癌细胞,
宫颈癌细胞,卵巢癌细胞,B淋巴瘤细胞,结肠癌细胞,HepG 细胞,Jurkat T 细胞,牛大动脉内皮细胞(BAEC)。
Q: Cyto-ID® 自噬检测试剂能否与其他染料配合使用,区分细胞核内体和自噬内涵体?
A: Cyto-ID® 红色长期示踪剂染料(ENZ-51037)能够染细胞质膜,通过细胞内吞存在于细胞中。Cyto-ID® 红色染料与 Cyto-ID® 自噬检测试
剂能够高亮异体吞噬vs自噬。也可以 Cyto-ID® 自噬检测试剂与 Lyso-ID® 红色染料或者 LysoTracker™ 红色染料进行活细胞染色,荧光显微
镜观察。
Q: Cyto-ID® 自噬检测试剂的稳定性如何?
A: 荧光染料会发生光褪色,但是这种染料比荧光素更稳定。按照操作手册出来荧光染料。
Q: Cyto-ID® 自噬检测试剂盒染色后是否可固定细胞?
A: 在操作手册中提供了固定细胞的流程。不推荐用表面活性剂给细胞打孔,定位的荧光染料丢失。
Q: 活细胞检测时,荧光信号强度可维持多长时间?
A: 细胞诱导后发生自噬,在分析前染色。诱导时间少于1小时或者诱导几天,诱导时间取决于自噬诱导剂。我们没有在活细胞上进行长时间的
染色,有客户发现可以至少染色24小时。