荧光染料ER-Tracker Green

荧光染料Dye Reagents ER-Tracker Green;

ER-Tracker Green 是一种内质网特异性的荧光染料。

ER-Tracker Green

ER-Tracker Green Chemical Structure

CAS No. : 730931-46-1

规格 是否有货
100 mg ; 询价 ;
250 mg ; 询价 ;
500 mg ; 询价 ;

* Please select Quantity before adding items.

生物活性

ER-Tracker Green is a fluorescent dye that specific for endoplasmic reticulum[1].

体外研究
(In Vitro)

ER tracker Green (1 mM, incubated in OptiMEM for 30 min at 37 °C) is used for endoplasmic reticulum staining[1].

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

分子量

783.09

Formula

C37H42BClF2N6O6S

CAS 号

730931-46-1

运输条件

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

储存方式

Please store the product under the recommended conditions in the Certificate of Analysis.

参考文献
  • [1]. J Jacob Strouse, et al. Fluorescent substrates for flow cytometric evaluation of efflux inhibition in ABCB1, ABCC1, and ABCG2 transporters. Anal Biochem. 2013 Jun 1;437(1):77-87.

荧光染料ER-Tracker Blue-White DPX

荧光染料Dye Reagents ER-Tracker Blue-White DPX;

ER-Tracker Blue-White DPX 是一种光稳定探针,用于选择性地标记内质网以进行荧光显微镜成像。

ER-Tracker Blue-White DPX

ER-Tracker Blue-White DPX Chemical Structure

CAS No. : 287715-95-1

规格 是否有货
100 mg ; 询价 ;
250 mg ; 询价 ;
500 mg ; 询价 ;

* Please select Quantity before adding items.

生物活性

ER-Tracker Blue-White DPX is a photostable probe used to selectively label the endoplasmic reticulum for fluorescence microscopy imaging[1].

分子量

580.53

Formula

C26H21F5N4O4S

CAS 号

287715-95-1

运输条件

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

储存方式

Please store the product under the recommended conditions in the Certificate of Analysis.

参考文献
  • [1]. Corryn E Chini, et al. Observation of endoplasmic reticulum tubules via TOF-SIMS tandem mass spectrometry imaging of transfected cells. Biointerphases. 2018 Feb 26;13(3):03B409.

    [2]. Yun-Mi Jeong, et al. CDy6, a photostable probe for long-term real-time visualization of mitosis and proliferating cells. Chem Biol. 2015 Feb 19;22(2):299-307.

ER-Protein Capture Kit 特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

ER-Protein Capture Kit
特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

  • 产品特性
  • 相关资料
  • Q&A
  • 参考文献

特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒ER-Protein Capture Kit                              特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

ER-Protein Capture Kit

ER-Protein Capture kit是一款利用荧光标记物特异性标记ER驻留蛋白,再使用标签捕获抗体通过免疫沉淀法纯化标记蛋白的试剂盒。可用于ER相关蛋白的全面鉴定与定量分析有或无刺激(例如内质网应激)下靶蛋白的ER驻留量。

 

 本产品是funakoshi基于京都大学工学研究科浜地格教授、田村朋则讲师的研究成果商品化销售的产品。

 本产品仅供研究使用。研究以外不可使用。

 


◆ER蛋白的回收方法与问题点


ER (内质网;Endoplasmic Reticulum)是一种通常在细胞内占据约20%体积的细胞器,结构非常复杂且遍布整个细胞。ER是负责细胞内蛋白质生物合成的中央细胞器,在多肽链合成、通过伴侣蛋白适当折叠、排除异常蛋白等,从生物合成到品质管理中起着重要作用。ER还担任分泌路径的一部分,是细胞膜蛋白和细胞外分泌蛋白通过的细胞器。另外,它还被认为对于脂质代谢和脂肪滴形成十分重要,因此能够分离、鉴定并定量分析ER蛋白的方法备受期待。然而,不同于其他细胞器,特异性纯化ER的的技术十分贫乏,选择性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大学浜地格教授、田村朋则讲师等开发的基于ER驻留蛋白标记技术商品化的ER蛋白选择性标记、纯化试剂盒。通过使用ER驻留蛋白标记试剂ERM ER-localizable Reactive Molecule),可以利用荧光标记物标记ER驻留蛋白,然后通过针对该标记物的特异性抗体进行纯化,选择性回收ER蛋白。无需超速离心机等特殊的机器,仅需简单操作便可纯化ER蛋白。除了能够通过蛋白组学进行全面鉴定外,本产品还适用于相对定量分析各种刺激处理下的ER驻留量。

 


◆试剂盒内容


本试剂盒由两部分组成。

A:ER驻留蛋白标记试剂ERM

A:(本试剂与产品名称为ERseeing、产品编号FDV-0038为同一试剂。可单独购买,也可以用作ER成像试剂)

B:标签捕获抗体(纯化兔多克隆IgG抗体)

A:※ 产品不包含用于细胞裂解液制备用的溶解缓冲液或免疫沉淀所需的Protein A / G树脂等。请另行购买。

 


◆原理和实验流程


ER驻留蛋白标记试剂ERM是一种在ER驻留性绿色荧光色素(Rhodol衍生物)上缀合蛋白标记基团的化合物。将ERM添加到活细胞后,由于色素部分的特性,显示出较高的ER驻留性。在ER中迅速浓缩后,通过蛋白标记基团用荧光标记物标记ER蛋白物(Step-1)。标记反应后破碎细胞制备细胞裂解液(Step-2),然后通过使用标签捕获抗体(抗Rhodol抗体)进行免疫沉淀(Step-3),可以选择性地回收被ERM标记的ER蛋白。由于回收的蛋白上带有荧光基团,使用SDS-PAGE分离后,可以通过CBB/银染或荧光成像仪检测出来(Step-4)。进行SDS-PAGE分离后,可以通过LC / MS进行全面蛋白组学分析或使用任何抗体的蛋白印迹法鉴定ER蛋白。

ER-Protein Capture Kit                              特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒



◆原著论文


Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060~17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

 


◆实验参考数据

ER-Protein Capture Kit                              特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

■ ERM的激发/发射光谱

■ 激发光谱(蓝)以及发射光谱(绿)

■ ※ 适用于普通的绿色荧光色素FITC观察条件

ER-Protein Capture Kit                              特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

■ ER特异性检验

■ 通过与各种细胞器标记共染色评价本试剂的ER特异性。观察到ERM(100 nM)与ER标记试剂高度共定位(皮尔逊相关系数>0.9)。另一方面,未观察到本试剂与溶酶体标记、线粒体标记的共定位。高尔基体标记观察到部分共定位,应该是因为本试剂所标记的蛋白通过Golgi体运输从ER转移至分泌路径。此外,添加ER-Golgi运输抑制剂的话,会减少与高尔基体的共定位(详细请参考原著论文)。

应用实例

通过蛋白组学全面分析回收蛋白


使用ERM (100 nM)处理HeLa细胞后,破碎细胞制备细胞裂解液。在裂解液中加入标签捕获抗体,使用Protein A磁珠进行免疫沉淀回收标记蛋白。将回收的蛋白通过SDS-PAGE分离后,切出每个条带,在凝胶中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制备LC/MS样品。通过MS分析鉴定出共146种蛋白,其中63种蛋白是数据库上的ER蛋白,或是个别论文中确认了ER驻留的蛋白。73种蛋白作为细胞膜、细胞外分泌蛋白以及高尔基体蛋白被鉴定出来,它们都是存在于细胞外分泌路径的蛋白。由于存在于细胞外分泌途径的蛋白会途经ER,当这些蛋白在ER的时候便会被标记。因此,检测出来的蛋白中ER蛋白与途经ER的蛋白约占93%。本实验中检测出与ER无关的蛋白有10种,约占7%。

ER-Protein Capture Kit                              特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

R应激引起的ER驻留蛋白变动量的定量评价


通过SILAC定量分析法分析ER应激诱导的ER驻留蛋白的变动量。准备两份细胞,一份在SILAC Heavy标记培养基中培养,另一份在Light标记培养基中培养。在Heavy标记培养基的细胞中添加ER应激诱导试剂Tunicamycin培养4 h。而Light标记培养基无需任何处理培养4 h。之后,使用ERM(100 nM)处理1 h,分别制备细胞裂解液,再以1:1的比例混合。通过免疫沉淀法回收混合裂解液中的标记蛋白,然后与上述实验一样,制备LC/MS用样品。检测出了87种可相对定量的蛋白,再通过SILAC法算出由ER应激引起的变动量。其中6种蛋白因ER应激在ER上的存在量增加了两倍以上。

ER-Protein Capture Kit                              特异性标记、纯化ER驻留蛋白的试剂盒

※ 本页面产品仅供研究用,研究以外不可使用。


产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
FDV-0039 ER-Protein Capture Kit 1 Kit

ER-ID® 绿色检测试剂盒、高尔基体/内质网/细胞核检测试剂盒 ER-ID® Green assay kit、Organelle-ID RGB® III assay kit

ER-ID® 绿色检测试剂盒、高尔基体/内质网/细胞核检测试剂盒
ER-ID® Green assay kit、Organelle-ID RGB® III assay kit

  • 产品特性
  • 相关资料
  • Q&A
  • 参考文献

细胞凋亡/自噬检测试剂盒ER-ID® 绿色检测试剂盒、高尔基体/内质网/细胞核检测试剂盒                              ER-ID® Green assay kit、Organelle-ID RGB® III assay kit


细胞自噬检测试剂盒 Cyto-ID® Autophagy Detection Kit – ENZ-51031

   

  该染料进行过优化,可在活细胞内进行实验,无需细胞转染。


  2014 年 6 月的 Nature 杂志刊登细胞自噬在抗帕金森病方面,抑制位于线粒体中的去泛素酶 USP30 的活性会增强神经元中受损线粒体的自噬和清理,有益于帕金森病的治疗。2013 年 7 月 Journal of Clinical Investigation 杂志刊登研究Ⅱ型糖尿病个体自噬作用可抑制毒性的胰岛淀粉样多肽(IAPP)的过量积累,从而保护胰腺  β 细胞免于受损。研究者希望早日找到保护胰腺  β 细胞的靶点以开发出型糖尿病的新疗法。美国加州大学洛杉矶分校的生物学家发现,果蝇机体和大脑的衰老延缓与激活肠道或神经系统中的关键的能量传感器 AMPK 基因后引起的自噬过程加快密切相关。Cyto-ID® 自噬检测试剂盒是 Enzo 公司的拳头产品,该产品可代替传统 LC3-GFP 法,通过荧光示踪物来选择性检测自噬通路中的各种囊泡包括自噬前体、自噬体和自溶酶体,用于流式细胞仪,无需转染,就能在荧光显微镜下跟踪活细胞的自噬过程进行定量分析,或用流式细胞仪进行高通量筛选,甚至能标记原代细胞。并且该产品可以进行自噬通路的动力学分析,为研究者展现自噬体形成和消除之间的动态平衡。Cyto-ID® 自噬检测试剂盒也可以与检测其他细胞器的染料结合使用:与 Mito-ID® Red 联用区分检测细胞自噬和线粒体自噬,与 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay 联用检测聚集小体及小体中的变性蛋白,与 Lyso-ID ® Red detection kit(GFP-Certified)联用区分检测自噬体和溶酶体,与 Lyso-ID® Red cytotoxicity kit(GFP-Certified)kit 联用监测自噬与细胞毒性的相关性。

原理


  该试剂盒利用专利性的染料,可选择性对前自噬体、自噬体和自噬性溶酶体进行染色,在荧光下显绿色,而对溶酶体的染色极少。

◆优点特色


● 无需进行细胞转染代替传统的 GFP-LC3 法
● 新颖的荧光探针可特异性地检测最低溶酶体背景的自噬囊泡
● 特别适用于筛选自噬激活剂与抑制剂


ER-ID® 绿色检测试剂盒、高尔基体/内质网/细胞核检测试剂盒                              ER-ID® Green assay kit、Organelle-ID RGB® III assay kit

Starvation 诱导细胞自噬,左图绿色为自噬体,右图为对照。蓝色为荧光染料 Hoechst 染细胞核。

General Cells

Cancer Cells

osteosarcoma-derived cells

melanoma cells

hepatocytes

ovarian cancer cells

Jurkat T cells

breast cancer cells

bovine aortic endothelial cells

cervical adenocarcinoma cells

B-lymphoblastoid cells

colon adenocarcinoma cells

Chinese hamster ovary (CHO) cells

SK-N-SH neuroblastoma cells

相关产品资料请点击下载:活细胞荧光分析 Ver.3

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相关产品

产品名称

特点

分析试剂盒

p62 ELISA kit

用于自噬研究,高效、定量的 p62 ELISA 试剂盒,可检测低至 100 pg/mL的 p62 进行。

NBR1 ELISA kit

率先投放市场,用于自噬研究的 NBR1 定量检测试剂盒,可检测65 pg/mL的 NBR1。

SCREEN-WELL® Autophagy library

不同结构和机制的化合物,用于胞内和体外研究,促进/抗自噬分子的作用机制。

抗体

LC3, mAb (2G6) (fluorescein labeled)

识别所有单体(LC3-I)和 PE 交联(LC3-II)形式的人LC3/GABARAP 蛋白 (Atg8 同系物 ) 。

LC3, mAb (5H3)

识别人 LC3。识别两种形式的内源性 LC3。

LC3B, mAb (2G6)

识别人、小鼠、大鼠、猴和仓鼠 LC3B。识别两种形式的内源性   LC3B。

LC3B, mAb (5F10)

识别人、小鼠、大鼠、狗和仓鼠 LC3B。识别这两种形式的内源性LC3B。

小分子

3-Methyladenine

PI3 激酶抑制剂,著名的自噬抑制剂。

Rapamycin

具有强效免疫抑制剂的活性。它与 FKBP12 形成的复合物结合一个效应子,从而抑制 IL-2 和其它生长因子。

Cyto-ID® 检测试剂盒 Q&A

Q:    Cyto-ID® 自噬检测试剂与活细胞孵育的最长时间是多少(几分钟/几小时/几天)?
A:    我们建议37℃孵育不超过30分钟。很多实验表明,孵育1小时不会伤害细胞。孵育超过1小时,一些细胞看上去状态不好。


Q:    是否可用荧光显微镜观察3D培养细胞的自噬?
A:    我们没有用该染料染过3D细胞,但是一小撮细胞是可以染色的。活体组织的话,由于染料的渗透性不好,不
能进入样本的内部,所以效果

          想。染白细胞是可以。


Q:    用双重染料染在37℃孵育30分钟后,细胞状态不好开始皱缩。有些细胞也从板上脱离,阳性对照和 DMSO 对
照没有观察到特异性染色。

A:    对于比较敏感的细胞,优化流程如下:
          1. 使用 PBS/5%FBS 或者完全培养基作为 assay buffer,最好不含酚红。
          2. 如果细胞状态仍然不好,建议染色时间缩短至15~20分钟。
          3. 减少染料的浓度至 1000× 稀释。需要显微镜观察时延长荧光照射的时间。
          4. 可能光褪色会导致信号模糊。建议使用封片剂防止光褪色。

Q:    用流式检测的话,样品在用 Cyto-ID® 自噬检测试剂孵育后多久可用流式观察?操作手册是说30分钟。是否可以在检测之前短暂的将样品

          冰上?

A:    可以将样品放在冰上延长孵育的时间。一般的经验法则,尽可能缩短活细胞与染料的结合。缺氧,低温或者其他应激状态也可以诱导自噬。


Q:    GFP-Certified™ 细胞凋亡/坏死检测试剂盒(ENZ-51002),Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)是
否可以同时染色,检测细胞

          亡,死和自噬?

A:    GFP-Certified™ 细胞凋亡/坏死检测试剂盒(ENZ-51002)和Cyto-ID® 检测试剂盒(ENZ-51031)不能配合使用,因为细胞凋亡和自噬

          染料都发绿色荧光。这两个试剂盒可以平行使用。比如,用十字孢碱(Staurosporine)处理细胞,一部分样品用GFP-CertifiedTM

          亡/坏死检测试剂盒检测,一部分样品用Cyto-ID® 检测试剂盒检测。


Q:    Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)的Cyto-ID® 自噬检测试剂能否与ProteoStat® 蛋白聚集检测(ENZ
-51023)的ProteoStat® 

          试剂联合使用?

A:    Cyto-ID® 绿色自噬检测试剂与 ProteoStat® 检测试剂发的荧光颜色不同,他们可用于同一实验,客户需要优化实验流程。


Q:    Cyto-ID® 自噬检测试剂的原理是什么?
A:    染料是申请专利的。该染料是阳离子两性示踪剂(CAT)染料,跟很多阳离子化合物一样可以快速进入细
胞。染料穿过细胞膜双分子层后被

          散,不需要蛋白结合 或者转运子活性。可滴定部分的筛选使的染料不会再溶酶体聚集,能够标记自噬通道相关的液泡。另外,染料的

          密度增强后可以标记自噬液泡相关片层膜结构。我们可以提供染料染自噬液泡的相关数据。


          诱导自噬溶酶体,比如用氯喹或者 baflimyocin 处理后,会导致荧光变亮(250~300%)。雷帕霉素诱导自噬后能够用 3-MA 抑制。在 

          EBSS 酸缺乏会导致1小时后在自噬液泡中染料的积累,这种积累是可逆的(补充营养后即可恢复)。我们有一系列用于研究自噬的

          化合物(Screen-Well® Autophagy library)


Q:    与单丹磺酰尸胺(MDC
相比,Cyto-ID® 自噬检测试剂有哪些优势?

A:    MDC 需要 365 nm UV荧光照明,与通常流式配置的488n激发源不兼容。Cyto-ID® 自噬染料是488 nm激发波长,绿色的发射荧光,可以

          自噬通道不同的液泡成分。需要注意的是,与 lysomotrophic 染料不同,MDC,LysoTrackerTMRed,吖啶橙主要是染溶酶体的, 

          Cyto- ID®自噬染料只能染一点点溶酶体,主要是染自噬溶酶体和早期自噬部分的选择标记物。


Q:    与GFP-LC3转染细胞相比,Cyto-ID® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031
的优势是什么?

A:    Cyto-ID® 检测试剂盒(ENZ-51031)的最大优势是不用转染细胞。转染很短暂,不同实验需要再购买相关试剂。由于细胞过表达,会导

          致 GFP-LC3 聚集,结果呈假阳性。转染效率低于100%,有些细胞不会表达必要的 GFP 组件。该试剂盒检测的自噬,细胞群的一致性会更

          好。不需个细胞系都进行转染。也可以标记原代。细胞原代细胞不容易进行转染。


Q:    有哪些细胞系或者原代细胞可用 Cyto-ID® 自噬检测试剂?
A:    用该试剂盒见检测过的代表性的细胞和细胞系包括肝细胞,SK-N-SH 神经瘤细胞,CHO 细胞,骨肉瘤来源细
胞,黑素留细胞,乳腺癌细胞,

          颈癌胞,卵巢癌细胞,B淋巴瘤细胞,结肠癌细胞,HepG 细胞,Jurkat T 细胞,牛大动脉内皮细胞(BAEC)。


Q:    Cyto-ID® 自噬检测试剂能否与其他染料配合使用,区分细胞核内体和自噬内涵体?
A:    Cyto-ID® 红色长期示踪剂染料(ENZ-51037)能够染细胞质膜,通过细胞内吞存在于细胞中。Cyto-ID® 
色染料与 Cyto-ID® 自噬检测试

          能够高亮异体吞噬vs自噬。也可以 Cyto-ID® 自噬检测试剂与 Lyso-ID® 红色染料或者 LysoTracker™ 红色染料进行活细胞染色,荧光显微

          镜观察。


Q:    Cyto-ID® 自噬检测试剂的稳定性如何?
A:    荧光染料会发生光褪色,但是这种染料比荧光素更稳定。按照操作手册出来荧光染料。

Q:    Cyto-ID® 自噬检测试剂盒染色后是否可固定细胞?
A:    在操作手册中提供了固定细胞的流程。不推荐用表面活性剂给细胞打孔,定位的荧光染料丢失。

Q:    活细胞检测时,荧光信号强度可维持多长时间?
A:    细胞诱导后发生自噬,在分析前染色。诱导时间少于1小时或者诱导几天,诱导时间取决于自噬诱导剂。我们没有在活细胞上进行长时间的

          色,有客户发现可以至少染色24小时。


产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
ENZ-51025-K500 ER-ID® Green assay kit 
ER-ID® 绿色检测试剂盒
500 assays/100 assays
ENZ-51032-K100 Organelle-ID RGB® III assay kit 
高尔基体/内质网/细胞核检测试剂盒
500 assays/100 assays

ER 172594-06 hydrobromide ER 172594-06盐酸盐 品牌:SynKinase


ER 172594-06 hydrobromide

ER 172594-06盐酸盐

品牌:SynKinase
CAS No.:474550-69-1
储存条件:-20°C
纯度:>95%
产品编号

(生产商编号)

等级 规格 运输包装 零售价(RMB) 库存情况 参考值

SYN-3002-M001

1 mg 2,950.00


* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用


* 零售价、促销产品折扣、运输费用、库存情况、产品及包装规格可能因各种原因有所变动,恕不另行通知,确切详情请联系上海金畔生物科技有限公司。

ER 172594-06 hydrobromide ER 172594-06盐酸盐 品牌:SynKinase


ER 172594-06 hydrobromide

ER 172594-06盐酸盐

品牌:SynKinase
CAS No.:474550-69-1
储存条件:-20°C
纯度:>95%
产品编号

(生产商编号)

等级 规格 运输包装 零售价(RMB) 库存情况 参考值

SYN-3002-M005

5 mg 6,960.00


* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用


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ER 172594-06 hydrobromide ER 172594-06盐酸盐 品牌:SynKinase


ER 172594-06 hydrobromide

ER 172594-06盐酸盐

品牌:SynKinase
CAS No.:474550-69-1
储存条件:-20°C
纯度:>95%
产品编号

(生产商编号)

等级 规格 运输包装 零售价(RMB) 库存情况 参考值

SYN-3002-M010

10 mg 10,810.00


* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用


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ER 172594-06 hydrobromide ER 172594-06盐酸盐 品牌:SynKinase


ER 172594-06 hydrobromide

ER 172594-06盐酸盐

品牌:SynKinase
CAS No.:474550-69-1
储存条件:-20°C
纯度:>95%
产品编号

(生产商编号)

等级 规格 运输包装 零售价(RMB) 库存情况 参考值

SYN-3002-M050

50 mg 咨询


* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用


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ER 172594-06 hydrobromide ER 172594-06盐酸盐 品牌:SynKinase


ER 172594-06 hydrobromide

ER 172594-06盐酸盐

品牌:SynKinase
CAS No.:474550-69-1
储存条件:-20°C
纯度:>95%
产品编号

(生产商编号)

等级 规格 运输包装 零售价(RMB) 库存情况 参考值

SYN-3002-M100

100 mg 咨询


* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用


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Toxinometer® Et-7000/J Er/Es Set 内毒素检测仪ET-7000/J Er/Es套装 品牌:FUJIFILM Wako


Toxinometer® Et-7000/J Er/Es Set

内毒素检测仪ET-7000/J Er/Es套装

品牌:FUJIFILM Wako
CAS No.:
储存条件:室温
纯度:
产品编号

(生产商编号)

等级 规格 运输包装 零售价(RMB) 库存情况 参考值

295-35781

1 set 咨询


* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用


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