日本同仁化学线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒| DOJINDO

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线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy Detection Kit

商品信息

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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产品文献

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选择规格：

1set

现货

线粒体自噬检测

试剂盒内含

产品概述

原理

实验例

荧光特性

参考文献

常见问题Q&A

试剂盒内含

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

产品概述

线粒体 (Mitochondria) 是细胞中重要的细胞器之一，可以为细胞活力提供能量。近年有报道去极化线粒体的积累引起的阿尔茨海默病 (Alzheimer’s Disease) 与帕金森病(Parkinson’s Disease)，可能与线粒体自噬有关。线粒体自噬是一种清除机制，可以通过自噬，将氧化应激、DNA损伤因素导致功能失调的线粒体隔离包裹成自噬体(Autophagosome)，再与溶酶体 (Lysosome) 融合后降解。本试剂盒内含Mtphagy Dye (用于检测线粒体自噬) 和Lyso Dye (溶酶体染料)。Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。如想直观观察Mtphagy Dye标记的线粒体和溶酶体的结合，可联合应用试剂盒中的Lyso Dye (标记溶酶体) 进行双染。

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

实验例

1.用羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP，一种线粒体解偶联剂) 诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并通过荧光显微镜进行检测。另外，通过与线粒体染色试剂（MitoBright Deep Red:MT08）一同染色，能够区分出已发生自噬的的线粒体（白色）和未发生自噬的线粒体（紫色）（照片：右侧）。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

用羰基氰化物间氯苯腙(CCCP，一种线粒体解偶联剂)诱导Parkin表达的HeLa细胞线粒体自噬，并使用线粒体自噬检测试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit：MT09）观察荧光结果。

结果证实在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。另一方面，在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光降低）和线粒体自噬的发生（Mtphagy染料的荧光增强）。

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。在荧光显微镜下观察细胞。

■线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作液使其终浓度达到2 μmol/l，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，并在荧光显微镜下观察细胞。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？

A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。

Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。

A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

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线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy Detection Kit

商品信息

特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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产品文献

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选择规格：

1set

现货

线粒体自噬检测

试剂盒内含

产品概述

原理

实验例

荧光特性

参考文献

常见问题Q&A

试剂盒内含

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

产品概述

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

实验例

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

■线粒体膜电位检测

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？

A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。

Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01 线粒体自噬检测试剂盒

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。

A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

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日本同仁化学2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)试剂货号：D418 2,3-二氨基萘| DOJINDO

发表于2024年6月9日由Whatman官网

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2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)试剂货号：D418

2,3-二氨基萘

2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)

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运输条件：室温

分子式：

C₁₀H₁₀N₂

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日本同仁化学ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296| DOJINDO

发表于2024年6月7日由Whatman官网

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ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

ECGreen-Endocytosis Detection

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40μl

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细胞染色

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产品特性

弥补了传统方法的缺点

直接的内体(Endosome)可视化

pH变化的应答性高

实验例

ECGreen的荧光特性

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常见问题Q&A

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产品特性

细胞内吞作用(Endocytosis)是一种通过细胞膜形成内体(Endosome)的细胞摄入机制。内吞作用不仅可以将各种营养物质摄入到细胞内，还可以将细胞内外的有害物质转运至溶酶体中分解，帮助维持细胞稳态。近年来的研究发现，内吞作用的紊乱与很多神经变异性疾病和免疫疾病密切相关，因此受到了广泛关注。而通过荧光探针标记细胞内吞作用摄入的葡聚糖，是最广泛使用的一种研究方法。但是由于葡聚糖的大小不固定，细胞摄入时的通路以及细胞内动力学都会随之发生变化。所以急需一种更准确的研究细胞内吞作用通路的方法。

ECGreen是一种细胞膜非透过性的小分子荧光染料，它可停留在细胞膜上。随着内吞作用进入细胞后，内体中的酸性环境会使它的荧光增强。与传统的标记葡聚糖的方法不同，ECGreen通过对内体的膜直接染色，可以更准确的进行活细胞内的内吞作用通路分析。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

弥补了传统方法的缺点

目前最常用的细胞内吞作用可视化的方法是荧光标记葡聚糖或细胞膜，由于准确性差和停留时间短等缺点，在进行细胞内吞作用的动态观察时存在各种各样的问题。而ECGreen可以解决上述问题。

产品名	Endosome	pH的应答性	Lysosome
ECGreen-Endocytosis Detection	内体的膜	ECGreen>葡聚糖	可染色
T公司产品P(葡聚糖荧光染料)	内体内部	ECGreen>葡聚糖	可染色
T公司产品C	很少染色内体	无应答性	可染色

直接的内体(Endosome)可视化

ECGreen-Endocytosis Detection可以染色内体的膜，随着pH的变化荧光强度发生变化。因此与其他公司的通过标记蛋白质的方法相比，可以更直接的观察初级阶段的内体。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

pH变化的应答性高

ECGreen-Endocytosis Detection与传统的荧光标记葡聚糖的方法相比，对pH变化的应答性更优秀。因此可以高灵敏的检测初级内体。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

实验例

实验例：通过悬浮细胞观察内吞作用对温度依赖性的变化

本实验使用ECGreen内吞检测试剂（产品货号：E296）和PlasMem Bright Red（产品货号：P505）染色，对Jurkat细胞内吞时对温度的依赖性变化

<检测条件>

内体检测(ECGreen, 绿色): Ex. 405 nm / Em. 500 – 560 nm

细胞膜检测 (PlasMem Bright Red,红色): Ex. 561 nm / Em. 560 – 700 nm

<实验步骤>

（1）在样品管中加入Jurkat细胞悬液（10%FBS，RPMI）并在4℃或37℃孵育30min。

（2）使用步骤（1）配置的细胞悬浮液将ECGreen溶液稀释1000倍。

（3） 4℃或37℃孵育30min。

（4）用HBSS清洗细胞两次。

（5）加入含有PlasMem Bright Red（100倍稀释）的培养基，悬浮细胞。

（6）将悬浮液转移到成像板上，并使用共聚焦显微镜观察细胞。

实验例：使用药物后初期内体的观察

Wortmannin是一种阻碍内体向循环内体(Recycling endosome)和溶酶体(Lysosome)转变的药物，可造成内体肥大。Wortmannin作用后通过ECGreen(绿)和下列试剂进行共染色。

初级内体(Early Endosome)： Rab5-RFP(红)

循环内体(Recycling Endosome)：荧光标记Transferrin(红)

次级内体(Late Endosome): Rab7-RFP(红)

溶酶体(Lysosome): Lamp1-RFP(红)

结果显示，ECGreen(绿)由于Wortmannin的作用仅与肥大化的初级内体和循环内体共同存在（图①和②），而不与次级内体和溶酶体共同存在（图③和④）。因此，ECGreen可以准确可视化细胞内体的转运和形态变化。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

实验例：内体局部实时观察

用共聚焦激光显微镜观察ECGreen时，即使染色后不清洗也可以观察到内吞作用产生的荧光亮点。作为使用ECGreen的应用实验的一个例子，HeLa细胞用ECGreen（绿色）和溶酶体染色剂（红色）染色，并确认了成像图像的时间变化。

结果证实了随着时间的流逝，内体与溶酶体共定位。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

<观察条件>

内体 (ECGreen, 绿) Ex. 405 nm / Em. 500-560 nm

溶酶体 (Lysosome染色试剂, 红) Ex. 561 nm / Em. 600-700 nm

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

清洗后观察和不清洗观察，所获得的成像图像具有以下特征。

〇染色后不洗：

由于染料可以保留在细胞膜中，因此可以随时间观察内吞状态。

那时，在细胞膜上也观察到荧光亮点，因为过量的染料残留在膜上。

〇染色后清洗：

通过去除残留在细胞膜上的多余染料，可以更清楚地观察到来自内吞作用的荧光亮点

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

ECGreen的荧光特性

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

λex: 386 nm, λem: 522 nm

<观察条件>

Ex. 350~410 nm / Em. 500-560 nm

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ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

常见问题Q&A

Q1: 可以使用落射型显微镜观察吗？

A:建议使用共焦显微镜进行观察，但是也可以用落射型显微镜进行观察。本公司有在DAPI通道（Ex:360/40nm，Em:460/50nm）检测的实例。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

Q2: 可以使用含血清的培养基进行染色吗？

A: 可以使用含血清的培养基。

对HeLa细胞，使用含有血清的培养基制作的working solution，在24小时内进行染色，发现无细胞毒性。

细胞毒性已使用本公司Cell Counting Kit-8确认。

ECGreen-Endocytosis Detection试剂盒货号：E296

产品文献

1、Y. Miyakawa, M. Otsuka, K. Sekiba, K. Funato, K. Koike, “Humanized virus-suppressing factor inhibits hepatitis B virus infection by targeting viral cell entry”, Heliyon, 2021, doi:10.1016/j.heliyon.2021.e07586.

2、H. L. Marko, N. C. Hornig, R. C. Betz, P. Holterhus, J. Altmüller, H. Thiele, M. Fabiano, H. Schweikert, D. Braun, Ul Schiweizer, “Genomic variants reducing expression of two endocytic receptors in 46,XY differences of sex development”, Hum. Mutat. 2022, doi:10.1002/humu.24325.

3、K. Qiu, R. Seino, G. Han, M. Ishiyama, Y. Ueno, Z. Tian, Y. Sun, J. Diao, “De Novo Design of A Membrane-Anchored Probe for Multidimensional Quantification of Endocytic Dynamics”, Adv. Healthcare Mater., 2022, doi:10.1002/adhm.202102185.

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日本同仁化学线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01| DOJINDO

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线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

线粒体自噬检测试剂盒

Mitophagy Detection Kit

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特点：

● 只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

● 可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

● 可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

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线粒体自噬详述		Mitophagy Detection Kit（本产品）
多细胞器共染&线粒体动力学		MitoBright IM Red for Immunostaining
多细胞器共染&线粒体动力学		MitoBright LT Green/Red/Deep Red
线粒体功能		JC-1 、MT-1
		CCK-L、ADP/ATP比率检测
		Oxygen Consumption Rate(OCR)
		mtSOX
		ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-
		ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-
Ca2+从内质网到线粒体		Fura 2-AM
		Fluo 4-AM
		Rhod 2-AM
线粒体自噬-溶酶体功能		Lysosomal Acidic pH Detection Kit
线粒体自噬-溶酶体功能		Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red
线粒体自噬-脂质定位&定量		Lipi-Blue/Green/Red/Deep Red
线粒体自噬-脂质定位&定量		Lipid Droplet Assay Kit-Blue/Deep Red
细胞死亡		Cell Counting Kit-8
		Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST
		Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit

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试剂盒内含

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

产品概述

特点：

1）只需添加小分子量荧光试剂即可轻松检测线粒体

2）可以使用荧光显微镜进行活细胞成像

3）可以与附着的溶酶体染色剂同时染色

原理

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

实验例

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

波长：

Mtphagy Dye:561 nm (Ex)、650 LP nm (Em)

Lyso Dye:488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

MitoBright Deep Red:640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)

2.荧光显微镜观察

HeLa细胞用CCCP处理，并与线粒体检测试剂（Mtphagy Dye）和线粒体染色试剂（MitoBright LT Green）共同染色，并经过一段时间（6小时）后进行检测。

<检测条件>

设备：LSM-700 Laser scanning confocal microscope (LSCM)

(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

激发波长：

MitoBright LT Green 488 nm

Mtphagy Dye 555 nm

物镜：63x

拍摄时间：6小时

拍摄间隔：15秒

3.自噬诱导和线粒体膜电位变化关系的检测

<实验条件>

■将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

过夜培养后进行检测。

■线粒体自噬检测

■线粒体膜电位检测

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

<检测条件>

■线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

■线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

荧光特性

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

参考文献

序号	检测对象	使用仪器	文献
1)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	J. Koniga, C. Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”, Redox Biology, 2017, 11, 673.
2)	细胞（KB）	荧光显微镜	K. Kameyama, “Induction of mitophagy-mediated antitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”, International Journal of Nanomedicine, 2017, 12, 3433.
3)	细胞（SH-SY5Y, 初代皮质神经细胞）	荧光显微镜	E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M. Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A. Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I. G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A. Bohr and K. G. Becker, “Tomatidine enhances lifespan and healthspan in C. elegans through mitophagy induction via the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports, 2017, 7, (46208), DOI: 10.1038/srep46208.
4)	细胞（HeLa、Parkin表达HeLa）	荧光显微镜	H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K. Sasamoto, S. Shimizu and K. Okuma, “Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12, (10), 2546.
5)	细胞（Cardiomyocytes）	流式细胞仪	Y. Feng, NB. Madungwe, CV. da Cruz Junho and JC. Bopassa, “Activation of G protein-coupled oestrogen receptor 1 at the onset of reperfusion protects the myocardium against ischemia/reperfusion injury by reducing mitochondrial dysfunction and mitophagy.”, Br. J. Pharmacol., 2017, 174, (23), 4329.
6)	细胞（HCT116）	荧光显微镜	K. M. Elamin, K. Motoyama, T. Higashi, Y. Yamashita, A. Tokuda and H. Arima, “Dual targeting system by supramolecular complex of folate-conjugated methyl-β-cyclodextrin with adamantane-grafted hyaluronic acid for the treatment of colorectal cancer.”, Int. J. Biol. Macromol., 2018, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.02.149.
7)	细胞（Parkin-HeLa）	流式细胞仪	N. Furuya, S. Kakuta, K. Sumiyoshi, M. Ando, R. Nonaka, A. Suzuki, S. Kazuno, S. Saiki and N. Hattori, “NDP52 interacts with mitochondrial RNA poly(A) polymerase to promote mitophagy.”, EMBO Rep. ., 2018, doi: 10.15252/embr.201846363.
8)	细胞（NKT）	流式细胞仪	L. Zhu, X. Xie, L. Zhang, H. Wang, Z. Jie, X. Zhou, J. Shi, S. Zhao, B. Zhang, X. Cheng and S. Sun, “TBK-binding protein 1 regulates IL-15-induced autophagy and NKT cell survival”, Nature Communications., 2018, 9, (1), doi:10.1038/s41467-018-05097-5.
9)	细胞（HeLa）	流式细胞仪	K. Araki, K. Kawauchi, W. Sugimoto, D. Tsuda, H. Oda, R. Yoshida and K. Ohtani, “Mitochondrial protein E2F3d, a distinctive E2F3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells”, Commun Biol., 2019, DOI: 10.1038/s42003-018-0246-9.
10)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. Adegoke, S. Adeniran, Y. Zeng, X. Wang, H. Wang, C. Wang, H. Zhang, P. Zheng and G. Zhang , “Pharmacological inhibition of TLR4/NF-κB with TLR4-IN-C34 attenuated microcystin-leucine arginine toxicity in bovine Sertoli cells.”, J Appl Toxicol., 2019,doi: 10.1002/jat.3771.
11)	组织（小鼠）	荧光显微镜	E. F. Fang, Y. Hou, K. Palikaras, B. A. Adriaanse, J. S. Kerr, B. Yang, S. Lautrup, M. M. Hasan-Olive, D. Caponio, X. Dan, P. Rocktaschel, D. L. Croteau, M. Akbari, N. H. Greig, T. Fladby, H. Nilsen, M. Z. Cader, M. P. Mattson, N. Tavernarakis and V. A. Bohr, “Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease.”, Nat. Neurosci. ., 2019,DOI:10.1038/s41593-018-0332-9.
12)	细胞（HepG2）	荧光显微镜	Iwasawa, T. Shinomiya, N. Ota, N. Shibata, K. Nakata, I. Shiina, and Y. Nagahara , “Novel Ridaifen-B Structure Analog Induces Apoptosis and Autophagy Depending on Pyrrolidine Side Chain”, Biological and Pharmaceutical Bulletin., 2019, 42, (3), 401-410, doi: 10.1248/bpb.b18-00643.
13)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.
14)	细胞（INS-1）	荧光显微镜	A. Inamura, S. M. Hirayama, and K. Sakurai, Loss of Mitochondrial DNA by Gemcitabine Triggers Mitophagy and Cell Death’, Biol. Pharm. Bull.., 2019, 42, 1977.
15)	细胞（HRCEpiC, HRPTEpic）	流式细胞仪	Y. Zhao and M. Sun, Metformin rescues Parkin protein expression and mitophagy in high glucose-challenged human renal epithelial cells by inhibiting NF-κB via PP2A activation., Life Sci.., 2020, DOI:10.1016/j.lfs.2020.117382.
16)	细胞（RAES）	荧光显微镜	N. Liu, J. Wu, L. Zhang, Z. Gao, Y. Sun, M. Yu, Y. Zhao, S. Dong, F. Lu and W. Zhang , “Hydrogen Sulphide modulating mitochondrial morphology to promote mitophagy in endothelial cells under high‐glucose and high‐palmitate “, J. Cell. Mol. Med., 2017, 21, (12), 3190.
17)	细胞（BAECs）	荧光显微镜	N. Kajihara, D. Kukidome, K. Sada, H. Motoshima, N. Furukawa, T. Matsumura, T. Nishikawa and E. Araki, “Low glucose induces mitochondrial reactive oxygen species via fatty acid oxidation in bovine aortic endothelial cells”, J Diabetes Investig, 2017, 8, (6), 750.
18)	细胞（HT22）	荧光显微镜	M. Jin, H. Ni and L. Li, “Leptin Maintained Zinc Homeostasis Against Glutamate-Induced Excitotoxicity by Preventing Mitophagy-Mediated Mitochondrial Activation in HT22 Hippocampal Neuronal Cells.”, Front Neurol, 2018, 9, (9), 332.
19)	细胞（BMDMs）	流式细胞仪	D. Bhatia, K. P. Chung, K. Nakahira, E. Patino, M. C. Rice, L. K. Torres, T. Muthukumar, A. M. Choi, O. M. Akchurin and M. E. Choi , “Mitophagy-dependent macrophage reprogramming protects against kidney fibrosis”, JCI Insight, 2019, 4, (23), e132826.
20)	细胞（U2OS）	荧光显微镜	J. Zheng, D. L. Croteau, V. A. Bohr and M. Akbari, “Diminished OPA1 expression and impaired mitochondrial morphology and homeostasis in Aprataxin-deficient cells. “, Nucleic Acids Res., 2019, 47, (8), 4086.
21)	细胞（HT22）	荧光显微镜	D. D. Wang, M. F. Jin, D. J. Zhao and H. Ni, “Reduction of Mitophagy-Related Oxidative Stress and Preservation of Mitochondria Function Using Melatonin Therapy in an HT22 Hippocampal Neuronal Cell Model of Glutamate-Induced Excitotoxicity”, Front Endocrinol (Lausanne), 2019, 10, 550.
22)	细胞（CD⁴⁺T-cells, HeLa）	荧光显微镜	A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, A. Bektas, S. H. Schurman, M. G. Freire, C. A. Dunn, A. K. Singh, F. Macian, A. M. Cuervo, R. Sen and L. Ferrucci, “Age-associated changes in human CD⁴⁺ T cells point to mitochondrial dysfunction consequent to impaired autophagy.”, Aging (Albany NY)., 2019, 11, (21), 9234-9263.
23)	细胞（ALM）	流式细胞仪	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner, “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov., 2019, 9, (7), 919.
24)	细胞（PK-15）	荧光显微镜	Y. Zhang, R. Sun, X. Li and W. Fang, “Porcine Circovirus 2 Induction of ROS Is Responsible for Mitophagy in PK-15 Cells via Activation of Drp1 Phosphorylation”, Viruses., 2020, 12, (3), 289.
25)	细胞（HCE）	荧光显微镜	Y. Huo, W. Chen, X. Zheng, J. Zhao, Q. Zhang, Y. Hou, Y. Cai, X. Lu and X. Jin , “The protective effect of EGF-activated ROS in human corneal epithelial cells by inducing mitochondrial autophagy via activation TRPM2.”, J. Cell. Physiol., 2020, DOI: 10.1002/jcp.29597.
26)	细胞（心肌细胞）	荧光显微镜	Y. Sun, F. Lu, X. Yu, B. Wang, J. Chen, F. Lu, S. Peng, X. Sun, M. Yu, H. Chen, Y. Wang, L. Zhang, N. Liu, H. Du, D. Zhao and W. Zhang, “Exogenous H2S Promoted USP8 Sulfhydration to Regulate Mitophagy in the Hearts of db/db Mice.”, Aging Dis., 2020, 11, (2), 269.
27)	细胞（HCFs）	荧光显微镜	R. Tanaka, M. Umemura, M. Narikawa, M. Hikichi, K. Osaw, T. Fujita, U. Yokoyama, T. Ishigami, K. Tamura and Y. Ishikawa, “Reactive fibrosis precedes doxorubicin-induced heart failure through sterile inflammation.”, ESC Heart Fail., 2020, 7, (2), 588.
28)	细胞（VSMCs）	荧光显微镜	C. Duan, L. Kuang, X. Xiang, J. Zhang, Y. Zhu, Y. Wu, Q. Yan, L. Liu and T. Li, “Drp1 regulates mitochondrial dysfunction and dysregulated metabolism in ischemic injury via Clec16a-, BAX-, and GSH- pathways “, Cell Death Dis., 2020, 11, 251.
29)	细胞（Bovine Sertoli）	荧光显微镜	E. O. Adegoke, W. Xue, N. S. Machebe, S. O. Adeniran, W. Hao, W. Chen, Z. Han, Z. Guixue and Z. Peng, “Sodium Selenite inhibits mitophagy, downregulation and mislocalization of blood-testis barrier proteins of bovine Sertoli cell exposed to microcystin-leucine arginine (MC-LR) via TLR4/NF-kB and mitochondrial signaling pathways blockage.”, Ecotoxicol. Environ. Saf., 2018, 116, 165.
30)	细胞（HeLa）	荧光显微镜	D. Takahashi, J. Moriyama, T. Nakamura, E. Miki, E. Takahashi, A. Sato, T. Akaike, K. I. Nakama and H. Arimoto, “AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. “, Mol. Cell, 2019, 76, (5), 797.
31)	细胞（primary hepatocyte）	荧光显微镜	H. Kim, J. H. Lee and J. W. Park, “IDH2 deficiency exacerbates acetaminophen hepatotoxicity in mice via mitochondrial dysfunction-induced apoptosis.”, Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis, 2019, 1865, (9), 2333.
32)	细胞（C3H10T1/2s）	荧光显微镜	M. S. Rahman and Y. S. Kim, “PINK1-PRKN mitophagy suppression by Mangiferin promotes a brown-fat-phenotype via PKA-p38 MAPK signalling in murine C3H10T1/2”, Metabolism, 2020, 101, 154228.
33)	细胞（NHEKs）	荧光显微镜	S. Ikeoka and A. Kiso , “The Involvement of Mitophagy in the Prevention of UV-B-Induced Damage in Human Epidermal Keratinocytes “, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 2020, 54(3), 252.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒和现存传统方法相比有何优势？

A1: 与PH敏感并基于Keima荧光蛋白检测方法相比，本试剂为小分子荧光试剂，因此无需表达荧光蛋白。

另外，可以通过与用于普通活细胞成像的荧光试剂用相同的操作方法对其进行染色和共同观察。

Q2: 使用DMSO配置后的储存液稳定性如何？

A2：Mtphagy Dye、Lyso Dye均在制备后需保存在-20℃情况下可以稳定保存1个月。建议按照实验用量，

提前分装保存。

Q3: 工作液稳定性如何

A3: 无法保存，建议现配现用。

Q4: 培养基中有酚红会影响检测吗？

A4：观察的时候，如果使用共聚焦激光显微镜的话，几乎不会受到酚红的影响，但是使用落射型荧光显微

镜的话，会观察到酚红色的背景。（参照以下观察数据）因此使用落射型荧光显微镜时，请在Working

solution进行染色时使用不含酚红的培养基或HBSS。

线粒体自噬—Mitophagy Detection Kit货号：MD01

Q5: 荧光显微镜推荐的滤镜是什么？

A5:根据各种试剂推荐以下波长。Mtphagy Dye：激发（500～560 nm）、发射（670～730 nm）

Lyso Dye：激发（350～450 nm）、发射（500～560 nm）

Q6:与其他深红色染料共同染色时的注意事项。

A6：Mtphagy Dye比一般的红色系荧光染料相比波长更长，所以和Deep Red的荧光染料一起染色的时候

需要特别注意。即Mtphagy Dye在500–560 nm处激发，可在670-730 nm处检测到荧光，这时与

MitoBright Deep Red的荧光检测波长重叠。因此，有必要在不激发深红色染料的波长下激发Mtphagy

染料，同时在不激发Mtphagy染料的波长下激发深红色染料。

[泄漏的情况]

① 制备仅添加了MitoBright Deep Red（没有添加Mtphagy Dye）的细胞。

② 通过观察MitoBright Deep Red的激发/发射波长，确认是否观察到荧光（右下图）。

③ 用Mtphagy Dye的激发/发射波长观察，确认是否观察到荧光（左下图）。

和③中，观察到来自MitoBright Deep Red的荧光（左下图）。

*如果如上所述确认荧光泄漏，请参阅以下内容。

○调整激发/发射波长

如以上确认如图所示，MitoBright Deep Red也在Ex 561 nm处激发，因此可以将Mtphagy Dye的激发

波长更改为接近激光器或滤光片的500 nm，以使MitoBright深红色不被激发。

调整荧光强度和荧光检测灵敏度

如果MitoBright Deep Red的荧光泄漏到Mtphagy染料的观察波长中，请将观察过程中的激发强度或

灵敏度降低到未观察到荧光的水平。

然后，再确认改变后的观察条件下可以检测Mtphagy Dye的荧光。

[如何检查泄漏]

使用Mtphagy Dye，Lyso dye（溶酶体染色剂），MitoBrightLT Deep Red（线粒体染色剂）

进行三重染色时进行确认

1.在3个培养皿或孔中制备细胞。

（Mtphagy Dye、Lyso Dye、MitoBright Deep Red分别在在不同的皿或孔中进行染色）

2.向每个孔中添加Mtphagy Dye和MitoBright Deep Red。（在无血清培养基中）

3.在37°C下孵育30分钟。

4.进行自噬诱导条件下（如饥饿培养等）进行培养。

5.向上述2.中未使用的细胞添加Lyso Dye。（在无血清培养基中）

6.在37°C下孵育30分钟。

7.观察每种试剂的激发波长和荧光波长以及荧光强度。

8.检查所用试剂以外的观察波长处的荧光是否没有泄漏。

[观察条件]

Lyso Dye：Ex：350-450 nm，Em：500-560 nm

Mtphagy Dye：Ex ： 500-560 nm，Em ：670-730 nm

MitoBright Deep Red：Ex ：640 nm，Em ：656-700 nm

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日本同仁化学线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09| DOJINDO

发表于2024年6月5日由Whatman官网

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线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

线粒体膜电位检测试剂盒

JC-1 MitoMP Detection Kit

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 灵敏度高

● 易上手

● 多种仪器均可检测

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常见问答

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选择规格：

1set

现货

易溶解

可使用于各种仪器

专用成像缓冲液

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线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

产品解说

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试剂盒内含

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产品特点

操作步骤

实验例

参考文献

常见问题Q&A

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NO.5. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬检测

试剂盒内含

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

产品概述

细胞中的线粒体作为有氧呼吸产生ATP的主要场所，是体内重要的细胞器之一，常被用于早期细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡等研究中¹⁾。线粒体活性的降低与机能失调，已被证实与癌症、衰老、神经退行性疾病 (如阿尔兹海默症、帕金森病等) 等密切相关²⁾³⁾。

JC-1是一种被广泛使用的小分子线粒体膜电位探针，依赖于线粒体膜电位在线粒体中聚集，染料伴随聚集过程，荧光从绿色 (530 nm) 变为红色 (590 nm)。当线粒体发生去极化，红/绿荧光强度比值降低。以往的研究者反映，JC-1不易溶于水并有大量沉淀产生。但与其他公司的产品不同，同仁化学研究所研制的JC-1试剂解决了这一问题，避免了沉淀的产生。同时使用试剂盒中配制的成像缓冲液 (Imaging Buffer)，可大幅降低荧光背景并在检测过程中保护细胞不受损伤。

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体不仅是细胞内产生能量的场所，它还与癌症、衰老、阿尔兹海默症、帕金森等神经变异性疾病密切相关。因此，针对线粒体状态的研究非常重要，其中线粒体膜电位的变化经常被作为重要的指标之一检测。

当线粒体正常、膜电位差保持不变时，JC-1会聚集并发出红色荧光，而当膜电位降低时，JC-1会作为单体存在并发出绿色荧光。红色和绿色荧光强度的变化可以作为检测线粒体状态的指标。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

2.初次使用也很容易上手

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

使用表达Parkin的HeLa细胞，分别使用线粒体自噬试剂盒（Mitophagy Detection Kit：MD01）和线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 MitoMP Detection Kit： MT09）来观察添加和不添加CCCP（羰基氰化物间氯苯）的线粒体状态的变化。

结果证明在未经CCCP处理的细胞中几乎未检测到线粒体自噬的发生，并且线粒体膜电位正常维持。而在添加了CCCP的细胞中，证实了线粒体膜电位的降低（JC-1的红色荧光的降低）和线粒体的自噬（Mtphagy染料的荧光的增强）。

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

向表达Parkin的HeLa细胞中添加0.1 μmol/l Mtphagy工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。然后将细胞用HBSS洗涤，加入10 μg/ml CCCP/MEM溶液，并在37℃下孵育2小时。荧光显微镜下观察处理后的细胞。

3.线粒体膜电位检测

将10 μg/ml的CCCP/MEM溶液添加至表达Parkin的HeLa细胞中，并在37℃下孵育1.5小时。加入4 μmol/l的JC-1工作溶液使终浓度至2 μmol/l，并将细胞溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后将细胞用HBSS洗涤，加入成像缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

结果证实了A549细胞的细胞周期确实发生了变化，同时用细胞衰老检测试剂盒–SPiDER-βGal（产品代码：SG03）证实了细胞产生衰老，实验证实了线粒体膜电位会发生变化。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

参考文献

No.	Sample Type	Instrument	Reference
1	Cell:A549	Microscope	K. Li, S. Sun, L. Xiao and Z. Zhang, “Bioactivity-guided fractionation of Helicteres angustifolia L. extract and its molecular evidence for tumor suppression”, Front Cell Dev Biol.,2023, doi: 10.3389/fcell.2023.1157172.
2	Cell:A549	Flow Cytometer	C. N. D’Alessandro-Gabazza, T. Yasuma, T. Kobayashi, M. Toda1, A. M. Abdel-Hamid, H. Fujimoto, O. Hataji, H. Nakahara, A. Takeshita, K. Nishihama, T. Okano, H. Saiki, Y. Okano, A. Tomaru, V. F. D’Alessandro, M. Shiraishi, A. Mizoguchi, R. Ono, J. Ohtsuka, M. Fukumura, T. Nosaka, X. Mi, D. Shukla, K. Kataoka, Y. Kondoh, M. Hirose, T. Arai, Y. Inoue, Y. Yano, R. I. Mackie, I. Cann and E. C. Gabazza, “Inhibition of lung microbiota-derived proapoptotic peptides ameliorates acute exacerbation of pulmonary fibrosis”, Nat. Comm., 2022, doi:10.1038/s41467-022-29064-3.
3	Cell:A549, HeLa	Plate reader	J. Yang, L. Liu, Y. Oda, K. Wada, M. Ago, S. Matsuda, M. Hattori, T. Goto, Y. Kawashima, Y. Matsuzaki and T. Taketani,”Highly-purified rapidly expanding clones, RECs, are superior for functional-mitochondrial transfer”, Stem Cell Res Ther., 2023, doi: 10.1186/s13287-023-03274-y.
4	Cell:ALM	Plate reader	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5	Cell:ARPE-19	Flow Cytometer/	J. Hamuro, T. Yamashita, Y. Otsuki, N. Hiramoto, M. Adachi, T. Miyatani, H. Tanaka, M. Ueno, S. Kinoshita and C. Sotozono,”Spatiotemporal Coordination of RPE Cell Quality by Extracellular Vesicle miR-494-3p Via Competitive Interplays With SIRT3 or PTEN”, Invest Ophthalmol Vis Sci., 2023, doi: 10.1167/iovs.64.5.9.
6	Cell:ARPE-19	Microscope	J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine., 2020, 15, 3695–3716.
7	Cell:C2C12, myocytes	–	Z. Jing, T. Iba, H. Naito, P. Xu, J.I. Morishige, N. Nagata, H. Okubo and H.Ando ,”L-carnitine prevents lenvatinib-induced muscle toxicity without impairment of the anti-angiogenic efficacy”, Front Pharmacol., 2023, doi: 10.3389/fphar.2023.1182788.
8	Cell:C2C12, 3T3L1	Plate reader	M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
9	Cell:Colon 26	Microscope	B. Uranbileg, M. Kurano, K. Kano, E. Sakai, J. Arita, K. Hasegawa, T. Nishikawa, S. Ishihara, H. Yamashita, Y. Seto, H. Ikeda, J. Aoki and Y. Yatomi,”Sphingosine 1‐phosphate lyase facilitates cancer progression through converting sphingolipids to glycerophospholipids”, Clin Transl Med., 2022, doi: 10.1002/ctm2.1056.
10	Tissue: Frozen heart slides	Microscope	W. Yu, Y. Hu, Z. Liu, K. Guo, D. Ma, M. Peng, Y. Wang, J. Zhang, X. Zhang, P. Wang, J. Zhang, P. Liu and J. Lu,”Sorting nexin 3 exacerbates doxorubicin-induced cardiomyopathy via regulation of TFRC-dependent ferroptosis”, Acta Pharmaceutica Sinica B., 2023, doi: https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.08.016.
11	Cell:HCE	Microscope	T. Yamashita, K. Asada, M. Ueno, N. Hiramoto, T. Fujita, M. Toda, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”Cellular interplay through extracellular vesicle miR-184 alleviates corneal endothelium degeneration”, Ophthalmol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.xops.2022.100212.
12	Cell:HCE	Microscope	M. Ueno, K Yoshii, T. Yamashita, K. Sonomura, K. Asada, E. Ito, T. Fujita, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”The Interplay Between Metabolites and MicroRNAs in Aqueous Humor to Coordinate Corneal Endothelium Integrity”, Ophthalmol Sci., 2023, doi: 10.1016/j.xops.2023.100299.
13	Cell:HCE-T	–	W. Otsu, T. Yako, E. Sugisawa, S. Nakamura, H. Tsusaki, N. Umigai, M. Shimazawa and H. Hara,”Crocetin protects against mitochondrial damage induced by UV-A irradiation in corneal epithelial cell line HCE-T cells”, J Pharmacol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.jphs.2022.10.005.
14	Cell:HCE-T	Microscope	K. Ishida, T. Yako, M. Tanaka, W. Otsu, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Tsusaki and H. Hara,”Free-radical scavenger NSP-116 protects the corneal epithelium against UV-A and blue led light exposure”, Biol Pharm Bull., 2021, doi: 10.1248/bpb.b21-00017.
15	Cell:HepG	Microscope/Spectrophotometer	M. Ikura, K. Furuya, T. Matsuda and T. Ikura,”Impact of Nuclear De Novo NAD+ Synthesis via Histone Dynamics on DNA Repair during Cellular Senescence To Prevent Tumorigenesis”, Mol Cell Biol., 2022, doi: 10.1128/mcb.00379-22.
16	Cell:hiPSCs, Neurons	Microscope	T. Hara, M. Toyoshima, Y. Hisano, S. Balan, Y. Iwayama, H. Aono,Y. Futamura, H. Osada, Y. Owada and T. Yoshikawa,”Glyoxalase I disruption and external carbonyl stress impair mitochondrial function in human induced pluripotent stem cells and derived neurons”, Translational Psychiatry., 2021, doi: 10.1038/s41398-021-01392-w.
17	Cell:HSCs	Microscope	Y. Su, S. Lu, C. Hou, K. Ren, M. Wang, X. Liu, S. Zhao and X. Liu ,”Mitigation of liver fibrosis via hepatic stellate cells mitochondrial apoptosis induced by metformin”, International Immunopharmacology., 2022, doi: 10.1016/j.intimp.2022.108683.
18	Cell:HUVECs	Microscope	D. Ueno, K. Ikeda, E. Yamazaki, A. Katayama, R. Urata and S. Matoba ,”Spermidine improves angiogenic capacity of senescent endothelial cells, and enhances ischemia-induced neovascularization in aged mice”, Sci Rep., 2023, doi: 10.1038/s41598-023-35447-3.
19	Cell:KYSE30	Microscope	Q. Luo, X. Wu, P. Zhao, Y. Nan, W. Chang, X. Zhu, D. Su and Z. Liu,”OTUD1 activates caspase‐independent and caspase‐dependent apoptosis by promoting AIF nuclear translocation and MCL1 degradation”, Adv Sci (Weinh)., 2021, doi: 10.1002/advs.202002874.
20	Cell: Macrophage	Microscope	G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
21	Cell:MDA-MB-415, MCF-7	Microscope	S.Y. Park, K.J. Jeong, A. Poire, D. Zhang, Y.H. Tsang, A.S. Blucher and G.B. Mills ,”Irreversible HER2 inhibitors overcome resistance to the RSL3 ferroptosis inducer in non-HER2 amplified luminal breast cancer”, Cell Death & Disease., 2023, doi: 10.1038/s41419-023-06042-1.
22	Cell:MIN6	Plate reader/Microscope	N. Mizusawa, N. Harada, T. Iwata, I. Ohigashi, M. Itakura and K. Yoshimoto,”Identification of protease serine S1 family member 53 as a mitochondrial protein in murine islet beta cells”, Islets., 2022, doi: 10.1080/19382014.2021.1982325.
23	Cell:MSCs	Flow Cytometer	S.Y. Jo, H.J. Cho and T.M. Kim,”Fenoldopam mesylate enhances the survival of mesenchymal stem cells under oxidative stress and increases the therapeutic function in acute kidney injury”, Cell Transplant., 2023, doi: 10.1177/09636897221147920.
24	Cell:Neuro-2A	Microscope、Plate reader	Y. Wang, Y. Shinoda, A. Cheng, I. Kawahata and K. Fukunaga,”Epidermal fatty acid-binding protein 5 (FABP5) Involvement in alpha-synuclein-induced mitochondrial injury under oxidative stress”, Biomedicines., 2021, doi: 10.3390/biomedicines9020110.
25	Cell:Neuron	Microscope	I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , “Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358.
26	Cell:Neuron	Microscope	A. Fukuda, S. Nakashima,Y. Oda, K. Nishimura, H. Kawashima, H. Kimura, T. Ohgita, E. Kawashita, K. Ishihara, A. Hanaki, M. Okazaki, E. Matsuda, Y. Tanaka, S. Nakamura, T. Matsumoto, S. Akiba, H. Saito, H. Matsuda and K. Takata,”Plantainoside B in Bacopa monniera Binds to Aβ Aggregates Attenuating Neuronal Damage and Memory Deficits Induced by Aβ”, Biol Pharm Bull., 2023, doi: 10.1248/bpb.b22-00797.
27	Cell:PAECs	Plate reader	T. Sakai, H. Takagaki, N. Yamagiwa, M. Ui, S. Hatta and J. Imai,”Effects of the cytoplasm and mitochondrial specific hydroxyl radical scavengers TA293 and mitoTA293 in bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mice”, Antioxidants (Basel)., 2021, doi: 10.3390/antiox10091398.
28	Cell:PANC-1	Plate reader	W.A. Naime, A. Kimishima, A. Setiawan, J.R. Fahim, M.A. Fouad, M.S. Kamel and M. Arai,”Mitochondrial Targeting in an Anti-Austerity Approach Involving Bioactive Metabolites Isolated from the Marine-Derived Fungus Aspergillus sp.”, Marine drugs., 2020, doi: 10.3390/md18110555.
29	Cell:PANC-1, MIAPaca-2	Microscope	T. Taniai, Y. Shirai,Y. Shimada, R. Hamura, M. Yanagaki, N. Takada, T. Horiuchi, K. Haruki, K. Furukawa, T. Uwagawa, K. Tsuboi, Y. Okamoto, S. Shimada, S. Tanaka, T. Ohashi and T. Ikegami,”Inhibition of acid ceramidase elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress in pancreatic cancer cells”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.15123.
30	Cell:PC	Flow Cytometer	R. Hamura, Y. Shirai,Y. Shimada, N. Saito, T. Taniai, T. Horiuchi, N. Takada, Y. Kanegae, T. Ikegami, T. Ohashi and K. Yanaga ,”Suppression of lysosomal acid alpha‐glucosidase impacts the modulation of transcription factor EB translocation in pancreatic cancer”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.14921.
31	Cell:Porcine oocytes	Microscope	W. Hu, Y. Zhang, D. Wang, T. Yang, J. Qi, Y. Zhang, H. Jiang, J Zhang, B. Sun and S. Liang,”Iron Overload-Induced Ferroptosis Impairs Porcine Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in vitro”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.673291.
32	Cell:Porcine oocytes	Microscope	Y. Xiao, B. Yuan, W. Hu, J. Qi, H. Jiang, B. Sun, J. Zhang and S. Liang,”Tributyltin Oxide Exposure During in vitro Maturation Disrupts Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in Pigs”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.683448.
33	Cell:RGC-5	Plate reader	Y. Aoyama, S. Inagaki, K. Aoshima, Y. Iwata, S. Nakamura, H. Hara and M. Shimazawa,”Involvement of endoplasmic reticulum stress in rotenone-induced leber hereditary optic neuropathy model and the discovery of new therapeutic agents”, J Pharmacol Sci . .,2021, doi: 10.1016/j.jphs.2021.07.003.
34	Cell:SAS,HSC-2	Plate reader	K. Yamana, J. Inoue, R. Yoshida, J. Sakata, H. Nakashima, H. Arita, S. Kawaguchi, S. Gohara, Y. Nagao, H. Takeshita, M. Maeshiro, R. Liu, Y. Matsuoka, M. Hirayama, K. Kawahara, M. Nagata, A. Hirosue, R. Toya, R. Murakami, Y. Kuwahara, M. Fukumoto and H. Nakayama,”Extracellular vesicles derived from radioresistant oral squamous cell carcinoma cells contribute to the acquisition of radioresistance via the miR‐503‐3p‐BAK axis”, J Extracell Vesicles., 2021, doi: 10.1002/jev2.12169.
35	Cell:SBC-3	Flow Cytometer	N. Takahashi, T. Iguchi, M. Kuroda, M. Mishima and Y. Mimaki,”Novel Oleanane-Type Triterpene Glycosides from the Saponaria officinalis L. Seeds and Apoptosis-Inducing Activity via Mitochondria”, Int J Mol Sci., 2022, doi: 10.3390/ijms23042047.
36	Cell:SH-SY5Y	Microscope	Q. Guo, I. Kawahata, A. Cheng, H. Wang, W. Jia, H. Yoshino and K. Fukunaga,”Fatty acid-binding proteins 3 and 5 are involved in the initiation of mitochondrial damage in ischemic neurons”, Redox Biology., 2023, doi: 10.1016/j.redox.2022.102547.
37	Cell:SiHa	Microscope	F.F. Gao, J.H. Quan, M.A. Lee, W. Ye, J.M. Yuk, G.H. Cha, I.W. Choi and Y.H. Lee,”Trichomonas vaginalis induces apoptosis via ROS and ER stress response through ER–mitochondria crosstalk in SiHa cells”, Parasites &vectors., 2021, doi: 10.1186/s13071-021-05098-2.
38	Cell:SU-DHL-2	Flow Cytometer	Q. Zhao, D. Jiang, X. Sun, Q. Mo, S. Chen, W. Chen, R. Gui and X. Ma,”Biomimetic nanotherapy: core–shell structured nanocomplexes based on the neutrophil membrane for targeted therapy of lymphoma”, J Nanobiotechnology., 2021, doi: 10.1186/s12951-021-00922-4.
39	Cell:THP-1	Microscope	W. Zheng, Z. Zhou, Y. Rui, R. Ye, F. Xia, F. Guo, X. Liu, J. Su, M. Lou, and X.F. Yu,”TRAF3 activates STING-mediated suppression of EV-A71 and target of viral evasion”, Signal Transduct Target Ther., 2023, doi: 10.1038/s41392-022-01287-2.
40	Cell:TSM15	In Cell Analyzer	M. Honda, F. Shimizu, R. Sato, Y. Mizukami, K. Watanabe, Y. Takeshita, T. Maeda, M. Koga and T. Kanda,”Jo-1 Antibodies From Myositis Induce Complement-Dependent Cytotoxicity and TREM-1 Upregulation in Muscle Endothelial Cells”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2023, doi: 10.1212/NXI.0000000000200116.
41	Cell:tumor	Flow Cytometer	H. Wang, X. Rong, G. Zhao, Y. Zhou, Y. Xiao, D. Ma, X. Jin, Y. Wu, Y. Yan, H. Yang, Y. Zhou, M. Qian, C. Niu, X. Hu, D.Q. Li, Q. Liu, Y. Wen, Y.Z. Jiang, C. Zhao and Z.M. Shao ,”The microbial metabolite trimethylamine N-oxide promotes antitumor immunity in triple-negative breast cancer”, Cell Metab., 2022, doi: 10.1016/j.cmet.2022.02.010.
42	Cell:TY10	In Cell Analyzer	F. Shimizu, R. Ogawa, Y. Mizukami, K. Watanabe, K. Hara, C. Kadono, T. Takahashi, T. Misu, Y. Takeshita, Y. Sano, M. Fujisawa, T. Maeda, I. Nakashima, K. Fujihara and T. Kanda,”GRP78 antibodies are associated with blood-brain barrier breakdown in anti–myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody–associated disorder”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2022, doi: 10.1212/NXI.0000000000001038.
43	Cell:U2OS, HeLa	Microscope	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置	容器	使用次数	液量
流式细胞仪	–	100次	0.5 ml/次
荧光显微镜荧光酶标仪	35 mm dish	25块板	2 ml/孔
	8孔Chamber Slide	30块板	200 μl/孔
	96孔板	5块板	100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

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日本同仁化学线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09| DOJINDO

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上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学 DOJINDO代理商全线产品，欢迎访问官网了解更多信息

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

线粒体膜电位检测试剂盒

JC-1 MitoMP Detection Kit

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 灵敏度高

● 易上手

● 多种仪器均可检测

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实验例

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常见问题Q&A

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试剂盒内含

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

产品概述

当JC-1工作液的浓度为2 μmol/l, 每次用量为100 μl时，可以检测500次。

产品特点

1.为什么要检测线粒体膜电位

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

2.初次使用也很容易上手

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

3.去极化的检测实例

使用去极化剂carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）对HeLa细胞进行处理，用本试

剂盒进行检测。可以发现与未加药物的细胞相比，加药组细胞的红色荧光明显减少。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

实验条件

JC-1浓度： 2 μmol/l in MEM, 染色时间30 min

FCCP浓度：100 μmol/l， FCCP处理时间1 h

检测条件

Green : Ex 488 nm/ Em 500-550 nm;

Red : Ex 561 nm/ Em 560-610 nm;

标尺: 20 μm

操作步骤

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

实验例

1.诱导凋亡的实验例

1.1 荧光显微镜

通过荧光颜色的改变判断由凋亡导致的线粒体膜电位的变化。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm

Red : Ex 561 nm / Em 560-610 nm

标尺: 80 μm

1.2 流式细胞仪

定量分析单个细胞的膜电位变化

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

检测条件

Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm

Red : Ex 488 nm / Em 564-604 nm

1.3 酶标仪

确认孔板中吸光度来判断线粒体膜电位的变化

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

检测条件

Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm

Red : Ex 535 nm / Em 585-605 nm

2.诱导自噬的实验例

<检测条件>

线粒体自噬检测

Ex：561 nm，Em：570-700 nm

线粒体膜电位检测

绿色Ex：488 nm，Em：500-550 nm

红色Ex：561 nm，Em：560-610 nm

实验条件

1.将Parkin质粒导入HeLa细胞

使用HilyMax（货号：H357）将Parkin质粒引入HeLa细胞中（Parkin质粒/HilyMax试剂：0.1 μg/0.2 μl）

然后过夜培养，收集细胞进行以下检测。

2.自噬检测

3.线粒体膜电位检测

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

3.线粒体膜电位与细胞周期关联性

将已知能在细胞周期的G2/M期起作用以终止细胞增殖并诱导细胞衰老的阿霉素（DOX）加入A549细胞后，

使用细胞周期检测试剂盒蓝色（产品代码：C549）/深红色（产品代码：C548）后检测。

线粒体膜电位检测试剂盒—JC-1 MitoMP Detection Kit货号：MT09

参考文献

No.	Sample Type	Instrument	Reference
1	Cell:A549	Microscope	K. Li, S. Sun, L. Xiao and Z. Zhang, “Bioactivity-guided fractionation of Helicteres angustifolia L. extract and its molecular evidence for tumor suppression”, Front Cell Dev Biol.,2023, doi: 10.3389/fcell.2023.1157172.
2	Cell:A549	Flow Cytometer	C. N. D’Alessandro-Gabazza, T. Yasuma, T. Kobayashi, M. Toda1, A. M. Abdel-Hamid, H. Fujimoto, O. Hataji, H. Nakahara, A. Takeshita, K. Nishihama, T. Okano, H. Saiki, Y. Okano, A. Tomaru, V. F. D’Alessandro, M. Shiraishi, A. Mizoguchi, R. Ono, J. Ohtsuka, M. Fukumura, T. Nosaka, X. Mi, D. Shukla, K. Kataoka, Y. Kondoh, M. Hirose, T. Arai, Y. Inoue, Y. Yano, R. I. Mackie, I. Cann and E. C. Gabazza, “Inhibition of lung microbiota-derived proapoptotic peptides ameliorates acute exacerbation of pulmonary fibrosis”, Nat. Comm., 2022, doi:10.1038/s41467-022-29064-3.
3	Cell:A549, HeLa	Plate reader	J. Yang, L. Liu, Y. Oda, K. Wada, M. Ago, S. Matsuda, M. Hattori, T. Goto, Y. Kawashima, Y. Matsuzaki and T. Taketani,”Highly-purified rapidly expanding clones, RECs, are superior for functional-mitochondrial transfer”, Stem Cell Res Ther., 2023, doi: 10.1186/s13287-023-03274-y.
4	Cell:ALM	Plate reader	T. Nechiporuk, S.E. Kurtz, O. Nikolova, T. Liu, C.L. Jones, A. D. Alessandro, R. C. Hill, A. Almeida, S. K. Joshi, M. Rosenberg, C. E. Tognon, A. V. Danilov, B. J. Druker, B. H. Chang, S. K McWeeney and J. W. Tyner , “The TP53 Apoptotic Network Is a Primary Mediator of Resistance to BCL2 Inhibition in AML Cells.”, Cancer Discov, 2019, 9,
5	Cell:ARPE-19	Flow Cytometer/	J. Hamuro, T. Yamashita, Y. Otsuki, N. Hiramoto, M. Adachi, T. Miyatani, H. Tanaka, M. Ueno, S. Kinoshita and C. Sotozono,”Spatiotemporal Coordination of RPE Cell Quality by Extracellular Vesicle miR-494-3p Via Competitive Interplays With SIRT3 or PTEN”, Invest Ophthalmol Vis Sci., 2023, doi: 10.1167/iovs.64.5.9.
6	Cell:ARPE-19	Microscope	J. H. Quan, F. F. Gao, H. A. Ismail, J. M. Yuk, G. H. Cha, J. Q. Chu and Y. H. Lee, “Silver Nanoparticle-Induced Apoptosis in ARPE-19 Cells Is Inhibited by Toxoplasma gondii Pre-Infection Through Suppression of NOX4-Dependent ROS Generation”, Int J Nanomedicine., 2020, 15, 3695–3716.
7	Cell:C2C12, myocytes	–	Z. Jing, T. Iba, H. Naito, P. Xu, J.I. Morishige, N. Nagata, H. Okubo and H.Ando ,”L-carnitine prevents lenvatinib-induced muscle toxicity without impairment of the anti-angiogenic efficacy”, Front Pharmacol., 2023, doi: 10.3389/fphar.2023.1182788.
8	Cell:C2C12, 3T3L1	Plate reader	M. Kurano, K. Tsukamoto, T. Shimizu, H. Kassai, K. Nakao, A. Aiba, M. Hara and Yatomi , “Protection Against Insulin Resistance by Apolipoprotein M/Sphingosine 1-Phosphate “, Diabetes, 2020, DOI: 10.2337/db19-0811.
9	Cell:Colon 26	Microscope	B. Uranbileg, M. Kurano, K. Kano, E. Sakai, J. Arita, K. Hasegawa, T. Nishikawa, S. Ishihara, H. Yamashita, Y. Seto, H. Ikeda, J. Aoki and Y. Yatomi,”Sphingosine 1‐phosphate lyase facilitates cancer progression through converting sphingolipids to glycerophospholipids”, Clin Transl Med., 2022, doi: 10.1002/ctm2.1056.
10	Tissue: Frozen heart slides	Microscope	W. Yu, Y. Hu, Z. Liu, K. Guo, D. Ma, M. Peng, Y. Wang, J. Zhang, X. Zhang, P. Wang, J. Zhang, P. Liu and J. Lu,”Sorting nexin 3 exacerbates doxorubicin-induced cardiomyopathy via regulation of TFRC-dependent ferroptosis”, Acta Pharmaceutica Sinica B., 2023, doi: https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.08.016.
11	Cell:HCE	Microscope	T. Yamashita, K. Asada, M. Ueno, N. Hiramoto, T. Fujita, M. Toda, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”Cellular interplay through extracellular vesicle miR-184 alleviates corneal endothelium degeneration”, Ophthalmol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.xops.2022.100212.
12	Cell:HCE	Microscope	M. Ueno, K Yoshii, T. Yamashita, K. Sonomura, K. Asada, E. Ito, T. Fujita, C. Sotozono, S. Kinoshita and J. Hamuro,”The Interplay Between Metabolites and MicroRNAs in Aqueous Humor to Coordinate Corneal Endothelium Integrity”, Ophthalmol Sci., 2023, doi: 10.1016/j.xops.2023.100299.
13	Cell:HCE-T	–	W. Otsu, T. Yako, E. Sugisawa, S. Nakamura, H. Tsusaki, N. Umigai, M. Shimazawa and H. Hara,”Crocetin protects against mitochondrial damage induced by UV-A irradiation in corneal epithelial cell line HCE-T cells”, J Pharmacol Sci., 2022, doi: 10.1016/j.jphs.2022.10.005.
14	Cell:HCE-T	Microscope	K. Ishida, T. Yako, M. Tanaka, W. Otsu, S. Nakamura, M. Shimazawa, H. Tsusaki and H. Hara,”Free-radical scavenger NSP-116 protects the corneal epithelium against UV-A and blue led light exposure”, Biol Pharm Bull., 2021, doi: 10.1248/bpb.b21-00017.
15	Cell:HepG	Microscope/Spectrophotometer	M. Ikura, K. Furuya, T. Matsuda and T. Ikura,”Impact of Nuclear De Novo NAD+ Synthesis via Histone Dynamics on DNA Repair during Cellular Senescence To Prevent Tumorigenesis”, Mol Cell Biol., 2022, doi: 10.1128/mcb.00379-22.
16	Cell:hiPSCs, Neurons	Microscope	T. Hara, M. Toyoshima, Y. Hisano, S. Balan, Y. Iwayama, H. Aono,Y. Futamura, H. Osada, Y. Owada and T. Yoshikawa,”Glyoxalase I disruption and external carbonyl stress impair mitochondrial function in human induced pluripotent stem cells and derived neurons”, Translational Psychiatry., 2021, doi: 10.1038/s41398-021-01392-w.
17	Cell:HSCs	Microscope	Y. Su, S. Lu, C. Hou, K. Ren, M. Wang, X. Liu, S. Zhao and X. Liu ,”Mitigation of liver fibrosis via hepatic stellate cells mitochondrial apoptosis induced by metformin”, International Immunopharmacology., 2022, doi: 10.1016/j.intimp.2022.108683.
18	Cell:HUVECs	Microscope	D. Ueno, K. Ikeda, E. Yamazaki, A. Katayama, R. Urata and S. Matoba ,”Spermidine improves angiogenic capacity of senescent endothelial cells, and enhances ischemia-induced neovascularization in aged mice”, Sci Rep., 2023, doi: 10.1038/s41598-023-35447-3.
19	Cell:KYSE30	Microscope	Q. Luo, X. Wu, P. Zhao, Y. Nan, W. Chang, X. Zhu, D. Su and Z. Liu,”OTUD1 activates caspase‐independent and caspase‐dependent apoptosis by promoting AIF nuclear translocation and MCL1 degradation”, Adv Sci (Weinh)., 2021, doi: 10.1002/advs.202002874.
20	Cell: Macrophage	Microscope	G. Yang, M. Fan, J. Zhu, C. Ling, L. Wu, X. Zhang, M. Zhang, J. Li, Q. Yao, Z. Gu and X. Cai, “A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages massively deplete intracellular H2O2 and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osreoarthritis” , Biomaterials, 2020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
21	Cell:MDA-MB-415, MCF-7	Microscope	S.Y. Park, K.J. Jeong, A. Poire, D. Zhang, Y.H. Tsang, A.S. Blucher and G.B. Mills ,”Irreversible HER2 inhibitors overcome resistance to the RSL3 ferroptosis inducer in non-HER2 amplified luminal breast cancer”, Cell Death & Disease., 2023, doi: 10.1038/s41419-023-06042-1.
22	Cell:MIN6	Plate reader/Microscope	N. Mizusawa, N. Harada, T. Iwata, I. Ohigashi, M. Itakura and K. Yoshimoto,”Identification of protease serine S1 family member 53 as a mitochondrial protein in murine islet beta cells”, Islets., 2022, doi: 10.1080/19382014.2021.1982325.
23	Cell:MSCs	Flow Cytometer	S.Y. Jo, H.J. Cho and T.M. Kim,”Fenoldopam mesylate enhances the survival of mesenchymal stem cells under oxidative stress and increases the therapeutic function in acute kidney injury”, Cell Transplant., 2023, doi: 10.1177/09636897221147920.
24	Cell:Neuro-2A	Microscope、Plate reader	Y. Wang, Y. Shinoda, A. Cheng, I. Kawahata and K. Fukunaga,”Epidermal fatty acid-binding protein 5 (FABP5) Involvement in alpha-synuclein-induced mitochondrial injury under oxidative stress”, Biomedicines., 2021, doi: 10.3390/biomedicines9020110.
25	Cell:Neuron	Microscope	I. Kawahata, L. Luc Bousset, R. Melki and K. Fukunaga , “Fatty Acid-Binding Protein 3 is Critical for α-Synuclein Uptake and MPP+-Induced Mitochondrial Dysfunction in Cultured Dopaminergic Neurons “, Int J Mol Sci., 2019, 20, 5358.
26	Cell:Neuron	Microscope	A. Fukuda, S. Nakashima,Y. Oda, K. Nishimura, H. Kawashima, H. Kimura, T. Ohgita, E. Kawashita, K. Ishihara, A. Hanaki, M. Okazaki, E. Matsuda, Y. Tanaka, S. Nakamura, T. Matsumoto, S. Akiba, H. Saito, H. Matsuda and K. Takata,”Plantainoside B in Bacopa monniera Binds to Aβ Aggregates Attenuating Neuronal Damage and Memory Deficits Induced by Aβ”, Biol Pharm Bull., 2023, doi: 10.1248/bpb.b22-00797.
27	Cell:PAECs	Plate reader	T. Sakai, H. Takagaki, N. Yamagiwa, M. Ui, S. Hatta and J. Imai,”Effects of the cytoplasm and mitochondrial specific hydroxyl radical scavengers TA293 and mitoTA293 in bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mice”, Antioxidants (Basel)., 2021, doi: 10.3390/antiox10091398.
28	Cell:PANC-1	Plate reader	W.A. Naime, A. Kimishima, A. Setiawan, J.R. Fahim, M.A. Fouad, M.S. Kamel and M. Arai,”Mitochondrial Targeting in an Anti-Austerity Approach Involving Bioactive Metabolites Isolated from the Marine-Derived Fungus Aspergillus sp.”, Marine drugs., 2020, doi: 10.3390/md18110555.
29	Cell:PANC-1, MIAPaca-2	Microscope	T. Taniai, Y. Shirai,Y. Shimada, R. Hamura, M. Yanagaki, N. Takada, T. Horiuchi, K. Haruki, K. Furukawa, T. Uwagawa, K. Tsuboi, Y. Okamoto, S. Shimada, S. Tanaka, T. Ohashi and T. Ikegami,”Inhibition of acid ceramidase elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress in pancreatic cancer cells”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.15123.
30	Cell:PC	Flow Cytometer	R. Hamura, Y. Shirai,Y. Shimada, N. Saito, T. Taniai, T. Horiuchi, N. Takada, Y. Kanegae, T. Ikegami, T. Ohashi and K. Yanaga ,”Suppression of lysosomal acid alpha‐glucosidase impacts the modulation of transcription factor EB translocation in pancreatic cancer”, Cancer Sci., 2021, doi: 10.1111/cas.14921.
31	Cell:Porcine oocytes	Microscope	W. Hu, Y. Zhang, D. Wang, T. Yang, J. Qi, Y. Zhang, H. Jiang, J Zhang, B. Sun and S. Liang,”Iron Overload-Induced Ferroptosis Impairs Porcine Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in vitro”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.673291.
32	Cell:Porcine oocytes	Microscope	Y. Xiao, B. Yuan, W. Hu, J. Qi, H. Jiang, B. Sun, J. Zhang and S. Liang,”Tributyltin Oxide Exposure During in vitro Maturation Disrupts Oocyte Maturation and Subsequent Embryonic Developmental Competence in Pigs”, Front Cell Dev Biol., 2021, doi: 10.3389/fcell.2021.683448.
33	Cell:RGC-5	Plate reader	Y. Aoyama, S. Inagaki, K. Aoshima, Y. Iwata, S. Nakamura, H. Hara and M. Shimazawa,”Involvement of endoplasmic reticulum stress in rotenone-induced leber hereditary optic neuropathy model and the discovery of new therapeutic agents”, J Pharmacol Sci . .,2021, doi: 10.1016/j.jphs.2021.07.003.
34	Cell:SAS,HSC-2	Plate reader	K. Yamana, J. Inoue, R. Yoshida, J. Sakata, H. Nakashima, H. Arita, S. Kawaguchi, S. Gohara, Y. Nagao, H. Takeshita, M. Maeshiro, R. Liu, Y. Matsuoka, M. Hirayama, K. Kawahara, M. Nagata, A. Hirosue, R. Toya, R. Murakami, Y. Kuwahara, M. Fukumoto and H. Nakayama,”Extracellular vesicles derived from radioresistant oral squamous cell carcinoma cells contribute to the acquisition of radioresistance via the miR‐503‐3p‐BAK axis”, J Extracell Vesicles., 2021, doi: 10.1002/jev2.12169.
35	Cell:SBC-3	Flow Cytometer	N. Takahashi, T. Iguchi, M. Kuroda, M. Mishima and Y. Mimaki,”Novel Oleanane-Type Triterpene Glycosides from the Saponaria officinalis L. Seeds and Apoptosis-Inducing Activity via Mitochondria”, Int J Mol Sci., 2022, doi: 10.3390/ijms23042047.
36	Cell:SH-SY5Y	Microscope	Q. Guo, I. Kawahata, A. Cheng, H. Wang, W. Jia, H. Yoshino and K. Fukunaga,”Fatty acid-binding proteins 3 and 5 are involved in the initiation of mitochondrial damage in ischemic neurons”, Redox Biology., 2023, doi: 10.1016/j.redox.2022.102547.
37	Cell:SiHa	Microscope	F.F. Gao, J.H. Quan, M.A. Lee, W. Ye, J.M. Yuk, G.H. Cha, I.W. Choi and Y.H. Lee,”Trichomonas vaginalis induces apoptosis via ROS and ER stress response through ER–mitochondria crosstalk in SiHa cells”, Parasites &vectors., 2021, doi: 10.1186/s13071-021-05098-2.
38	Cell:SU-DHL-2	Flow Cytometer	Q. Zhao, D. Jiang, X. Sun, Q. Mo, S. Chen, W. Chen, R. Gui and X. Ma,”Biomimetic nanotherapy: core–shell structured nanocomplexes based on the neutrophil membrane for targeted therapy of lymphoma”, J Nanobiotechnology., 2021, doi: 10.1186/s12951-021-00922-4.
39	Cell:THP-1	Microscope	W. Zheng, Z. Zhou, Y. Rui, R. Ye, F. Xia, F. Guo, X. Liu, J. Su, M. Lou, and X.F. Yu,”TRAF3 activates STING-mediated suppression of EV-A71 and target of viral evasion”, Signal Transduct Target Ther., 2023, doi: 10.1038/s41392-022-01287-2.
40	Cell:TSM15	In Cell Analyzer	M. Honda, F. Shimizu, R. Sato, Y. Mizukami, K. Watanabe, Y. Takeshita, T. Maeda, M. Koga and T. Kanda,”Jo-1 Antibodies From Myositis Induce Complement-Dependent Cytotoxicity and TREM-1 Upregulation in Muscle Endothelial Cells”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2023, doi: 10.1212/NXI.0000000000200116.
41	Cell:tumor	Flow Cytometer	H. Wang, X. Rong, G. Zhao, Y. Zhou, Y. Xiao, D. Ma, X. Jin, Y. Wu, Y. Yan, H. Yang, Y. Zhou, M. Qian, C. Niu, X. Hu, D.Q. Li, Q. Liu, Y. Wen, Y.Z. Jiang, C. Zhao and Z.M. Shao ,”The microbial metabolite trimethylamine N-oxide promotes antitumor immunity in triple-negative breast cancer”, Cell Metab., 2022, doi: 10.1016/j.cmet.2022.02.010.
42	Cell:TY10	In Cell Analyzer	F. Shimizu, R. Ogawa, Y. Mizukami, K. Watanabe, K. Hara, C. Kadono, T. Takahashi, T. Misu, Y. Takeshita, Y. Sano, M. Fujisawa, T. Maeda, I. Nakashima, K. Fujihara and T. Kanda,”GRP78 antibodies are associated with blood-brain barrier breakdown in anti–myelin oligodendrocyte glycoprotein antibody–associated disorder”, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm., 2022, doi: 10.1212/NXI.0000000000001038.
43	Cell:U2OS, HeLa	Microscope	T. Namba, “BAP31 regulates mitochondrial function via interaction with Tom40 within ER-mitochondria contact sites “, Sci Adv., 2019, 5, (6), 1386.

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒可以检测多少次？

A1:大概的使用次数请参考下表：

检测装置	容器	使用次数	液量
流式细胞仪	–	100次	0.5 ml/次
荧光显微镜荧光酶标仪	35 mm dish	25块板	2 ml/孔
	8孔Chamber Slide	30块板	200 μl/孔
	96孔板	5块板	100 μl/孔

Q2：在JC-1染色后，可以使用PBS代替HBSS洗涤吗？

A2：我们建议使用HBSS来减少对细胞的损伤。如果您手边没有HBSS的话，建议使用培养基洗净。

Q3：可以使用含血清的培养基吗？

A3：在清洗细胞和Working Solution中可以使用含血清的培养基。在观察荧光时建议使用Imaging Buffer。如果一定要使用含血清的培养基的话，建议不要加酚红。

Q4：染色后细胞固定或者固定后进行染色可以实现吗？

A4：细胞固定操作会使得线粒体去极化，所以染色前后均不能进行细胞固定。

Q5：处理后的样品与对照组相比较，红和绿两种荧光值都增加（或减少）了，结果该如何解释？

A5：请先比较实验组和对照组的荧光比值，两者相比，荧光比越低，线粒体膜电位越低。

用荧光之比进行结果分析的理由。

JC-1由于膜电位依存性地在细胞中积蓄，根据细胞的状态，每个细胞的JC-1的浓度有可能不同。

由于对照组和实验组处理样品的细胞状态不同，JC-1的累积浓度不同。)

另外，在线粒体膜电位较高的状态下，JC-1会聚集在一起，使荧光从绿色转移到红色。

该聚集体的量取决于膜电位的程度，因此可以用红/绿之比来比较样品之间的线粒体膜电位。

＜参考文献＞

1) Cossarizza, A. et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) Perelman, A. et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430

3) Smiley, S. T. et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

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DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

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Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤

商品信息

储存条件：0-5°C，注意防止吸潮

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选择规格：

1 set

期货

无需另外准备试剂

操作简便

3色可选

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

试剂盒内含

性质

DNA损伤检测原理

试剂盒特点

细胞衰老实验例

常见问题Q&A

试剂盒内含

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

性质

该试剂盒，可通过二抗的方法轻松检测出作为DNA损伤的指标γH2AX。本试剂盒内包含了实验所需的所有试剂，即使是第一次使用的人操作起来也很方便，并且我们还将介绍使用γH2AX作为指标的文献及实验例以供参考。

DNA损伤检测原理

DNA损伤中经常会出现DNA双链断裂，H2AX（一种组蛋白H2X的亚种），当出现DNA双链断裂时，会迅速而大量地被磷酸化。这种磷酸化的H2AX（γH2AX），作为DNA损伤的标志物，有望被用来作为评估化学物质，活性氧，紫外线，辐射等的遗传毒性和致癌性。近年来，γH2AX的检测也被用来作为评价细胞衰老的一种指标。

该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

试剂盒特点

<试剂盒内已包含所有需要试剂>

所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。

<操作简便>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

<3色可选>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red货号：G267

产品名称	荧光	激发发射波长
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Green	绿色	λex : 494 nm、λem : 518 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red	红色	λex : 550 nm、λem : 566 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red	深红色	λex : 646 nm、λem : 668 nm

细胞衰老实验例

在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。

<细胞衰老实验例>

概要	检测指标	论文
在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37.
在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。	γH2AX、SA-β-gal、p21	Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951.
在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。	γH2AX、SA-β–gal	W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506.
在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11.
在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。	γH2AX、SA-β-gal、p16	R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259.

<结合其他指标的细胞实验例>

<染色条件>

将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。

使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。

<检测条件>

H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm

SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm

DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm

常见问题Q&A

Q：抗γH2AX抗体工作液和二抗工作液是否可以保存？

A：无法保存，请当天使用。

Q：可以使用试剂盒内含的封闭液以外，其他的试剂进行稀释抗体吗？

A：我们建议使用试剂盒内含的封闭液进行稀释。用其他溶液稀释可能会增加背景。

Q：多重染色的注意点

A：由于该试剂盒使用源自小鼠的一抗，因此在共染色其他抗原时，请选择小鼠来源的一抗以外的一抗。

Q：组织染色的注意点

请注意，不能用于小鼠组织的组织染色。

当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。

<试剂盒中包含的抗体信息>

	来源	交叉性
一抗	小鼠	人、小鼠
荧光标记的二抗	山羊	小鼠IgG

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DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

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Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal共染，检测衰老细胞DNA损伤

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储存条件：0-5°C，注意防止吸潮

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无需另外准备试剂

操作简便

3色可选

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

试剂盒内含

性质

DNA损伤检测原理

试剂盒特点

试剂盒实验例

常见问题Q&A

试剂盒内含

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

性质

DNA损伤检测原理

该产品使用单克隆抗体实验室生产的抗γH2AX抗体。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

试剂盒特点

<试剂盒内已包含所有需要试剂>

所有试剂均已包含在试剂盒内，您可以马上检测并获得数据。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

*对于多次染色和组织染色，请先查看常见问题中的“多次染色的注意事项”和“组织染色的注意事项”。

<操作简便>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

<3色可选>

细胞固定和膜渗透处理后，只需添加试剂盒中包含的试剂并进行洗涤即可进行染色。

DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red货号：G266

产品名称	荧光	激发发射波长
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Green	绿色	λex : 494 nm、λem : 518 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Red	红色	λex : 550 nm、λem : 566 nm
DNA Damage Detection Kit – γH2AX　- Deep Red	深红色	λex : 646 nm、λem : 668 nm

试剂盒实验例

在评估细胞衰老时，应使用多种衰老指标进行分析。

<细胞衰老实验例>

概要	检测指标	论文
在自噬不足的卫生细胞中检测到细胞衰老，相反，通过添加自噬诱导剂后，细胞衰老被抑制。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	Laura Garcia-Prat, et. al., Nature, 2016, 529, 37.
在2型糖尿病模型中，证实了衰老指标活性增加，DNA损伤水平增加。	γH2AX、SA-β-gal、p21	Milad S. Bitar, et. al., Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 305(8), E951.
在缺乏特定蛋白质（BRE）的小鼠成纤维细胞中，观察到细胞衰老明显增强。	γH2AX、SA-β–gal	W. Shi, M. K. Tang, Y. Yao, C. Tang, Y. L. Chui and K. K. Lee Sci Rep. , 2016, 6, 23506.
在棕榈酸处理的HepG2细胞中，染色质结构突变复合物之一SMARCD1减少，所有衰老指标的活性均得到增强。	γH2AX、SA-β-gal、p16、p21	I. Chisato, et. al., NPJ Aging Mech Dis., 2017, 3, 11.
在参与DNA修复的Ercc1基因缺陷小鼠中，证实了仅通过自发DNA损伤即会导致ROS水平升高和衰老诱导。	γH2AX、SA-β-gal、p16	R. R. Andria, et. Al., Redox Biology, 2018, 17, 259.

<结合其他指标的细胞实验例>

<染色条件>

将不同代数的WI-38细胞固定后，用细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对其进行染色。

使用0.1％Triton-X / PBS进行膜渗透处理后，用该试剂盒对γH2AX进行染色。

<检测条件>

H2AX（深红色）：Ex.590-650 nm / Em.663-738 nm

SA-β-gal：Ex.533-557 nm / Em.570-640 nm

DAPI：Ex.340-380 nm / Em.435-485 nm

常见问题Q&A

Q：抗γH2AX抗体工作液和二抗工作液是否可以保存？

A：无法保存，请当天使用。

Q：可以使用试剂盒内含的封闭液以外，其他的试剂进行稀释抗体吗？

A：我们建议使用试剂盒内含的封闭液进行稀释。用其他溶液稀释可能会增加背景。

Q：多重染色的注意点

A：由于该试剂盒使用源自小鼠的一抗，因此在共染色其他抗原时，请选择小鼠来源的一抗以外的一抗。

Q：组织染色的注意点

请注意，不能用于小鼠组织的组织染色。

当需要对小鼠组织进行染色时，抗小鼠抗体（荧光标记的二抗）会对小鼠组织中IgG的非特异性吸附，从而增加背景。

<试剂盒中包含的抗体信息>

	来源	交叉性
一抗	小鼠	人、小鼠
荧光标记的二抗	山羊	小鼠IgG

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细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

细胞衰老检测试剂盒SPiDERβGal

Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

商品信息

储存条件：0-5度保存

运输条件：室温

特点：

● 活细胞和固定细胞均可染色

● 可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测

● 可固定后与抗体共染色

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实验实例

5assays

现货

衰老检测方案

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

活动进行中

试剂盒内含

产品概述

原理

荧光特性

操作步骤

产品优势

细胞衰老与细胞周期

实验例

常见问题Q&A

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试剂盒内含

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

产品概述

正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：

1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。

2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。

3)染色时间长。

本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。

原理

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。

荧光特性

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图

<推荐波长>

Ex：500~540 nm

Em：530~570 nm

用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）

操作步骤

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

产品优势

特点1：适用于活细胞和固定细胞

检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。

*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

特点2：可定量检测

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

细胞衰老与细胞周期

细胞衰老与细胞周期之间的关系

阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

实验例

与其他细胞衰老标记物的共染色

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例^a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色^b），以及全细胞的核染色（DAPI）^c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。^d）

1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。

2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。

3）PBS清洗细胞3次。

4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。

5）PBS清洗细胞3次。

6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。

7）用1% BAS/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。

8）PBS清洗细胞3次。

9）用1% BAS/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。

10）PBS清洗细胞3次。

11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。

12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。

固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染

SPiDER-βGal工作液配制

用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。

*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。

McIlvaine buffer（pH6.0）的制备

将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。

染色步骤（35 mm 培养皿）

1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。

*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低

3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。

4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。

＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。

5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。

6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。

7.用PBS洗涤细胞2次。

8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。

9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。

10.用PBS洗涤细胞3次。

11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。

12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。

SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）

爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。

这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。

染色条件：

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

① SPiDER-βGal 方法

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

② X-gal 方法

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供

用共聚焦成像细胞仪进行定量用

用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。

■与其他细胞衰老标记物共染色用

SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

定量解析

散点图（Scatter Plot）

使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

活细胞荧光染色的分析

X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。

而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03 横河电机

CQ01 拍摄条件

使用孔板：96 孔板

物镜：10 倍

拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan

488 nm （SPiDER-βGal Green）

视野：8视野

*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）

WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。

SA-β-gal的荧光成像

1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。

4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.

6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞

1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×10⁵ 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO₂培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养1 h。

4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO₂培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。

6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。

7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。

常见问题Q&A

Q1: 本试剂盒的大概可以检测多少次？

A1:大概的检测次数，请参考下表中不同的使用容器：

	35mm dish	Micro Plate	Chamber Slide
使用次数	5 dishes	2 plates	7 slides

*使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。

Q2: 为什么要添加Bafilomycin A1？

A2：很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中，背景也较高，妨碍了SA-β-Gal的检测。

Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性，并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性，从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此，在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞，使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应，并对衰老细胞进行荧光染色。

下图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。

由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时，请考虑是否会对实验体系有影响，如果有影响，建议固定细胞。细胞固定时，缓冲液会控制细胞内的pH，所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

Q3: DMSO stock solution 可以稳定保存多久？

A3: SPiDER-βGal DMSO stock solution和Bafilomycin A1 DMSO stock solution配制后，-20℃可以稳定保存1个月。

Q4: Working solution可以稳定保存多久？

A4: SPiDER-βGal working solution和Bafilomycin A1 working solution无法长期保存，请现配现用。

Q5: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项？

A5: 随着细胞的衰老，被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。脂褐素自身会产生荧光，进而增加荧光背景。在这种情况下，我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品，以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。
流式细胞仪检测
・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度（MFI）
①添加了SPiDER-βGal的细胞
②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景)
・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度”
用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。
a：SA-β-gal活性（衰老细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度
b：SA-β-gal活性（正常细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度
・通过比较上述a和b的值来评价SA-β-gal的活性。
另外，通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。
荧光显微镜检测
・首先，使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。
・调整灵敏度（Gain等），直至来生自脂褐素的荧光（背景）不影响荧光图像为止。
・在相同的成像条件下，再对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。

Q6: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗？

A6: 可以。如果固定细胞，则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞，但是需要制备pH调节至6的Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。

Q7: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤？

A7: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal（请参考下面的*2）
以下的实验例供作参考。
WI-38细胞固定后，进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。
<实验操作>
(1) 将WI-38细胞播种至35 mm dish，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。
(2) 去除上清，加入2 ml 4% Paraformaldehyde/PBS溶液，室温培养3 min*1。
(3) 用2 ml PBS清洗细胞3次。
(4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3。
(5) 用2 ml PBS清洗细胞2次。
(6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min。
(7) 用2 ml PBS清洗细胞2次。
(8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液，室温培养1 h。 (9) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源)，加入至细胞后室温培养1 h (10) 用2 ml PBS清洗细胞3次。(11) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记)，加入至细胞后室温培养1 h。

(12)去除上清，用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。

*1 细胞固定时间越长，对SA-β-gal活性的影响越高。
*2 细胞固定操作有可能会降低SA-β-gal的活性。如果检测SA-β-gal时，荧光强度较弱，请尝试将SPiDER-βGal DMSO stock solution 稀释500-1000倍使用。通常SPiDER-βGal DMSO stock solution 建议用Mcllvaine buffer (pH 6.0)稀释2,000倍使用。
*3 培养时不使用5% CO2培养箱。细胞固定后使用5% CO2培养箱的话，缓冲液会变为酸性，从而使得内在性β-galactosidase的活性上升，导致背景升高，无法辨别衰老细胞和年轻细胞的内的SA-β-gal活性的差值。
<实验数据>
细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

图1. 免疫染色前后SPiDER-βGal染色的荧光强度变化
通过比较免疫染色前后的SPiDER-βGal的荧光强度，可以发现固定后的免疫染色过程中SPiDER-βGal的荧光强度降低了。
细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

图2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后)

红色：SPiDER-βGal 蓝色：γ-H2AX <曝光时间: 1.5 s>
通过将SPiDER-βGal工作溶液的稀释比从2000倍更改为666倍，可以确认通过免疫染色（固定化）降低的SPiDER-βGal荧光强度与免疫染色前的强度相当。

Q8: 染色操作后发现荧光很弱，无法观察，请问是否有改善的方法？

A8: 请确认如下三个注意事项。
①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。
<推荐的滤光片>
· 荧光显微镜：激发(500-540 nm)，荧光(530-570 nm)
· 流式细胞仪：激发(488 nm), 荧光(500-540 nm)
②各working solution是否为现配现用。
③延长染色时间
添加SPiDER-βGal working solution后，培养30 min后无法观察到荧光的话，考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。

Q9: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后，是否可以进行细胞固定？

A9: 可以。建议使用4%的多聚甲醛进行细胞固定。

Q10: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测？

A10: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。

Q11：衰老细胞和正常细胞没有差异时，应该怎么确认？

A11： STEP1：优化显微镜的观察条件。

STEP2：如果优化观察条件仍无法解决，请对染色条件进行优化。
STEP1＜优化显微镜的观察条件＞
如果衰老细胞和对照组细胞之间的荧光强度没有差异，请按照以下步骤进行调整。
1. 观察对照组细胞，通过降低激发光强度，Gain值或缩短曝光时间等条件将仪器调节至可以观察到微弱荧光的状态。
(共聚焦显微镜：调整Gain值、激发光强度落射型显微镜：调整曝光时间)
2. 慢慢增强激发光强度，延长曝光时间，观察衰老细胞的荧光变化，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。
·如果两者荧光没有差异，请参考STEP2。
※请使用玻璃底的培养皿容器观察。
STEP2<染色条件的优化>
根据不同的细胞种类，可能需要调整SPiDER-βGal的染色时间和工作液浓度。
以下为最佳条件的参考数据。
染色时间：10-60 min
染色浓度：说明书中1/2-2倍的浓度
分别加入不同浓度的工作液，并调整不同的染色时间，寻找到衰老细胞和对照组细胞之间的最大荧光差异的条件。
*如果观察的细胞数少的话，有可能灵敏度不够。必要时，需要调整细胞数量

细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

Q12.如何准备药物阳性对照组

A12：参考如下案例

衰老诱导（阿霉素处理的WI-38细胞）

1.将第3代的WI-38细胞（1×10^6细胞/皿，MEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）接种在10 cm培养皿中，并在5％CO2中于37℃培养箱中培养过夜。
2.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
3.用无血清MEM制备0.2μmol/ L的阿霉素。如果没有无血清的培养基，可以使用含血清的培养基。
4.向培养皿中加入阿霉素（10 mL），并在5％CO2培养箱中于37℃培养3天。
5.除去上清液，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
6.向培养皿中加入MEM（10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素），并在5％CO2恒温箱中于37℃培养3天。
7.除去培养基，并用10 ml PBS洗涤细胞一次。
8.胰酶消化细胞，分别用阿霉素和不用阿霉素处理。

固定细胞成像
1.在8孔ibidi中准备细胞进行测定，并在5％CO2恒温箱中于37℃过夜培养细胞。
2.除去培养基。用PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入4％多聚甲醛（PFA）/ PBS溶液，并在室温下孵育3分钟。
3.除去上清液。用PBS洗涤细胞两次。
4.混合SPiDER-βGal工作溶液（2 mL）和1mg / mL Hoehst 33342（2μl）。将混合溶液（200μl）加入孔中，并在37℃孵育30分钟。
*我们建议不要在固定细胞实验中使用5％CO2培养箱。如果在5％CO2培养箱中进行培养，则缓冲液的pH值可能会呈酸性。酸性pH导致内源性β-半乳糖苷酶活性的背景升高，因此很难区分正常细胞和衰老细胞。
5.除去上清液。用PBS洗涤细胞两次。
6.在荧光显微镜下观察细胞。细胞衰老检测试剂盒—Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal货号：SG03

文献

细胞种类	标题及链接	仪器	IF 因子
细胞种类	标题及链接	仪器	IF 因子	Cancer cells	The chemistry of senescence	荧光	30
Vascular Cells	b-Hydroxybutyrate Prevents Vascular Senescence through hnRNP A1-Mediated Upregulation of Oct4	荧光	14
RAW 264.7 (小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)	The CD153 vaccine is a senotherapeutic option for preventing the accumulation of senescent T cells in mice	荧光	11.8
HT-1080 (人纤维肉瘤细胞)	Typhoid toxin exhausts the RPA response to DNA replication stress driving senescence and Salmonella infection	荧光	11.8
OVCAR-3 Cell:人卵巢腺癌细胞系	Author Manuscript Published OnlineFirst on December 19, 2019;	流式	8.3
neck tumor cells	Interference with the bromodomain epigenome readers drives p21 expression and tumor senescence	荧光	6.5
VZ/SVZ cells	Ecrg4 deficiency extends the replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner	荧光	5.7
骨髓源性间充质干细胞（BMSCs）	Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional co-culture attenuate degeneration of nucleus pulposus cells Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional co-culture attenuate de	荧光	5.5
肾组织石蜡切片	Mitochondrial Protection Partly Mitigates Kidney Cellular Senescence in Swine Atherosclerotic Renal Artery Stenosis,Cellular Physiology and Biochemistry,2019,52,617-632	荧光	5.1
A549细胞 PC-9人肺癌细胞	Novel drug-resistance mechanisms of pemetrexed-treated non-small cell lung cancer,Oncotarget,2018,9(24),16807-1682	荧光	5.1
人乳腺癌细胞	Different sensitivities of senescent breast cancer cells to immune cell-mediated cytotoxicity,Cancer Science, 2019,110,2690–2699	流式/荧光	4.7
HaCaT细胞系	Particulate matter-induced senescence of skin keratinocytes involves oxidative stress-dependent epigenetic modifications,Experimental & Molecular Medicine,2019,51, Article number:108	荧光	4.7
脂肪来源干细胞 (ADSC)	Antioxidants inhibit cell senescence and preserve stemness of adipose tissue-derived stem cells by reducing ROS generation during long-term in vitro expansion,Stem Cell Research & Therapy, 2019,10(1),306	荧光	4.6
HaCaT细胞系	Effect of Fermented Fish Oil on Fine Particulate Matter-Induced Skin Aging	流式/荧光	4.3
HCT 116 (人结肠癌细胞)	Heat shock protein 27 promotes cell cycle progression by down-regulating E2F transcription factor 4 and retinoblastoma family protein p130	荧光	4.1
immortalized cells	Improved Isolation of Mesenchymal Stem Cells Based on Interactions between N-Acetylglucosamine-Bearing Polymers and Cell-Surface Vimentin	荧光	3.9
PC12 cells	b-Asarone Inhibits Amyloid-b by Promoting Autophagy in a Cell Model of Alzheimer’s Disease	荧光	3.8
卵母细胞和卵子	Activity and intracellular localization of senescence-associated β-galactosidase in aging Xenopus oocytes and eggs	荧光	3
胶原酶法分离小鼠角膜基质	Anti-inflammatory activities of Ophiopogonis Radix on hydrogen peroxide-induced cellular senescence of normal human dermal fibroblasts,Journal of Natural Medicines,2018,72(4):905-914	流式	2.3
成纤维细胞 (NHDF)	Anti‑inflammatory activities of Ophiopogonis Radix on hydrogen peroxide‑induced cellular senescence of normal human dermal fibroblast	荧光	1.92
WI-38 (人肺成纤维细胞）	Changes in MCM2–7 proteins at senescence	荧光	0.8
骨髓间充质干细胞	Obesity is associated with senescence of mesenchymal stromal cells derived from bone marrow, subcutaneous and visceral fat of young mice	流式

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