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特点：
● 可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估
● 使用酶标仪检测
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NO.2. Cell Cycle Assay Kit 细胞周期检测
NO.3. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
NO.4. BCECF-AM 细胞内pH值检测
NO.5. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric- 细胞凋亡检测
试剂盒内含
原理
该产品是一种试剂盒，可通过细胞培养板轻松检测SA-β-gal（细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶）活性，SA-β-gal是衰老细胞的指标。 SPiDER-βGal是一种β-半乳糖苷酶检测试剂，只需将试剂添加到96孔板中，即可用于SA-β-gal活性的定量和多个样品的评估。
根据细胞数的SA-β-gal活性可以通过计算该细胞数，测量核酸（相关产物）的量或蛋白质的量来校正。并通过该试剂盒获得的测量值来评估衰老程度。
操作步骤
轻松量化衰老细胞
预先准备的细胞在该试剂盒随附的缓冲液中裂解。只需将荧光底物SPiDER-βGal加到细胞裂解液中，即可根据SA-β-gal活性检测荧光强度。
即使在10 cm培养皿或其它容器中制备细胞，也可以通过在细胞裂解后将细胞裂解液转移到96孔板上来检测荧光强度。
实验例
与荧光成像结果的相关性：
用平板分析法和细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal对不同传代水平的WI-38细胞进行荧光成像实验结果。
结果证实了在2种试剂盒中，SA-β-gal染色在高传代的WI-38细胞中荧光强度有明显增强。
请注意尽管初始细胞接种密度是相同的，但由于较高传代水平下衰老细胞的增殖率较低，因此平板分析时的细胞密度会有所不同。在本实验中我们用检测细胞核的细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）获得的结果来校正SA-β-gal活性。
平板测定<检测条件>
EX:535 nm/Em:580nm
荧光数据<检测条件>
绿色：EX:488 nm/Em:500-600nm
（用细胞衰老检测试剂盒(货号SG03)对SA-β-Gal进行染色
蓝色：EX:405 nm/Em:450-495 nm
（用DAPI溶液进行核染色（货号：D523））
加药实验：
加入阿霉素后，我们使用该试剂盒对WI-38细胞进行了分析，阿霉素会增加线粒体活性氧（ROS）的产生。结果证实由于DNA损伤诱导的衰老，向WI-38细胞中添加阿霉素会引起SA-β-gal的染色强度增加。
＜检测条件＞
Ex:535 nm/Em:580 nm
注意事项
用微孔板分析细胞时，会由于孔中细胞的数量不同导致结果可能不同。在此情况下，有必要通过对细胞进行计数并检查蛋白质总量来校正（标准化）获得的测量值。使用细胞计数标准化试剂盒，只需将试剂加到细胞培养基中，即可通过对细胞核染色获得的荧光强度轻松检测细胞数量。
有关细胞计数标准化试剂盒（货号：C544）的产品信息请点击这里
常见问题Q&A
| Q1：1个试剂盒可检测多少样品？ |
| A1： |
| 20 tests | 100 tests | |
| 检测数量 | 96孔板20个孔 | 1块96孔板 |
| 当n=3时 | 6个样品 | 30个样品 |
| Q2：是否可以先诱导衰老然后在96孔板上进行检测？ |
| A2：建议先用培养皿诱导细胞衰老，然后将细胞转移到96孔板中进行检测。 将未诱导衰老的细胞（对照）和诱导衰老的细胞（样品）放在同一块板上进行比较，如果在96孔板上诱导衰老时（取决于衰老诱导的天数），会发生细胞过度生长并导致细胞融合的情况。 另外即使预先接种少量细胞以避免融合，已经进行了衰老诱导处理的衰老细胞也可能不具有平板测定所需的灵敏度（细胞数）。 |
| Q3：在96孔板上应接种多少细胞？ |
| A3：最佳细胞数取决于细胞类型。 我们曾经在每个孔中接种1╳104个WI-38细胞进行实验。 更多详细操作，请参照说明书中的“实验例”。 |
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特点：
● 活细胞和固定细胞均可染色
● 可用共聚焦显微镜或流式细胞仪检测
● 可固定后与抗体共染色
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凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Mitophagy Detection Kit 线粒体自噬
NO.3. Cell Cycle Assay Kit 细胞周期检测
NO.4. Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric 细胞凋亡检测
NO.5. Cellstain- Hoechst 33342 solution 细胞核染色检测
试剂盒内含
产品概述
正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：
1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。
2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。
3)染色时间长。
本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。
原理
由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。
荧光特性
SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图
<推荐波长>
Ex：500~540 nm
Em：530~570 nm
用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）
操作步骤
产品优势
特点1：适用于活细胞和固定细胞
检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。
*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。
特点2：可定量检测
细胞衰老与细胞周期
细胞衰老与细胞周期之间的关系
阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。
实验例
与其他细胞衰老标记物的共染色
本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色b），以及全细胞的核染色（DAPI）c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。d）
1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。
2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。
3）PBS清洗细胞3次。
4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。
5）PBS清洗细胞3次。
6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。
7）用1% BAS/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。
8）PBS清洗细胞3次。
9）用1% BAS/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。
10）PBS清洗细胞3次。
11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液 同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。
12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。
固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染
SPiDER-βGal工作液配制
用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。
*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。
McIlvaine buffer（pH6.0）的制备
将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。
染色步骤（35 mm 培养皿）
1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。
*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低
3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。
4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。
＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。
5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。
6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。
7.用PBS洗涤细胞2次。
8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。
9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。
10.用PBS洗涤细胞3次。
11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。
12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。
SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）
爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。
这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。
染色条件：
① SPiDER-βGal 方法
② X-gal 方法
*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供
用共聚焦成像细胞仪进行定量用
用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。
■与其他细胞衰老标记物共染色用
SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。
定量解析
散点图（Scatter Plot）
使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。
活细胞荧光染色的分析
X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。
而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。
横河电机
CQ01 拍摄条件
使用孔板：96 孔板
物镜：10 倍
拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan
488 nm （SPiDER-βGal Green）
视野：8视野
*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）
WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。
SA-β-gal的荧光成像
1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。
4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。
5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.
6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。
用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞
1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×105 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO2培养箱中培养1 h。
4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养30 min。
5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。
6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。
7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。
常见问题Q&A
| Q1: 本试剂盒的大概可以检测多少次？ |
| A1:大概的检测次数，请参考下表中不同的使用容器： |
| 35mm dish | Micro Plate | Chamber Slide | |
| 使用次数 | 5 dishes | 2 plates | 7 slides |
| *使用次数会随着每孔添加的染色溶液量的变化而变化。使用前请先确认每孔的必要的染色溶液量。 |
| Q2: 为什么要添加Bafilomycin A1？ |
| A2：很多细胞内部都存在内源性β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，由于SPiDER-βGal与内源性β-半乳糖苷酶和细胞衰老的标记物SA-β-Gal都会发生反应。即使在没有衰老的细胞中，背景也较高，妨碍了SA-β-Gal的检测。
Bafilomycin A1可以抑制溶酶体中的ATPase活性，并将溶酶体中的pH从酸性变为接近中性，从而降低了内源性β-半乳糖苷酶的活性。因此，在添加SPiDER-βGal之前先用Bafilomycin A1处理细胞，使得SPiDER-βGal可以与SA-β-gal反应，并对衰老细胞进行荧光染色。 下图显示了添加和不添加Bafilomycin A1时检测SA-β-gal的差异。 由于Bafilomycin A1也被用作自噬的抑制剂。使用时，请考虑是否会对实验体系有影响，如果有影响，建议固定细胞。细胞固定时，缓冲液会控制细胞内的pH，所以不需要使用Bafilomycin A1。可以参照操作说明书中的步骤进行染色。
|
| Q3: DMSO stock solution 可以稳定保存多久？ |
| A3: SPiDER-βGal DMSO stock solution和Bafilomycin A1 DMSO stock solution配制后，-20℃可以稳定保存1个月。 |
| Q4: Working solution可以稳定保存多久？ |
| A4: SPiDER-βGal working solution和Bafilomycin A1 working solution无法长期保存，请现配现用。 |
| Q5: 做细胞衰老的荧光观察时有哪些注意事项？ |
| A5: 随着细胞的衰老，被称为脂褐素(Lipofuscin)的不溶性物质会在细胞中积聚。 脂褐素自身会产生荧光，进而增加荧光背景。 在这种情况下，我们建议您准备不含SPiDER-βGal的样品，以准确评估衰老细胞中的SA-β-gal活性。 流式细胞仪检测 ・测定“衰老细胞”和“正常细胞”的平均荧光强度（MFI） ①添加了SPiDER-βGal的细胞 ②未添加SPiDER-βGal的细胞 (背景) ・“①的平均荧光强度”减去“②的平均荧光强度” 用扣除背景后的SA-β-gal的荧光来表征SA-β-gal的活性。 a：SA-β-gal活性（衰老细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度 b：SA-β-gal活性（正常细胞）：＝①的平均荧光强度 – ②的平均荧光强度 ・通过比较上述a和b的值来评价SA-β-gal的活性。 另外，通过a减去b的差值可以确定细胞衰老所引起的SA-β-gal活性的变化。 荧光显微镜检测 ・首先，使用未添加SPiDER-βGal的衰老细胞进行荧光观察。 ・调整灵敏度（Gain等），直至来生自脂褐素的荧光（背景）不影响荧光图像为止。 ・在相同的成像条件下，再对添加了SPiDER-βGal的细胞或正常细胞进行荧光观察。 |
| Q6: 细胞固定后还可以对SA-β-gal进行染色吗？ |
| A6: 可以。如果固定细胞，则不需要用Bafilomycin A1预处理细胞，但是需要制备pH调节至6的Mcllvain Buffer。详细的操作请参考操作说明书。 |
| Q7: 请问是否有细胞固定后进行流式细胞仪操作的具体步骤？ |
| A7: 可以。但是请注意细胞固定可能会影响SA-β-gal（请参考下面的*2） 以下的实验例供作参考。 WI-38细胞固定后，进行SA-β-gal检测和γ-H2AX (DNA损伤标志物)的免疫染色。 <实验操作> (1) 将WI-38细胞播种至35 mm dish，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。 (2) 去除上清，加入2 ml 4% Paraformaldehyde/PBS溶液，室温培养3 min*1。 (3) 用2 ml PBS清洗细胞3次。 (4) 添加2 ml SPiDER-βGal working solution *2, 37℃培养30 min*3。 (5) 用2 ml PBS清洗细胞2次。 (6) 加入2 ml 0.1% Tritox X-100/PBS, 室温培养30 min。 (7) 用2 ml PBS清洗细胞2次。 (8) 加入 2ml 1% BSA/PBS溶液，室温培养1 h。 (9) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗γ-H2AX IgG(小鼠来源)，加入至细胞后室温培养1 h (10) 用2 ml PBS清洗细胞3次。(11) 用1% BSA/PBS溶液稀释过的抗小鼠IgG(Cy5标记)，加入至细胞后室温培养1 h。 (12)去除上清，用2 ml PBS清洗细胞2次后进行荧光显微镜观察。 *1 细胞固定时间越长，对SA-β-gal活性的影响越高。 图1. 免疫染色前后SPiDER-βGal染色的荧光强度变化 图2. 不同稀释倍率的SPiDER-βGal染色结果 (免疫染色后) 红色：SPiDER-βGal 蓝色：γ-H2AX <曝光时间: 1.5 s> |
| Q8: 染色操作后发现荧光很弱，无法观察，请问是否有改善的方法？ |
| A8: 请确认如下三个注意事项。 ①使用的滤光片是否与染色试剂匹配。 <推荐的滤光片> · 荧光显微镜：激发(500-540 nm)，荧光(530-570 nm) · 流式细胞仪：激发(488 nm), 荧光(500-540 nm) ②各working solution是否为现配现用。 ③延长染色时间 添加SPiDER-βGal working solution后，培养30 min后无法观察到荧光的话，考虑延长至45-60 min再进行荧光观察。 |
| Q9: 确认含有SA-β-Gal的细胞染色后，是否可以进行细胞固定？ |
| A9: 可以。建议使用4%的多聚甲醛进行细胞固定。 |
| Q10: 培养基中的血清和酚红是否会影响检测？ |
| A10: 培养基中的血清和酚红对SA-β-gal的检测没有影响。 |
| Q11：衰老细胞和正常细胞没有差异时，应该怎么确认？ |
| A11： STEP1：优化显微镜的观察条件。
STEP2：如果优化观察条件仍无法解决，请对染色条件进行优化。
|
| Q12.如何准备药物阳性对照组 |
| A12：参考如下案例
衰老诱导（阿霉素处理的WI-38细胞） 1.将第3代的WI-38细胞（1×10^6细胞/皿，MEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）接种在10 cm培养皿中，并在5％CO2中于37℃培养箱中培养过夜。 |
| 固定细胞成像 1.在8孔ibidi中准备细胞进行测定，并在5％CO2恒温箱中于37℃过夜培养细胞。 2.除去培养基。 用PBS洗涤细胞一次。 向细胞中加入4％多聚甲醛（PFA）/ PBS溶液，并在室温下孵育3分钟。 3.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。 4.混合SPiDER-βGal工作溶液（2 mL）和1mg / mL Hoehst 33342（2μl）。 将混合溶液（200μl）加入孔中，并在37℃孵育30分钟。 *我们建议不要在固定细胞实验中使用5％CO2培养箱。如果在5％CO2培养箱中进行培养，则缓冲液的pH值可能会呈酸性。 酸性pH导致内源性β-半乳糖苷酶活性的背景升高，因此很难区分正常细胞和衰老细胞。 5.除去上清液。 用PBS洗涤细胞两次。 6.在荧光显微镜下观察细胞。  |
文献
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CAS No.： 储存条件：RT 纯度：– |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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FDV-0005-200U×3 |
– | 3×200 ug | – | 咨询 | – | – |
* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用
* 零售价、促销产品折扣、运输费用、库存情况、产品及包装规格可能因各种原因有所变动，恕不另行通知，确切详情请联系上海金畔生物科技有限公司。
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品牌：Funakoshi
CAS No.： 储存条件：RT,Dark Strage 纯度：– |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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FDV-0004 |
– | 200 ug | – | 咨询 | – | – |
* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用
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细胞葡萄糖摄取检测试剂盒
Glucose Cellular Uptake Measurement Kit
细胞内葡萄糖吸收检测试剂盒
◆原理
胰岛素是降血糖的激素，它能够以脂肪细胞或者骨骼肌等为中心促进糖输送活性，将糖从细胞外吸收到细胞内。
测定糖的吸收量一般是使用3H标记的3-O-甲基-D-葡萄糖和2-脱氧葡萄糖（2DG）的方法。这种方法需要用同位素，所以只能在RI管理区域内使用，在一般的实验室也无法使用。
本试剂盒使用安全，操作简单，用non-RI法能够简便地测定细胞内糖吸收量。
试剂盒测定
细胞吸收的2DG会在己糖激酶的催化下会被2-脱氧葡萄糖-6磷酸（DG6P）氧化，不继续进行酶反应而是留在细胞内。
本试剂盒是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的酶反应下，生成2DG6P成比例地生成NADPH，然后NADPH发生氧化生成荧光基质后就可以测定荧光物质的荧光强度。
◆优点・特色
● 检测2-deoxyglucose (2DG) (葡萄糖类似物) 摄入的总量
● 葡萄糖，2DG被细胞摄取后，在己糖激酶作用下，迅速磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）。
● 而2DG6P在细胞内聚集，不会发生进行代谢。
● 细胞裂解物中的2DG6P在耦合酶作用下，产生荧光信号，其强度与2DG6P的量正相关。
● 利用已知2DG6P的标准曲线，对照检测的荧光强度计算样品2DG水平
相关产品比较
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【本试剂盒】 Measurement Kit, Broad Range, Fluorometric Cat. No. MBR-PMG-K01E |
【相关产品】 2-Deoxyglucose (2DG) Uptake Measurement Kit Cat. No. CSR-OKP-PMG-K01E |
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测定方法 |
Non-RI法 |
Non-RI法 |
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操作时间 |
3小时 |
5~7小时（2天） |
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检测方法 |
荧光（Ex 540 nm/Em 590 nm） |
发光（420 nm） |
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特征 |
测定范围广（0~50 μm）能够迅速进行测定 可以使用高通量法一步测定 |
高灵敏度（0~5 μm）定量检测试剂盒 |
◆案例・应用
试剂盒组成
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试剂 |
规格 |
数量 |
储存（开封后） |
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2DG6P Solution (1 mM) |
500 μL |
3×3 mL |
-20°C (避光) |
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Sample Diluent Buffer Concentrate (100x) |
5 mL |
1 vial |
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Substrate Buffer |
9 mL |
1 vial |
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Fluorescent Substrate |
120 μL |
1 vial |
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Enzyme Solution |
270 μL |
1 vial |
该试剂盒可进行100次反应
需要准备：
● 超纯水（蒸馏水）
● 2-deoxyglucose 建议产品
● 牛血清白蛋白建议产品
● 96-well黑色多孔板
● 96-well荧光酶标仪 （激发波长540 nm/荧光波长590 nm）
● 超声波细胞裂解装置
胰岛素刺激3T3-L1细胞分化后2DG的摄取情况
※具体操作见“相关资料”
胰岛素刺激3T3-L1细胞分化及样品制备
对于您实验的细胞，需要根据细胞本身的情况优化培养基和各项条件，如实际浓度、培养时间及其他实验相关参数。
以下是标准12孔培养板的3T3-L1细胞操作步骤。
试剂和培养基
･Serum-free culture medium
･Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) buffer at 37°C
(1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 118 mM NaCl, 5 mM KCl, 30 mM Hepes, pH7.5)
･BSA (essentially fatty acid free and globulin free grade, use Sigma Ca. No. A0281 or equivalent)
･2-Deoxy-D-glucose (2DG) solution
･ Insulin solution
･ PBS(-)
･Phloretin or Cytochalasin B (or other glucose uptake inhibitor)
细胞样品制备
1) Differentiate 3T3-L1 cells to adipocytes in a 12-well culture plate.
2) Replace culture media with serum-free medium. Return to incubator for 6 hours.
3) Gently wash cells 3 times with 1.5 mL of warm KRPH buffer without BSA?.
4) Gently add 3 mL of warm KRPH buffer containing 2% BSA.
加入胰岛素
5) For this example, insulin is added to a final concentration of 1 μm .
6) Incubate cells for 18 min at 37°C.
加入2DG
7) For this example, 2DG is added to a final concentration of 1 mM.
8) Incubate cells at 37°C for 20 minutes.
9) Wash cells gently 3× with cooled PBS containing 200 μM Phloretin to inhibit further 2DG uptake.
细胞裂解及样品制备
10) Add 1.5 mL of 1× Sample Diluent Buffer.and lyse cells by sonication with a microtip sonicator.
11) Collect cell lysate to tube, and apply heat treatment at 80°C for 15 minutes.
Note: Do not add protease inhibitors to cell lysates.
Note: If an alternate method for cell lysis will be used, do not use NaOH as NaOH degrades 2DG6P.
12) Centrifuge lysates at 15000 x g for 20minutes at 4°C
13) Transfer cell lysate supernatants to a fresh tube. These cell lysate supernatants are your experimental samples.
Note: Supernatants can be stored at -20°C for later analysis.
检测细胞裂解液中的2 DG
14) Follow the procedure of [Section III-1] “2DG Measurement Protocol” above.
【参考文献】
| [1] |
Yamamoto N, et al ,(2006). A nonradioisotope, enzymatic assay for 2-deoxyglucose uptake in L6 skeletal muscle cells cultured in a 96-well microplate. Anal. Biochem. 351: 139-145. |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| CSR-MBR-PMG-K01E | Glucose Cellular Uptake Measurement Kit (Broad Range, Fluorometric) 细胞葡萄糖摄取检测试剂盒 |
100 tests | – | – |
