未分化人ES/iPS细胞检测试剂

仅需添加培养液便可检出人ES/iPS细胞！

荧光标记 rBC2LCN（AiLecS1）

◆rBC2LCN（AiLecS1）

　　rBC2LCN（AiLecS1）是在伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）来源凝集素 BC2L-C 的 N末端域表达的重组凝集素。

　　由于 rBC2LCN 对存在于人ES/iPS细胞表面的足糖萼蛋白（Podocalyxin）上的粘蛋白样O-型糖链的H型3（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和力，因此可用作人 ES/iPS 细胞的未分化标志物。

　　本产品是荧光染色标记，能直接添加到人 ES/iPS 细胞的培养液中，实现未分化活细胞分析。 适用于未分化细胞检测用标记。可用于细胞染色，流式细胞仪。另外，使用本品持续培养数日已确认细胞无毒性。

　　我们供应绿色荧光标记（FITC），黄色荧光标记（Cy3），红色荧光标记（Cy5）的三种类型的系列商品。

◆特点

●　添加到培养基即可进行染色

●　无需固定细胞，活细胞也可直接进行明显染色

●　细胞毒性低，染色后也可培养

●　识别 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4 细胞表面存在的糖链

●　可用于细胞染色和流式细胞仪

◆产品概述

●　已进行无菌试验（0.1 μm 过滤器进行灭菌）

●　PBS(-) 溶液

●　使用时稀释比

　  Live Cell Imaging 1：100～1,000
　  Flow Cytometry 1：100～1,000

●　激发波长/发射波长

◆使用方法

细胞染色

活细胞染色（Live Cell Imaging）

1. 准备培养中的人 ES/iPS 细胞

2. 每 1 mL 的培养基添加 1~10 μL 的荧光标记 rBC2LCN

3. 37℃，5％CO₂ 孵育 30 分钟。

4. 更换新的培养基或者 HBSS(+)。

5. 利用荧光显微镜观察

固定细胞染色

1. 准备培养中的人 ES/iPS 细胞

2. 除去培养基，用 HBSS(+) 洗净。

3. 添加 4%多聚甲醛（PFA）溶液，室温静置 10～20 分钟。

4. 除去 PFA 后，用 D-PBS(-) 洗净三次。

5. 添加 D-PBS(-)。

6. 每 1 mL 的 D-PBS(-) 添加 1～10 μL 荧光标记 rBC2LCN。

7. 37℃，5% CO₂ 孵育 30 分钟。

8. 更换 D-PBS(-)。

9. 利用荧光显微镜观察。

流式细胞仪

1. 准备培养中的人 ES/iPS 细胞。

2. 使用细胞分散液，分散成单细胞。

3. 将细胞分散液移至管内，1,000 rpm 离心 3 分钟。

4. 除去上清液，用 FCM Buffer* 重悬细胞，离心后，舍弃上清液。

* FCM Buffer： D-PBS(-)和HBSS(-)含有 10 mmol/L EDTA，1% BSA

5. 用 FCM Buffer 重悬出 5×10⁶ cells/mL 的细胞悬浮液

6. 每 1 mL 细胞悬浮液，添加 1～10 μL 的荧光标记 rBC2LCN。

7. 室温，避光静置30分钟。

8. 1,000 rpm 离心三分钟，除去上清液。

9. 用 FCM Buffer 重悬细胞，离心后，除去上清液。

10.  适量的 FCM Buffer 再悬浮细胞。

11.  进行流式细胞术。

使用注意

1. rBC2LCN 染色可以维持 2~3天。

2. 使用含有血清的培养基可能使信号背景变高

3. 根据流式细胞仪进行细胞分选时，当细胞分散或 FCM 缓冲液的终浓度到达 10 μmol/L 时，请添加 Y-27632。

◆人iPS细胞的活细胞染色（Live Cell Imaging）

●　用 rBC2LCN-FITC， rBC2LCN-635 以及 Hoechst33342 对人 iPS 细胞 201B7 株进行染色处理。（无细胞固定）

（稀释倍数　1：1,000）

●　用 rBC2LCN-FITC、Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-4 对人 iPS 细胞 201B7 株进行染色处理。

　  2小时后确认染色图像。（未固定细胞）

（稀释倍数　1：100）       

★　与 Tra-1-60、Tra-1-81 相比较，rBC2LCN 的活细胞染色度更强。

★　即使交换培养基，rBC2LCN 染色第二天后染色效果依然明显。

◆人ES细胞的活细胞染色（Live Cell Imaging）

　　使用 rBC2LCN-FITC 对人 ES 细胞 WA01 株进行染色（未细胞固定）。细胞的一部分无法维持未分化状态而进行分化。如果使用 rBC2LCN-FITC 对活细胞进行染色，以维持未分化状态部分已染色，而已分化部分未染色来进行区分。

＜数据提供 国家研究与发展公司先进工业科学和技术研究院 新药开发的基础研究部门恭子小沼老师，伊藤弦老师＞

◆人 iPS 细胞固定后染色

　　将人 iPS 细胞 201B7 株用多聚甲醛固定后，使用 rBC2LCN 和 DAPI 进行细胞染色。

对于人 iPS 细胞毒性评估

　　向人 iPS 细胞 201B7 株的培养液中分别添加其 1/1,000、1/100、1/50 量的 rBC2LCN-FITC，持续培养。其结果是，不存在 rBC2LCN-FITC 浓度对毒性影响，不同浓度的细胞增殖程度相同程度。

〔细胞株〕
　人iPS细胞 201B7株

〔培养基组成〕
　StemSure^® hPSC培养基Δ+35 ng/mL bFGF

〔涂层〕
　Matrigel^® hESC-Qualified Matrix

〔细胞接种数目〕
　4×10⁴ cells/well（12孔板）

　使用Flow Cytometry进行人iPS细胞分离

　使用rBC2LCN-FITC及rBC2LCN-6547、rBC2LCN-635对人iPS细胞201B7细胞株和人正常二倍体成纤维细胞染色，进行流式细胞术。

　实验结果：未分化的人iPS细胞与分化的人二倍体成纤维细胞成功分离。

◆产品列表

◆相关产品

★ rBC2LCN 剥离液 ★

本产品能够将结合在人ES细胞▪ 人iPS细胞表面糖链的 rBC2LCN 凝集素从细胞里面剥离出来。剥离 rBC2LCN 之后的细胞能够进行抗体染色，可以继续培养。

★ BC2LCN 凝聚素，重组体、溶液未标识 rBC2LCN 系列

★ StemSure^® hPSC 培养基Δ无饲养层细胞条件下可用于维持培养人多功能干细胞（ES/iPS细胞）的无血清液态培养基。原料不含动物体来源成分。

★ StemSure^® 系列
   已通过小鼠 ES 细胞 D3 株品质测验。

●　ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞的未分化能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。

●　液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。

参考文献

·   Onuma, Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 431, 524, (2013).

·   Tateno, H., et al.: Stem Cells Transl. Med., 2, 265, (2013).

·   Tateno, H., et al.: Sci. Rep., 4, 4069, (2014).