PROTEOSTAT^® 蛋白聚集检测

　　某些肽链在经过错误折叠后很容易形成聚集，在生物技术和制药领域，这些聚集会严重影响蛋白的生产和应用。许多以蛋白多肽为基础研发的药物具有极大的应用前景，可是蛋白因错误折叠而导致构象发生变化形成聚集，使蛋白失活，最终影响药物疗效，造成不可估计的损失。污染物导致的蛋白聚集包括宿主细胞蛋白、非蛋白微粒和蛋白的损伤形式。

　　基于此 Enzo Life Sciences 推出了新产品 PROTEOSTAT^® Protein Aggregation Assay，内含红色荧光信号染料，可特异性结合聚集蛋白，进行检测。具有广泛的检测范围，可有效检测可见和不可见的蛋白微粒。

 ◆原理

　　蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。

　　蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法，可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。

　　近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品，可以准确地定量检测蛋白聚集，加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的 PROTEOSTAT^® protein aggregation assay，可对蛋白检测方法进行优化。

　　在这篇文章中，使用已知浓度的聚集 IgG 标准品作为标准曲线，通过 PROTEOSTAT^® protein aggregation assay/standards 对 IgG 的聚集水平进行检测，集中分析了制药工业中常见的３种聚集形式。

　　●    热诱导聚集

　　●    机械诱导聚集

　　●    冷冻和反复冻融诱导聚集

◆优点・特色

　●　高通量筛选方法用于流式细胞仪平台监测蛋白稳定性

　●　在荧光微孔板中即可进行简单、灵敏、均一地检测

　●　不需分离目的蛋白或稀释样品

　●　与传统蛋白聚集检测染料相比更灵敏，信号更明亮

　●　优化的缓冲液和辅料用于蛋白制剂研发

　●　检测灵敏度可低至亚微摩尔级别，含量在１%-５%的聚集蛋白也能被检测出

　●　在广泛的 PH（4-10）和离子强度范围都可使用，提供至少两个数量级的线性动态范围

　●　使用 PROTEOSTAT^® 蛋白聚集检测标准品可对溶液中的聚集蛋白精确定量

　●　可检测蛋白多肽聚集程度，可用于筛选蛋白聚集激活剂或抑制剂

在蛋白聚集实验研究中，将 PROTEOSTAT^® protein aggregation assay 和 Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader 联用，可适合用于监测由温度、机械损伤和反复冻融所引起的蛋白聚集。

稳定的蛋白颗粒作为标准品可快速建立标准曲线，加快定量分析蛋白聚集响应。这个检测方法能够可靠地检测到浓缩抗体制剂中小于 0.2% 的聚集蛋白，线性动态范围为２个数量级。

PROTEOSTAT^® protein aggregation assay 和 PROTEOSTAT^® protein aggregation standards 检测蛋白聚集特点在于操作简单，能够检测低水平的蛋白聚集情况，只需 30 分钟，就能够得到完整的分析结果。

使用流式细胞仪结合PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒使用例
A PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品 B PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测硅油滴 C PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品和硅油滴的混合物。 使用流式细胞仪结合 PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品，可与其他非蛋白微粒如油滴区别开来，且无须考虑样品微粒大小（经检测 >97% 的 IgG 聚集标准品都小于２μm）。

案例・应用

材料和方法

Enzo Life Sciences 推出了 PROTEOSTAT^® protein aggregation assay 和 PROTEOSTAT^® protein aggregation standards，利用荧光分子信号染料可特异性结合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可检测。

探针在溶液中是不发出荧光的，当与聚集蛋白的四级结构结合时会发出明亮的荧光。一旦聚集标准品发生重组，它们将含有０-12.5% 的聚集蛋白，总蛋白浓度维持在１mg/mL。

通过粒子分析成像鉴定标准品发现90%的蛋白聚集体长度为２-10 μm，约9%的蛋白聚集体长度为 10-20 μm，约 0.7% 的蛋白聚集体为长度大于 20 μm。

Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader（BioTek Instruments）可用于所有蛋白聚集分析。它的激发波长为 500 nm，发射波长为 600 nm，激发和发射狭缝宽度为 9 nm，便于检测 PROTEOSTAT^® 染料。Thioflavin T 染料可以在激发单色器激发波长为 435 nm，发射波长为 495 nm，都在激发和发射狭缝宽度为 9 nm 的条件下进行检测。

结果

在 96 孔微板中检测比较 PROTEOSTAT^® 和 Thioflavin T 染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊 lgG（4.26 mg/mL）在 pH 2.7 的盐酸水溶液中，80℃ 温度下孵育 90 分钟后会形成蛋白聚集体。

聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的，但总的 lgG 蛋白浓度仍然是 60 μg/mL。在 50 mM 磷酸钾，pH 7，3 μM ProteoStat 检测试剂或 5 μM Thioflavin T 染料中读数。这些浓度在以前做过预实验，已经确定是最优的浓度。

在蛋白和染料一起孵育 15 分钟后使用 BioTek Synergy Mx Microplate Reader 读数。所用的板为 Greiner µClear^® black，clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。

在相同情况下，PROTEOSTAT^® 染料的荧光强度比 Thioflavin T 染料高 100 倍。对于浓度为 1.2 μg/mL的聚集体，ProteoStat 染料的信噪比为 12.8，而 Thioflavin T 染料的信噪比仅为 1.2，表明 PROTEOSTAT^® 染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。

正因为由此显著的优势，PROTEOSTAT^® protein aggregation assay 和 ProteoStat protein aggregation standards 通常能够共同用于各种常规形式的蛋白聚集检测。

监控热诱导聚集

当蛋白受到提高温度刺激会加速其聚集。羊 lgG（4 mg/mL）在各个时期都处于搅拌速度 400 rmp，100 mM 磷酸钠，pH 7.2，温度 60℃ 下。

在每个时间点，25 μL lgG 用于测量。首先样本在 1× assay buffer 中稀释４倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL 。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT^® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。

同时，PROTEOSTAT^® protein aggregation standards 中含有稳定的、高质量的对照样本，用来做标准曲线。

如图１所示，使用 PROTEOSTAT^® 染料检测羊 lgG 在热诱导下的聚集情况，生成的曲线表明不同阶段 lgG 蛋白聚集的情况。

在刚开始阶段蛋白聚集情况较少，接着观察到生长阶段聚集体开始形成，最后生长率降低直至变成０，表明蛋白单体已几乎消失，差不多完全形成聚集体。

图1：热诱导羊 IgG 蛋白聚集

监控机械诱导聚集

虽然普遍认为机械搅拌会加速蛋白聚集形成，但目前机械外力造成蛋白聚集形成的原理还不是十分明确。在药物研发中，可能受到抽真空或者过滤等产生的机械外力使蛋白药物形成聚集。

羊抗鼠 lgG（10 mg/mL）溶解在含有 10 mM 的磷酸钠，150 mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH 7.2 的溶液中。机械搅拌的实验条件如下：室温、4 mL 的平底褐色玻璃瓶中加入 200 μL lgG 溶液，使用 Variomag^® Poly electronic stirrer（2Mag-USA），以 990 rpm 速度进行搅拌。搅拌棒体积为1.0×0.4×0.2 cm³。

在每个时间点，取10 μL lgG 用于检测。样品在 1×assay buffer 中稀释 10 倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT^® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。

用 PROTEOSTAT^® protein aggregation standards 作为标准曲线，定量检测机械搅拌诱导产生的蛋白聚集。在上述实验条件下，蛋白聚集与时间成正比例关系（图２）。

图2：机械诱导样抗鼠 IgG 蛋白聚集

监控冷冻和反复冻融诱导聚集

冷冻对于蛋白稳定是至关重要的，因为在冷冻过程中会导致溶液的浓度发生变化。羊抗鼠 lgG（10 mg/mL）溶解在 10mM 的磷酸钠，150 mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH 7.2 的溶液中。样品保存在 -20℃，反复冻融数次。

在每个时间点，取10 μL lgG 用于检测。样品在 1×assay buffer 中稀释 10 倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT^® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点做平行孔。

用 PROTEOSTAT^® protein aggregation standards 作标准曲线，定量检测反复冻融诱导产生的蛋白聚集体。实验表明反复冻融也会诱导产生蛋白聚集。与热诱导引起蛋白聚集一样，会观察到一条Ｓ型曲线图。