LipiDye Ⅱ 高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

LipiDye Ⅱ
高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

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高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

LipiDye Ⅱ

LipiDye II 是一款可用于长时间活细胞成像的高灵敏度优质脂滴染料试剂。此外,它还具有脂滴特异性高、毒性低和光稳定性高的优点。适用于以天数为单位的长时间观察、脂滴融合和分解过程的活细胞成像以及使用超高分辨率显微镜的超微小脂滴可视化。

LipiDye II 是LipiDye(#FDV-0010)的改良版试剂,关于LipiDye 的产品信息,请点击此处查看。

 

 本产品基于名古屋大学 变革生命分子研究所 山口茂弘教授、多喜正泰特任准教授的研究结果,由funakoshi株式会社进行商品化并销售

※ 本产品仅供研究用,请勿用于研究以外用途。

 

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

使用LipiDye II染色脂肪细胞和非脂肪细胞的案例

◆关于脂滴(Lipid droplet)和LipiDye

脂滴(Lipid droplet)是在脂肪细胞(Adipocyte)中发现的大型中性脂肪的结块,主要成分是甘油三酯(Triglyceride)和甾醇酯(Sterol Ester)的单分子层结构体(图1)。脂滴被认为是储存细胞内中性脂质的细胞器,并且有较多肥胖和疾病相关的报道。最近,除了脂肪细胞,还在肝细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等各种细胞中发现了脂滴。这些发现明确了其不仅仅是作为中性脂质的储存场所,还有抑制代谢和调节基因表达等各种功能。对各种细胞中的脂滴进行观察发现,非脂肪细胞的脂滴在1 μm以下,与脂肪细胞中的10~100 μm的脂滴相比较小(图2)。因此,可以利用成像来检测活细胞中非脂肪细胞的微小脂滴的试剂备受期待,但目前Nile Red等现有试剂会观察到脂滴以外的染色试剂(信噪比低),不适用于活细胞成像,观察微小脂滴仅限于电子显微镜观察。

而LipiDye 是一款可以显示高S/N比率的脂滴染色试剂,虽然检测1 μm以下的小脂滴的效果优异,但从光稳定性的观点来看,长时间活细胞成像的效果不佳。而LipiDye II 是名古屋大学 变革生命分子研究所(ITbM)的山口教授、多喜特任准教授为了解决上述问题而研发的新型脂滴检测试剂(参考文献中的名称为LAQ1),光稳定性非常高,毒性低,适合用于长时间稳定的活细胞成像。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

图1:脂滴的模式图及脂肪细胞(adipocyte)中可见的大型脂滴

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

图2:不同细胞类型中脂滴的成像图例

◆特点

● 不仅可以选择性浓缩脂滴,还会响应疏水性环境而发出荧光,因此可以抑制细胞质等的部分发光,对脂滴有着高信噪比(S/N比)

● 可检测非脂肪细胞中的小型脂滴(小于1 μm)

● 光稳定性高,长时间活细胞成像效果优异

● 由于不会褪色,可用于脂滴分解过程中的荧光观察

● 在推荐的使用浓度(0.1~1 μM)中几乎不显示细胞毒性。在已添加试剂的状态下,脂肪细胞分化过程的观察记录最长达8天

● 活细胞、固定细胞都可使用。也适用于活细胞染色后再固定处理的情况

● 也适用于STED超高分辨率显微镜。可观察到约200 nm(半峰全宽)的脂滴

◆关于荧光波长(激发/发射波长)

激发/发射波长:400~500 nm/490~600 nm

 虽然最大吸收为410~420 nm,但也可用450~500 nm范围的光源激发。详情请参考下方的激发/发射光谱数据

 可用800 nm激光进行双光子激发。详情请参考下方利用双光子显微镜观察小胶质细胞

 可进行多重染色,但需要注意波长的选择。请使用激发光在500 nm以上的染料。若使用在450 nm以下的范围内激发的普通蓝色荧光染料,可能

※ 会同时激发本试剂。

■ 光源示例

 激发光

 405 nm、 445 nm、 458 nm、 473 nm、 488 nm
 * 用488   nm激光也可以激发,但与405~473 nm激光相比所获得的荧光强度较弱,建议根据不同的实验目的对观察条件进行验证。

 光源+滤光片

 可利用一般的FITC或GFP滤片。

 STED超高分辨率显微镜

 推荐激发光:473   nm激光,STED光:660 nm激光

◆LipiDye与其他试剂相比的优点

试剂名称

颜色

激发光的波长

活细胞的染色

固定细胞的染色

光稳定性

延时成像

多重染色

S/N比率

LipiDye II

绿色荧光

400~500 nm

非常高

超长时间

可(注意波长的选择)

LipiDye

绿色荧光

400~470 nm

短时间

可(注意波长的选择)

Nile Red

红色荧光

~510 nm

不适合

不适合

荧光染料B

绿色荧光

~480 nm

可 

脂滴染色试剂A

红色绿色荧光

——

不可

未知

不可

Oil Red O

红色染料

——

不可

——

不可

——

◆参考文献

"Fused Thiophene-S,S-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets."

Taki, M., et al., ACS Mater. Lett., 3(1), 42~49 (2021)

◆参考数据

激发/发射光谱

LipiDye II是溶剂环境响应型荧光染料(Solvatochromic dye),会根据周围的分子极性改变荧光波长。吸收光谱几乎不受溶剂的影响,可观察到在380~500 nm的吸收(图A)。

 

● 推荐激发光:405 nm、445 nm、458 nm、473 nm激光

● 可使用的激发光:488 nm激光(由于荧光强度弱,建议根据不同的实验对使用浓度等进行验证。)

 

另外,荧光光谱依赖于溶剂极性,在甲苯和二氯甲烷等疏水性环境下会显示强烈的蓝~绿色荧光,但在乙腈、DMSO和水溶液等高极性环境下,极性越大,最大荧光就会转移至长波长一侧,对荧光强度的抑制就越明显(图B)。根据这个特性,可观察到脂滴在疏水性环境下的特异性绿色荧光。

用LipiDye II对细胞染色,用显微镜光谱扫描脂滴部分,评估脂滴的荧光,约在500 nm附近可观察到最大的荧光光谱(图C)。

 图A~图C的灰色阴影区域为推荐激发/荧光波长。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

光稳定性

用4%多聚甲醛固定处理3T3-L1脂肪细胞,再分别用新产品LipiDye II、旧款产品LipiDye 和传统的荧光染料B染色,之后使用共聚焦激光显微镜反复进行Z-stack成像(激发473 nm/荧光:490~540 nm),观察荧光强度的变化。在Z-stack成像中,每拍摄一次可获取10张2 μm的图像。传统染料B经过约5次的Z-stack成像后衰减明显,而相比之下,旧款产品LipiDye虽然有耐光性,但也观察到了缓慢的衰减,在经过50次的Z-stack成像后荧光衰减至60%左右。

而在本试剂LipiDye II中,即使经过50次(共计500次的光照射),其荧光强度也几乎不发生变化。显示了LipiDye II具有非常高的光稳定性,适用于长时间的延时成像(包括Z-stack成像)。

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细胞毒性

使用不同浓度的LipiDye II 处理 3T3-L1脂肪细胞,然后使用MTT Assay评估24 h后的细胞活性。本试剂的推荐使用浓度为0.1~1 μM,但至少在5 μM内未观察到细胞毒性。在10 μM以上才观察到细胞毒性。

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活细胞和固定细胞染色

用LipiDye II对活细胞状态下的3T3-L1脂肪细胞染色,然后在活细胞中进行荧光观察(左图)。之后,用4%多聚甲醛固定细胞,清洗后在固定状态下再次进行荧光观察(右图)。固定前后几乎未观察到荧光信号的变化。表明了本试剂除了可用于活细胞染色,也可兼容固定细胞的免疫染色。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

LipiDye®染色的活细胞和经PFA固定后的荧光强度的对比

◆应用数据

在各种细胞中的染色

LipiDye II(1 μm)分别染色3T3-L1、HepG2、COS-7、HeLa细胞,在共聚焦激光显微镜下观察绿色荧光(激发473 nm/荧光490~540 nm)(比例尺:20 μm)。在HepG2中,为使脂滴形成,用脂肪酸处理了1天。在HeLa细胞中可清晰地观察到1 μm以下的小脂滴(参考Hela细胞放大图像(右侧),比例尺:5 μm)。

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内质网(ER)标记及其多色成像

用LipiDye II(1 μm)对表达内质网(ER)驻留红色荧光蛋白(ER-mKO1)的COS-7细胞进行染色,使用共聚焦激光显微镜进行荧光观察(LipiDye II:激发473 nm/荧光490~540 nm,ER-mKO1:激发559 nm/荧光570~620 nm)。可以观察到COS-7细胞内部的小脂滴(<1 μm),并且大部分驻留于内质网结构的内侧(参考右侧的放大图,比例尺:1 μm)。该结果表明内质网中存在脂滴的生物合成。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

长时间观察脂肪细胞的分化过程

用LipiDye II在共聚焦激光显微镜下观察活细胞中诱导前脂肪细胞3T3-L1分化为脂肪细胞时,成熟脂滴的状态8天(激发473 nm/荧光490~540 nm)。前2天在含LipiDye II的分化培养基中培养3T3-L1细胞,之后每隔两天更换至含LipiDye II(1 μm)的维持培养基中,荧光观察共计8天。即使用LipiDye II进行长时间的处理,也没有细胞毒性和对脂肪细胞分化产生影响,可以观察到脂滴成熟的过程。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

活细胞成像中新生脂滴的动态行为分析

利用长时间延时成像(Z-stack成像),观察在诱导前脂肪细胞3T3-L1分化为脂肪细胞时新生脂滴的动态行为约24 h(共聚焦激光显微镜:激发473 nm/荧光490~540 nm,每10 min拍摄一次,Z-stack 20张/次)。向预先已经用LipiDye II染色的前脂肪细胞中添加分化培养基(含有LipiDye II),然后立即开始延时成像。分化诱导后约10 h,开始看到小脂滴的出现(650 min,白色箭头),可以观察到各脂滴在相互作用的同时,不断成长的状态(950~1450 min,黄色箭头)。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

观察脂滴分解·新生过程随着时间的变化

向分化诱导的3T3-L1细胞中添加腺苷酸环化酶激活剂Forskolin(10 μM)和磷酸二酯酶抑制剂IBMX(100 nM),观察在使用了LipiDye II的延时成像(Z-stack)中脂滴随着三酰基甘油的分解而缩小的过程(共聚焦激光显微镜:激发473 nm/荧光490~540 nm,800 min,每4 min拍摄一次,Z-stack 15张/次)。从图中可以看到原本的大脂滴(请参见白色箭头)随着时间的推移逐渐变小。另外,可以看到随着时间的推移又产生了许多小脂滴(黄色三角形)。

结果表明,LipiDye II具有非常高的光稳定性,无需担心褪色;并有着高信噪比,可以观察到微小的新生脂滴,因此可以定量观察脂滴的增减。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

利用STED超高分辨率显微镜可视化微小脂滴

用LipiDye II(1 μm)染色Hela细胞,使用激光共聚焦显微镜(Confocal)(激发473 nm/荧光490~540 nm)和STED超高分辨率显微镜(激发473 nm + STED 660 nm/荧光500~640 nm)对微小脂滴进行观察。STED观察图像显示的是经过反卷积处理的数据。从图中可以发现在共聚焦激光显微镜下较为模糊的微小脂滴,在STED显微镜中非常清晰,半峰全宽(FWHM)约为120 nm。

    关于STED显微镜的观察条件及分析方法,请见参考文献。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

利用双光子显微镜观察小胶质细胞

向大鼠原代培养小胶质细胞中添加LipiDye II(1 μm),染色过夜后,用4%PFA固定,然后在双光子显微镜下进行观察。可见LipiDye II使用双光子激发法也可以激发,可以检测原代培养小胶质细胞中尺寸各异的脂滴。

LipiDye Ⅱ                              高灵敏度脂滴长时间成像荧光染料

(数据提供:Dr. Hyun Beom Choi以及 Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia)

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产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
FDV-0027 LipiDye II ( Live Imaging)
LipiDye II(脂滴活细胞成像试剂)
0.1 mg

Enzo高灵敏度游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒


Enzo高灵敏度游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒

Enzo高灵敏度游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒


 

高灵敏度游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒

 

Enzo高灵敏度游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒

游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒

Free PSA ELISA Kit (ENZ-KIT145)

  游离前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺、尿道内膜、尿道球腺上皮细胞分泌的类激酶释放酶。它是单链糖蛋白,参与精液的液化过程,临床常用于前列腺良性与恶性疾病诊断与鉴别诊断及前列腺癌患者术后随访的重要指标。正常情况下极少量的PSA分泌到血液。PSA以多种形式存在于血清,不与蛋白结合,称为游离脂肪酸。良性或恶性肿瘤情况下,都可以提高循环中PSA水平。血液中游离PSA和总PSA的比例对确定总PSA升高患者的前列腺异常非常重要。该ELISA试剂盒能在2个小时内定量检测游离PSA。

特点:

高灵敏度,低至40 pg/ml

不与相似蛋白(KLK2ACT,结合PSA

高通量形式,2小时内检测40个样品

完全定量,结果优于半定量免疫印迹

 

研究领域:

良性前列腺增生

前列腺肿瘤

前列腺炎

 

高灵敏度的游离前列腺特异性抗原检测ELISA试剂盒

Enzo高灵敏度游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒

游离前列腺特异性抗原ELISA试剂盒的标准曲线(ENZ-KIT145)

  

 产品编号

产品名称

规格

 ENZ-KIT145-0001

 Free PSA ELISA kit

 96 wells

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 PSA pAb

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新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用


新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用




◆前言


  外泌体是各种细胞外泌的直径在30-100nm之间的膜囊泡。因外泌体内含mRNA、microRNA等核酸和蛋白质对相邻细胞具有交换信息的功能。作为细胞间信号传导的通讯工具和作为癌等各种疾病的生物标记话题比较热议[1][2]。因此,这几年各领域关于外泌体研究很广泛,但是在现实的外泌体实验技术的发展中,关于需要改进的课题存在很多。例如,在外泌体纯化方法中超离心分离法和多聚体沉淀法(市售试剂盒),容易混入多种杂质,在后续实验中增加了很多障碍。另一方面,抗体亲和性和密度梯度离心可获得高纯度外泌体,但是不能获得完整状态。因此存在着不能分析外泌体完整状态下的生理功能。作为外泌体进一步检测方法,免疫印迹和ELISA被广泛应用。但是存在着需要大量外泌体样本和标记蛋白量少导致检测较困难的问题。

  因此本文为了解决外泌体实验技术中各种课题,我们关于开发的新型外泌体分析工具进行了说明。



◆磷脂酰丝氨酸亲和性新型外泌体纯化法


  外泌体膜虽然含有分泌细胞源蛋白质和脂质,但众所周知磷脂酰丝氨酸(PS)在活细胞通过翻转酶作用导向细胞膜内侧,也会暴露在外泌体膜外侧[3]。另外,被作为通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4(Tim4)蛋白质通过细胞外域IgV域与含有钙离子的PS结合[4]。以上述知识为参考,我们利用Tim4固化磁珠,在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体,再添加螯合剂可纯化外泌体,这种划时代外泌体纯化方法是和金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发,并取得了成功。[5]并且MagCapture Exosome Isolation Kit PS实现了比以前的外泌体纯化法更加简捷地纯化高纯度完整状态的外泌体。这是迄今为止取代黄金标准超速离心法的新型外泌体纯化法。(图1)


新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

◆PS Capture Exosome ELISA Kit的特点和使用案例


  PS Capture Exosome ELISA Kit是Tim4蛋白通过PS和外泌体亲和性结合的应用ELISA试剂盒。本试剂盒将外泌体表面标记蛋白的抗体固相化,相比以前的ELISA法,可高灵敏度检测外泌体。此方法是将培养上清和血清等含有外泌体的样本添加到Tim4蛋白包被的干板,在钙离子存在下捕获外泌体,通过对外泌体表面标记蛋白质进行一抗结合反应和二抗结合反应,从而完成对外泌体检测(图2)。此外,本试剂盒附加了可作为一抗的小鼠抗CD63单抗,但除此之外,如果测定外泌体表面标记的话,需提前准备小鼠源一抗方可检测外泌体。


新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

  本试剂盒的优点就是实现了比免疫印迹和已有的Exosome ELISA产品更高灵敏度检测外泌体。首先,为了用本试剂盒和免疫印迹法比较检测灵敏度,在免疫印迹实验中需要检查外泌体检测极限值(图3a)。结果显示,以人结肠癌细胞的COLO201细胞源纯化外泌体作为样本通过抗CD63单抗进行免疫印迹实验,检测出蛋白质含量75ng的外泌体。然后,用本试剂盒检测纯化的白血病源细胞株K562细胞以及COLO201细胞源外泌体的ELISA检测极限值,K562细胞源外泌体的检测极限值为49.9pg,COLO201细胞源外泌体检测极限值为10.9pg。免疫印迹实验实际具有1000倍以上的检测灵敏度(图3b)。另外,已有Exosome ELISA产品的灵敏度在数ng~µg之间(参考各产品手册),但是本试剂盒通过PS与Tim4蛋白亲和性结合比原来外泌体表面标记抗体包被ELISA法在灵敏度上高出100倍以上。

新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

  最后,本试剂盒的使用案例为各种细胞源外泌体表面标记蛋白的表达分析。用13种细胞培养上清纯化的外泌体各1ng,通过外泌体标记蛋白CD9/CD63/CD81的抗体进行ELISA检测(图4)。结果显示,在各外泌体中表面标记蛋白的存在比例因来源细胞不同而存在明显差异。有的细胞株分泌不具有特定标记蛋白的外泌体,外泌体异质性高且明显的数据说明本试剂盒的ELISA系统是十分优质的。


新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

◆结论


  综上所述,利用Tim4蛋白的PS亲和性原理的MagCapture Exosome Isolation Kit PS实现了可简便高灵敏度纯化外泌体。PS Capture Exosome ELISA Kit是高灵敏度检测外泌体的划时代产品。为此,通过使用本试剂盒对原方法混入杂质后外泌体标记蛋白确认分类问题和至今为止免疫印迹实验以及已有Exosome ELISA产品微量表面标记蛋白检测困难等问题都可解决。今后本公司将会利用Tim4蛋白的PS亲和性能开发外泌体研究相关试剂。真诚希望这些产品为外泌体研究发展做出贡献。



参考文献


[1] Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 (2016).

[2] Raimondo, F. et al. : Proteomics,11, 709 (2011).

[3] Trajkovic, K. et al. : Science,319 (5867), 1244 (2008).

[4] Miyanishi, M. et al. : Nature, 450, 435 (2007).

[5] Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 (2016).

◆相关产品

1. Exosome外泌体试剂盒

2. PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒(抗小鼠IgG POD)

无动物参与的高灵敏度皮肤致敏测试法“ADRA”


无动物参与的高灵敏度皮肤致敏测试法“ADRA”

无动物参与的高灵敏度皮肤致敏测试法“ADRA”




  本文摘自和光纯药时报Vol.87 No.1(2019年1月号),由FUJIFILM株式会社环境与品质管理部安全性评估中心山本裕介教授、藤田正晴教授、笠原利彦教授以及勝岡尉浩教授共同执笔。


无动物参与的高灵敏度皮肤致敏测试法“ADRA”

 

◆前言


  从动物福利的观点出发,动物实验的规定正在世界范围内不断推进。从1993年开始,欧盟开始分阶段实施化妆品成分的动物实验规定,2013年之后,欧盟各国全面禁销含有进行过动物实验的原料的化妆品[1]

  在这样的背景下,不使用动物的安全性测试(动物试验替代法)的开发迫在眉睫,皮肤刺激性、眼睛刺激性、皮肤腐蚀性、皮肤致敏性、光毒性等的动物实验替代法作为获国际认可的方法,被列入经济合作与发展组织(OECD)的测试指南(TG)中。2006年,日本修订并实行动物爱护管理法[2],此后,3R原则在实验动物中得到了加强。

  对此,日本也积极推动动物实验替代法的开发,替代眼睛刺激性测试的体外短时暴露试验[3](STE,Short Time Exposure in vitro test method)(OECD TG491)、替代皮肤致敏测试的细胞系活化试验[4](h-CLAT,human Cell Line Activation Test)(OECD TG442E ; ANNEX I)以及IL-8 Luc试验[5](IL-8 Luc assay,Interleukin-8 Reporter Gene Assay)(OECD TG442D ; Appendix IA)都被列入了测试指南中。

  另外,日本还开始研发替代法需要用到的材料,使用3D培养皮肤模型的用于替代皮肤刺激性测试的重组人表皮试

[6](Reconstructed Human Epidermis Test Method,OECD TG439)和使用3D培养角膜模型的用于替代眼睛刺激性测试的重组类似人角膜表皮试验[7](RhCE,Reconstructed Human Cornea-like Epithelium Test Method)(OECD TG492),都采用了Japan Tissue Engineering Co., Ltd.生产的皮肤和角膜模型。

  除上述化妆品行业外,欧盟的《化学品的注册、评估、授权及限制法规》——REACH法规在2016年6月也修订了REACH附录Ⅶ和Ⅷ,规定每年生产和进口不超过10吨的物质必须使用动物实验替代法来作为皮肤腐蚀性、皮肤刺激性、眼睛刺激性和皮肤致敏测试的标准测试法。

  本文将为大家介绍新开发的试替代皮肤致敏测试的氨基酸衍生物反应法(ADRA,Amino acid Derivative Reactivity Assay)。

 


◆皮肤致敏的机制与替代法


  皮肤致敏是一种由皮肤暴露在化学物质下引起的过敏反应。皮肤致敏性会使体内的免疫系统将化学物质记忆为异物,因此,当皮肤再次暴露在化学物质时就会表现出过度的反应,引起红斑(发红)、水肿(肿胀)和水疱(水泡)等症状。另外,皮肤致敏性与皮肤刺激性的反应不同,免疫系统的过度反应会导致更严重的症状。此外,由于反应涉及到免疫系统,所以从皮肤暴露在致敏物质中到症状的出现是一个复杂的过程。OECD定义了该过程中的四个关键事件:1.蛋白与致敏物质的结合,2.角质细胞的活化,3.树突状细胞的活化,4.T细胞的增殖[8]

  目前,使用较为广泛的in vivo(体内)皮肤致敏测试法就是用小鼠进行的局部淋巴结试验(LLNA,Local Lymph Node Assay),是以关键事件4为基础的评估法。而动物实验替代法收录了6种以除关键事件4外的其他三个关键事件为基础的测试法,包括以关键事件1为基础的直接肽反应试验[9](DPRA,Direct Peptide Reactivity Assay)(OECD TG442C),以关键事件2为基础的ARE-Nrf2荧光素酶试验[10](ARE-Nrf2 luciferase test method,KeratinoSens™)(OECD TG442D ; Appendix IA)和ARE-Nrf2 Luciferase LuSens[11](OECD TG442D;Appendix IB),还有以关键事件3为基础的h-CLAT[4], U937皮肤致敏试验[12](U-SENS,U937 Skin Sensitization Test)(OECD TG442E;ANNEXⅡ)和 IL-8 Luc试验[13]

  致敏物质进入人体后和蛋白结合,形成复合物,被免疫细胞之中的树突状细胞吸收后,该复合物被视为抗原(异物)。这种蛋白与致敏物质结合形成复合物的过程就是关键事件1,和2015年被收录于TG的DPRA相同,笔者团队开发的ADRA也是一种利用过程来评价反应性的测试法。

 


◆ADRA和DPRA的原理比较


  蛋白与致敏物质的结合,主要是通过蛋白中的巯基,以及半胱氨酸或赖氨酸的氨基的共价结合来实现的[13,14]。因此,DPRA使用含有半胱氨酸的肽和含有赖氨酸的肽,通过这两种肽与待测物质的反应性来评价致敏物质与蛋白的结合性能[15]


无动物参与的高灵敏度皮肤致敏测试法“ADRA”

图1. NAC和NAL的结构式

 

  相比之下,ADRA运用了在半胱氨酸和赖氨酸两种氨基酸中引入了带萘环的新型氨基酸衍生物,N-(2-(1-Naphthyl)acetyl)-L-cysteine(NAC)和α-N-(2-(1-Naphthyl)acetyl)-L-lysine(NAL)(图1),通过测试它们与待测待测物质的反应结果来评估致敏物质与蛋白的结合性能[14,15,16]

  测试步骤如下。首先,在96孔板上配制NAC、NAL和待测物质以1:50的摩尔比混合的反应溶液,在25℃中遮光孵育24小时。24小时后加入三氟乙酸(TFA)水溶液终止反应,然后用HPLC检测待测物质和未反应的NAC、NAL的量,从而算出待测物质的NAC、NAL的反应性(图2)。DPRA和ADRA一样,在肽与测试物质反应24小时后,用HPLC定量未反应的肽,以计算待测物质的反应性。


无动物参与的高灵敏度皮肤致敏测试法“ADRA”

图2. ADRA测试法的流程

 

  与使用培养细胞或生物来源成分的体外(in vitro)测试不同,ADRA 和 DPRA只评价物质的化学反应(in chemico测试),是一种重复性好、精确度高的简易测试法。

  尽管基本原理和测试程序相同,但ADRA用NAC和NAL来替代了肽,所以ADRA在许多方面都优于DPRA。

 

表1. ADRA与DPRA的比较表

ADRA

DPRA

试剂

亲核试剂

种类

NAC

NAL

含有半胱氨酸的肽

含有赖氨酸的肽

在反应溶液中的浓度

5 µM

500 µM

抗氧化剂

0.2 µM EDTA

无需添加

无需添加

待测物质溶液

溶剂的种类

①水,②乙腈,③丙酮,④DMSO/乙腈

①乙腈,②水,③乙腈/水,④异丙醇,⑤丙酮,⑥丙酮/乙腈,⑦乙腈/ DMSO

在反应溶液中的浓度

0.25 mM

5 mM

25 mM

缓冲液

种类

磷酸缓冲液

磷酸缓冲液

醋酸铵缓冲液

pH

8.0

10.2

7.5

10.2

反应

反应容器

96孔板

HPLC用瓶

亲核试剂所需量

约0.3 µg/孔

约400 µg/瓶

待测物质所需量

(分子量按200计算)

0.01 mg/孔

0.2 mg/瓶

1 mg/瓶

反应液总量

200 µL

1000 µL

温度

25 ℃

时间

24小时

终止反应

终止液

溶液

TFA溶液

添加量

50 µL

HPLC检测

检测波长

281 nm

220 nm

分析时间

20分钟/试剂

20分钟/试剂

EDTA:乙二胺四乙酸

TFA溶液:2.5%(v/v)三氟乙酸水溶液

 

  在DPRA中,反应溶液中待测物质的浓度高达5~20 mM,待测物质经常会出现沉淀的现象,并且需要在220 nm短波长下定量这两种肽,因此会出现与待测物质来源的峰重叠的情况(共出峰),从而无法正确地评估致敏性。

  另一方面,由于NAC和NAL具都有萘环,所以它们可以在281 nm处定量,比DPRA长约60 nm。所以几乎不与待测物质来源的峰共出峰。另外,NAC和NAL在HPLC中的检测灵敏度高,反应溶液中待测物质可以在0.2 mM的浓度(浓度为DPRA的1/100)下进行测试,基本上不会析出待测物质。

  除此之外,DPRA中含半胱氨酸的肽的氧化和二聚化会降低定量的准确度,但作者发现,金属离子会参与巯基的氧化,所以在ADRA中向NAC的反应溶液加入极微量的EDTA,能改善NAC的稳定性[17]

  DPRA中含半胱氨酸肽的二聚体在反应溶液中的析出可能会影响HPLC的检测,而且不能对它的二聚化进行定量。而在ADRA中,可以通过HPLC定量而不会析出NAC二聚体,即使NAC发生氧化,也能容易判断出对测试系统的影响。

  除了上述要点之外,ADRA还能在HPLC的检测过程中添加终止液来抑制反应的进行,获得比DPRA误差更少且更稳定的数据,与在HPLC瓶中配制反应溶液的DPRA不同,ADRA使用96孔板和多通道移液器,可实现高通量,是一种通用性好、操作性优越的高精确度测试法。

 


◆ADRA的致敏评估能力


  动物实验替代法需要进行与动物实验相同的安全性评估。为了确认ADRA和动物实验一样能对化学物质进行皮肤致敏评估,作者用建立DPRA测试法时使用过的82种物质对LLNA进行预测准确度评估。结果显示ADRA的预测准确度高达87%[18]

  综上,ADRA是一种非常有效的测试法,自2016年以来,作者一直致力于将ADRA收录在OECD测试指南中。2017年,四所研究机构参与了评估ADRA重复性与有效性的验证实验,而该实验在相同仪器与不同仪器间也获得了非常高的可重复性。目前,作者正根据此结果申请将ADRA收录于测试指南中。

 


◆今后的展望


  如本文所述,ADRA在很多方面都优于DPRA,与其他体外替代法相比,无需使用培养细胞的ADRA还具有众多优点,如无需使用特殊设施、设备及无菌操作等技术,测试周期短、价格低、重复性良好等。

  欧盟禁止化妆品原料进行动物实验后,化妆品行业对动物实验替代法的需求不断提高;另外,在REACH法规修订后,动物实验替代法也被纳入到除化妆品原料外的一般化学品的安全性评估中。今后,ADRA有望在化妆品行业以外等更广泛的领域中得到进一步应用。

 


◆关键词


3R原则

指"Replacement:替换为不使用动物的方法"、""Reduction:减少动物数量的使用"和"Refinement:减轻实验对动物带来的痛苦"的3点动物实验原则。

 


◆参考文献


[1]

EU化粧品指令 (第7次改正) European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN

PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 27 February 2003,amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products", Official J. 

European Union, L66/26 (2003).


[2]

環境省告示,「動物の愛護及び管理に関する施策を総合的に推進するための基本的な指針」,平成 25 年 8 月30日,第 80 号 (2013).


[3]

OECD : "Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying I) Chemicals Inducing Serious

Eye Damage and II)Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye 

Damage", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 491 (2018).


[4]

OECD : "ANNEX Ⅰ : In Vitro Skin Sensitisation : Human Cell Line Activation Test (h-CLAT)", OEC

Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).


[5]

OECD : "ANNEX Ⅲ : In Vitro Skin Sensitisation : IL-8 Luc assay", OECD Guideline for the Testing of

Chemicals 442E (2018).


[6]

OECD : "In Vitro Skin Irritation : Reconstructed Human Epidermis Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 439 (2013).


[7]

OECD : "Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage", OECD Guideline

for the Testing of Chemicals 492 (2018).


[8]

OECD : OECD Series on Testing and Assessment, 168, 1 (2014).


[9]

OECD : "In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)", OECD Guideline for 

the Testing of Chemicals 442C (2015).


[10]

OECD : "Appendix IA : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase KeratinoSens™ Test

Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018).


[11]

OECD : "Appendix IB : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase LuSens Test Method",

OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018).


[12]

OECD : "ANNEX Ⅱ : In Vitro Skin Sensitisation : U937 Cell Line Activation Test (U-SENS™)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).


[13]

Roberts D. W. et al. : Chem. Res. Toxicol., 20, 1019 (2007).


[14]

Ahlfors, S. R. et al. : Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16, 59 (2003).


[15]

Gerberick, G. F. et al. :Toxicol. Sci., 97, 417 (2007).


[16]

Fujita M. et al. : J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 70, 94 (2014).


[17]

Yamamoto Y. et al. : J. Appl. Toxicol., 35, 1348 (2015).


[18]

Fujita M. et al. : J. Appl. Toxicol., in press, (2018).


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Compatibility of POLYVIEW® IHC Detection Reagents and HIGHDEF® IHC Chromogens with Automated IHC Slide Stainers

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资料图 : IHC是必不可少的检测工具
 

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◆特点


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MITO-ID® 表现出出色的灵敏度

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线粒体膜电位降低在CCCP浓度函数中显示为橙色信号的下降。MITO-ID® 膜电位染料

比常用染料JC-1对线粒体电位损失的敏感性至少高10倍。


  Enzo为早期安全性高通量评估提供了全套工具,包括SCREEN-WELL® 毒性库,基于细胞的检测,如凋亡氧化应激细胞活性等。(详细可点击文字)

产品列表

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包装

ENZ-51019-KP002

线粒体膜电位(细胞毒性)试剂盒(微孔板)

Mito-ID® Membrane potential cytotoxicity   kit for microplates

1 Kit

ENZ-51018-K100

线粒体膜电位检测试剂盒(流式和荧光显微镜)

Mito-ID® Membrane potential detection kit   for microscopy and flow cytometry

100 tests

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Wako高灵敏度激酶荧光检测试剂盒

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  该新型高灵敏度激酶荧光检测试剂盒可用于定量检测酶反应的生成物ADP诱导试卤灵产生的高灵敏度荧光,即可以定量激酶、糖基转移酶和其他ADP生成酶的活性。

◆产品特点

 ● 高灵敏度 使用5 μl的微量样本可以得到Z'-factor值在0.8以上的高灵敏度结果

 ● 通用性高,适用于多种目标酶的通用检测法包括500种以上的激酶、ATP酶、乙酰-CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶等

 ● 高通量检测,可用384孔微孔板检测

 ● 检测成本低廉

 ● 不会受到在酶检测中经常使用的缓冲液成分及添加剂、ATP的影响

 ● 酶耦合反应的操作简单快捷

◆荧光强度(激发波长540nm,荧光590nm)

Wako高灵敏度激酶荧光检测试剂盒   Wako高灵敏度激酶荧光检测试剂盒

图1. 本方法的ADP、UDP、GDP、CMP的校准曲线往少容量384孔微孔板里添加5μl各种核苷酸液体,并使用本方法进行校准曲线法测定。此数据是2次测定的平均值。

          图2.激酶检测的一例

   以CMP作为底物,使用本检测法测定NMP激酶的活性

应用领域:激酶抑制剂筛选

     激酶活性测定

     ADP产生酶活性解析

目标客户研究领域:可用于治疗癌症等重大疾病的分子靶向药物的激酶选择性抑制剂的筛选,可用于大规模化合物的高通量检测。

◆产品列表

产品编号

产品名称

规格

291-77401

Fluorospark™ Kinase/ADP Multi-Assay Kit

1,000次

297-77403

1,0000次

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高特异性、超高灵敏度的Enzo神经科学ELISA试剂盒


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◆简化的神经递质的检测和定量


神经递质是一种负责将信息在突触之间传递的化学信使。这些信使通过与突触后膜受体结合,启动抑制或兴奋反应。我们的神经递质ELISA试剂盒可以高灵敏度准确地对关键的神经递质进行定量,包括组胺、催产素、肽YY和血清素。我们的神经递质ELISA试剂盒已证实能应用于多种样本,非常适合您对神经科学研究的需求

 


◆组胺ELISA试剂盒


● 省略了酰化步骤

● 能对组胺进行高灵敏度的测量,低至0.03 ng/mL

● 100%的N-甲基组胺交叉反应

● 在血清和血浆中检测组胺,在尿液中检测N-甲基组胺

● 高通量测量,能测定最多40个样本,每个样本两次重复,两个小时内即可获分析结果


我们还提供了用于高通量测试的组胺对照物。

产品编号

产品名称

规格

ENZ-KIT140-0001

Histamine ELISA kit
    组胺 ELISA 试剂盒

96 wells

ENZ-KIT140-CTL

Histamine Controls 
组胺对照物 

1 Set


◆多巴胺ELISA试剂盒


● 高灵敏度的ELISA分析,能对低含量的多巴胺进行定量测定

● 两个小时内即可得到定量结果

● 每个96孔板能提供最多40个样本、每个样本两次重复的高通量的免疫测定

● 预包被的96孔板能够减少错误的发生并且节省时间


产品编号

产品名称

规格

ENZ-KIT188-0001

Dopamine ELISA Kit
多巴胺ELISA试剂盒

96 wells

◆催产素ELISA试剂盒


● 能检测多种不同样品中的催产素含量,低至15 pg/mL

● 对加压素的检测可忽略不计,检测的可信度高

● 已证实能应用于来自任意物种的多种样本

● 与液相色谱-质谱联用法相比,速度更快,花费更低

● 广泛应用在同行评议的文献中

产品编号

产品名称

规格

ADI-900-153A-0001

Oxytocin ELISA kit
催产素ELISA试剂盒

96 wells

ADI-901-153A-0001

96 wells×5



◆5-羟色胺ELISA试剂盒


● 能对5-羟色胺进行高灵敏度的检测,低至0.293 ng/mL

● 不需要对标准品和样本进行酰化处理

● 已证实能应用于任意物种的血小板、血浆、血清和尿液样本

● 高通量测量,能测定最多39个样本,每个样本两次重复,三个小时内即可获分析结果


我们还提供了用于高通量测试的5-羟色胺对照物

产品编号

产品名称

规格

ADI-900-175

Serotonin ELISA kit
    五-羟色胺酶联免疫试剂盒

96 wells

ALX-550-328-M050

Serotonin . Hydrochloride
    5-羟色胺盐酸盐 

50 mg

ALX-550-328-M250

Serotonin . hydrochloride 
    5-羟色胺盐酸盐 

250 mg

ALX-550-328-G001

Serotonin . hydrochloride  
    5-羟色胺盐酸盐 

1 g


Enzo 1.5小时高灵敏度维生素D ELISA试剂盒


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生产厂家:shimadzu 岛津

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