新型无血清细胞冻存：让细胞冻存不再“虐心”

　　“在细胞培养的路上，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的瓶皿之中，细胞点点，引无数英雄竞挂东南枝。正所谓“万事开头难”，即便是细胞复苏与保存这两件看似简单的事情，也能造成实验汪内心无比巨大的阴影面积。”在2016年10月一篇名为：实验新人必读：细胞培养那些事儿。详细阐述了细胞冻存相关问题。引起了细胞生物学的重视。
 

　　在细胞冻存中存在三大问题。一、冻存液的配方；二、冻存的分步降温；三、冻存液稳定性。
　　一般的冻存液配方基本具有三要素：培养基、血清、DMSO。培养基的选择要根据细胞种类。血清大多采用动物源血清，但血清中未知成分和感染物质会给冻存带来影响与风险。DMSO在细胞冻存中要保持在5%~15%范围内，过少会影响复苏，过多对细胞有毒性。综上所述，这么多因素制约着细胞冻存，稍不注意让您的细胞研究就会变得很“虐心”。
　　细胞冻存时要严格进行梯度降温（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火两重天的生活环境只会让娇弱的细胞自爆身亡，谨记：缓降温！但如果真心赶时间时，可以使用细胞冻存盒进行细胞冻存，而后尽快将其转入液氮中。
冻存液稳定性，无血清的稳定性比含血清稳定性高。与含血清类型相比，批次间的成分组成差异小，可保持稳定的品质。不含血清，因此没有因动物源的未知成分和感染物质所产生的影响与风险。可对无血清驯化细胞进行冷冻，节省再驯化步骤。
　　日本Wako推出一款无血清细胞冻存液——BAMBANKER^®，这款产品是细胞冻存研究的革新，那么它“新”在哪里呢？具有几大特点，无血清、无需分步降温，直接使用、无需程序降温盒，即用型细胞冻存液。完全解决了上述所有的不良因素。

　　那么有些读者要问了，这么优质的冻存液真正在应用方面怎么样呢？下面一张图片可以直观地看到其冻存液的“多样性”。
 

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间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

外泌体再生医学的实现之路

富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所

丸谷祐树、山根昌之

◆前言

细胞外囊泡（Extracellular vesicle : EV）是由细胞释放的脂质双分子层包被的膜囊泡，作为细胞间的通讯工具发挥作用。外泌体属于EV的一种，被认为参与多种生物功能的控制，并有望用作疾病生物标记物或治疗制剂。在治疗制剂的应用方面，具有抗炎和抗纤维化作用的间充质干细胞（Mesenchymal stem cell：MSC）来源外泌体备受瞩目，其未来的实用性被寄予厚望。对MSC来源外泌体实际应用的期望不断提升，同时外泌体作为治疗制剂的生产技术研发也在积极进行。

本文将介绍由FUJIFILM Wako自主研发的无血清培养基，在生产用于治疗的MSC来源外泌体方面的实用性。

◆MSC来源外泌体

以CD9、CD63和CD81等作为标记蛋白的外泌体，由细胞释放的、直径在30-100 nm左右的脂质双分子层包被的膜囊泡，含有蛋白、核酸（DNA、mRNA、miRNA）、脂质等细胞来源成分^1，2）。另外，MSC来源于中胚层的成体干细胞，能够从骨髓、脂肪、脐带等组织中建立，具有分化为脂肪、骨骼和软骨的功能。除此之外，MSC还具有诱导抗炎、抗纤维化或免疫抑制等旁分泌效应，近年来有人提出这些作用是由外泌体引起的^3）。在此背景下，将MSC来源外泌体作为治疗制剂的关注度急剧攀升。

◆MSC来源外泌体产生用无血清培养基的研发背景

关于在产生MSC来源外泌体时所用的培养基，起初使用的是几种添加了不含牛来源外泌体的胎牛血清（EV-depleted FBS）的基础培养基^4，5）。然而，这些组分均以维持MSC存活为目的，能够优化外泌体分泌和生物活性效果的组分尚未研发成功。

为此我们研发了一款可为MSC产生外泌体提供适宜的环境的无血清、无动物培养基，即为可同时维持高性能和高生物活性的EV-Up™基础培养基及补充剂（下称EV-Up™培养基）。

◆使用EV-Up™培养基培养获得的外泌体产量及活性

EV-Up™培养基的推荐使用方法是，在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合，然后更换培养基并培养 3-5 天（图1）。从血清培养基更换为无血清培养基时，多数情况下都需要进行驯化操作，但在含FBS的血清培养基中增殖的细胞，也能够直接更换EV-Up™培养基培养。

图1. EV-Up™培养基的建议操作流程

           在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合后，更换至EV-Up™培养基。然后培养 3-5 天，回收培养上清。可以通过PS亲和法从回收的培养上清液中回收外泌体。

在血清培养基中使骨髓来源的MSC增殖，然后更换至含EV-depleted FBS的基础培养基或EV-Up™培养基中，检测培养5天后的细胞数和细胞生存率。结果显示，细胞数和细胞生存率均维持在较高的状态下（图2 – A、B）。

图2. 使用EV-Up™培养基培养MSC的细胞生存率

更换至EV-Up™培养基5天后，测得的细胞数（A）和细胞生存率（B）。

接着，利用纳米粒子追踪分析法（NTA)比较使用PS亲和法纯化的外泌体粒子数^6）。结果表明，使用EV-Up™培养基获得的外泌体，其粒子数约为使用含EV-depleted FBS的基础培养基的2.6倍（图3A）。进一步通过基于PS亲和法外泌体定量技术的PS ELISA比较外泌体产量，可确认和粒子数一样，外泌体标记蛋白CD9、CD63 和CD81都有所增加^6，7）（图3 B）。

图3. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体粒子数及外泌体标记蛋白

从各培养基中取培养上清1 mL，通过NTA比较获得的外泌体粒子数（A）以及通过PS ELISA分析外泌体标记的结果（B）。

最后，评估对人胎肺来源正常成纤维细胞（TIG3）的纤维化抑制效果，以比较在各培养基中培养的MSC来源外泌体的生物活性。结果表明，相比常规使用的基础培养基和含EV-depleted FBS的培养基，采用EV-Up™培养基培养的MSC来源外泌体具有更好的抗纤维化效果（图4）。

图4. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体生物活性（抗纤维化活性）

向TGFβ刺激的人胎儿肺源性成纤维细胞（TIG3细胞）中添加PS亲和法纯化的外泌体5×10⁸ particles/mL，

利用Real-Time PCR法定量纤维化标记（αSMA，Collagen Ⅲ）的基因表达，比较抗纤维化活性。           

以上结果显示，EV-Up™培养基可以高产量制备维持高生物活性的MSC来源外泌体，是一款创新性的培养基。

◆结语

此次我们研发的EV-Up ™培养基是针对MSC优化的无血清、无动物来源的外泌体生产用培养基，不仅能提升高活性外泌体的产量，因其无血清、非动物源，还可能有助于提高治疗制剂开发过程中的质量稳定性。今后使用外泌体作为治疗制剂的应用化将会在世界范围内不断发展，期待我们研发的培养基作为实用的生产技术工具得到广泛运用。

〔参考文献〕

1） Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255（2014）.

2） Mathieu, M. et al. : Nat. Cell Biol., 21（1）, 9（2019）.

3） Phinney, D. G. and Pittenger, M. F. : Stem Cells, 35（4）, 851（2017）.

4） Rajendran, R. L. et al. : Sci. Rep., 7（1）, 15560（2017）.

5） Lai, R. C. et al. : Stem Cell Res ., 4（3）, 214（2010）.

6） Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935（2016）.

7） Ma, Y. et al. : Sci. Rep., 11（1）, 13471（2021）.

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为什么要进行无血清培养

◆为什么要进行无血清培养

●　血清批间差大，导致细胞生长不稳定，从而出现细胞制品质量和实验结果重复性差的问题

●　血清含有抑制多种细胞生长的因子，会使得一些细胞无法正常生长

●　血清存在外源病毒和致病因子的污染风险

●　血清成分增加生物制品的纯化难度

◆无血清培养解决方案

更多细胞治疗、基因治疗、重组蛋白、抗体表达、疫苗生产用无血清培养基，请咨询富士胶片和光。

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