第4回 小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死后炎症和修复的控制机制

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

东京都医学综合研究所 脑中风再生项目 庆应义塾大学药学系生化学讲座 大谷健人

东京都医学综合研究所 脑中风再生项目 日本医疗研究开发机构 七田崇

◆前言

在日本，脑梗死约占脑中风的80％，是造成植物人状态和死亡的的主要原因。脑梗死，是由于大脑血流量的减少使得向脑组织供应的氧气和营养物质不足，从而导致脑组织缺血性坏死（梗塞）。脑缺血会引起各种各样的细胞应激，炎症就是其中的应激反应之一。在脑缺血后的炎症中，常驻于脑组织中的巨噬细胞即小胶质细胞和伴随血脑屏障的破坏浸润脑组织的巨噬细胞会产生炎性细胞因子。

小胶质细胞和巨噬细胞对脑梗死后的炎症作用会持续数日，之后便不会再产生炎性细胞因子。但是，为了促进脑组织的修复，小胶质细胞和巨噬细胞的作用会发生改变。最近，关于小胶质细胞和巨噬细胞作为炎性细胞和修复细胞起作用的分子机制屡见报道。本文在讨论脑梗死后的炎症和通过巨噬细胞进行神经修复的分子机制的同时，还阐述了以小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死中的功能为靶点的治疗药物的开发前景。

 

 

◆在脑梗死后的炎症中小胶质细胞和巨噬细胞的作用

由于血脑屏障的破坏，在血液中循环的巨噬细胞会浸润脑组织。众所周知，巨噬细胞浸润大脑内少不了趋化因子，尤其是CCL2（C-C motif chemokine 2）与它的受体CCR2（C-C chemokine receptor 2）在巨噬细胞浸润脑组织时起着重要的作用^1）。CCL2由缺血性脑组织中的细胞产生。研究发现，若缺损CCL2，巨噬细胞对脑组织内的浸润就会减弱，如果在抑制脑梗死病发后的早期抑制巨噬细胞浸润的话，可以减轻大脑内的炎症，达到保护大脑的效果^2）。因此，我们认为CCL2-CCR2的相互作用对于炎性巨噬细胞的大脑内浸润非常重要。

如果由于缺血引起组织坏死的话，组成组织的物质就会被释放，而这些被释放的物质中含有会引起炎症的分子，被称为DAMPs（Damage-associated molecular patterns）^3）。DAMPs会激活在小胶质细胞和巨噬细胞中表达的模式识别受体（Pattern recognition receptors : PRRs），从而引起脑梗死后的炎症（图1）。脑梗死后的主要DAMPs有HMGB1（High mobility group box1）和PRX（Peroxiredoxin）。

图1. 脑梗死后引起的炎症

从缺血性坏死的脑细胞中释放出HMGB1、PRX等DAMPs。HMGB1破坏血脑屏障，使得血液中的巨噬细胞浸润脑组织。DAMPs通过TLRs等模式识别受体激活小胶质细胞和巨噬细胞，诱导炎性细胞因子的产生，从而引起脑梗死后的脑水肿和进一步的神经损伤。

 

HMGB1 作为存在于细胞核内的DNA结合蛋白被发现。在脑组织中主要是神经细胞产生HMGB1，在脑缺血2~4 h后，可观察到HMGB1被释放至神经细胞外的状态^4，5）。HMGB1使脑组织中MMP9（Matrix metalloproteinase 9）的表达升高，促进了血脑屏障的破坏从而导致炎症加重^6）。而且HMGB1会激活中性粒细胞，诱导被称为NETs （Neutrophil extracellular traps）即中性粒细胞胞外诱捕网的释放^7）。中性粒细胞胞外诱捕网是由基因组DNA和弹性蛋白酶、髓过氧化物酶等杀菌酶组成的复合物，被认为在感染和炎性疾病中具有排除病原体和加重组织中炎症的作用，由中性粒细胞和巨噬细胞释放^8）。在脑梗死组织中也可以观察到NETs，被认为会加重脑梗死后的炎症和神经损伤。另外，在脑梗死后的血管中也可观察到NETs，在血管内释放NETs可能会促进血栓的形成，减少梗塞部位周围的脑血流量，加速神经症状的恶化。

PRX是细胞内将过氧化氢代谢成水的抗氧化蛋白。PRX在缺血后脑细胞中的表达升高，对氧化应激具有细胞保护的功能^9）。另外，在细胞内积存的PRX被缺血性坏死的细胞释放至细胞外，激活小胶质细胞和浸润脑组织的巨噬细胞的模式识别受体，从而诱导炎性细胞因子的产生。

Myd88是在Toll样受体（Toll-like receptors : TLRs）的信号下游发挥作用的衔接分子，TLRs为主要的模式识别受体，在缺乏Myd88的小鼠中几乎丧失了TLRs的功能。用缺乏Myd88的小鼠制备脑梗死模型，发现浸润大脑的免疫细胞中的炎性细胞因子明显减少^10）。众所周知，TLRs原本是通过识别细菌和病毒等病原体来源的分子来激活免疫细胞的，但它也能识别受损组织所释放的自身来源分子，引起无菌性炎症。

对于脑梗死，释放至细胞外的PRX会激活TLRs，诱导IL-1β （Interleukin-1β）、IL-23和TNF-α（Tumor necrosis factor α）等炎性细胞因子的产生。在啮齿类的脑梗死模型和脑中风患者中，研究人员认为这些炎性细胞因子会加重缺血后的炎症，引起脑水肿，并与神经损伤和预后不良相关^11）。

◆脑梗死后巨噬细胞的炎症收敛作用

小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死后的炎症中起重要作用，但炎性细胞因子的产生只在脑梗死发病的几天后达到峰值，之后就会不断减少^12）。在脑梗死发病后的几天至一周左右，巨噬细胞会促进炎症收敛作用，并为了有助于神经修复而发生功能变化^13）。这些巨噬细胞会产生抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β（Transforming growth factor β），具有神经保护作用。

在脑组织中，用腺病毒使IL-10过度表达，可以防止脑梗死后的神经细胞死亡和梗死体积扩大^14）。TGF-β是具有炎症抑制作用的控制性T细胞分化的重要因子，可以减轻脑梗死后的炎症^15）。如上所述，巨噬细胞在脑梗死中会产生炎症抑制性的因子。

从脑组织内排出DAMPs对于脑梗死后的炎症收敛非常重要。在小胶质细胞和巨噬细胞中表达的清道夫受体（MSR1或MARCO）可以识别PRX、HMGB1 等DAMPs，并将DAMPs从脑梗死组织中排出。在缺乏MSR1或MARCO的小鼠中，通过延迟DAMPs从脑梗死组织中排出，来延长炎症状态，可以发现其神经系统症状与野生型的小鼠相比更为严重^16）。

MSR1在小胶质细胞和巨噬细胞中的表达，从脑梗死发病后的第1天到第3天会升高，像这样的MSR1表达升高，巨噬细胞分化的重要转录因子Mafb起了重要作用。在MSR1表达高的巨噬细胞中，比起TNF-α、IL-1β、IL-23等炎性细胞因子，主要还是产生像IGF-1（Insulin-like growth factor1）这样的神经营养因子^16）。向脑梗死的大鼠给药苯酞衍生物，升高MSR1在浸润脑组织的巨噬细胞中的表达，促进DAMPs的排出。结果显示，TNF-α的产生减少了^17）。因此，脑梗死后DAMPs的排出是使炎症收敛的重要过程。

脑梗死发病后经过7天左右，小胶质细胞和巨噬细胞会通过炎症收敛来促进修复，帮助脑梗死后的恢复^18）。有报告称，巨噬细胞中缺乏CCR2的小鼠，脑梗死发病的几天后炎症会有所减弱，但发病5天后炎症会反弹，使神经症状加重，导致脑梗死后的恢复不佳^13，19）。

脑梗死发病7天后，从小胶质细胞和巨噬细胞中产生IGF-1、FGF-2等有大脑保护作用的营养因子^20，21）。由于这些营养因子参与髓鞘再生和突触形成，被认为对脑梗死后的恢复具有重要作用^22）。像这样，浸润脑梗死组织的巨噬细胞被认为是通过从炎症性到炎症收敛和修复性的性质变化，来帮助脑梗死后的功能恢复。

◆以小胶质细胞和巨噬细胞为治疗靶点的脑梗死后的炎症控制

在脑梗死的急性治疗中，通过静脉内注射rt-PA（Recombinant tissue plasminogen activator）进行血栓溶解和血栓清除术^23）。尚未验证免疫抑制剂类固醇、环孢菌素和他克莫司等对脑梗死患者功能预后的改善效果。因此，开发出既可以抑制脑梗死后的炎症又可以加速炎症收敛并促进修复的药物备受期待。

以IL-10 和TGF-β为治疗靶点的药物，除了难以诱导仅抗炎性细胞因子的表达外，在脑梗死中进行表达控制的合适时期还尚不明确。向脑梗死小鼠给药DHA（Docosahexaenoic acid）、IL-13和甲异靛（Meisoindigo），使小胶质细胞和巨噬细胞的性质改变为抗炎性和修复性^24-26）。给药血管生成素后，炎性细胞因子的产生减少，观察到促进血管新生和保护大脑的效果^27）。近期的报告显示，像PPARγ和STAT6 这样的转录因子可能是使脑梗死后炎症收敛的治疗靶点分子^28）。

如果可以阐明使小胶质细胞和巨噬细胞的炎症收敛和修复作用持续进行的分子机制，将有可能开发出改善包含脑梗死等各种器官损伤的预后治疗药物。另外，虽然很少有可以在脑梗死发病24 h后才开始使用的治疗药物，但开发出在发病几天后才给药也能改善脑梗死后功能预后的治疗药物的可能性很高。

◆结语

小胶质细胞和巨噬细胞具有炎性、抗炎性、炎症收敛性和修复性等多种功能，在脑梗死后的不同时期对病情的发展起着重要的作用（图2）。可促进和维持小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死中炎症收敛和修复作用的新一代治疗药物的开发，正备受期待。

图2. 小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死中的多种功能和作用

脑梗死发病后，从缺血性坏死的脑细胞中释放的DAMPs，会激活小胶质细胞和巨噬细胞，从而产生IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子。另外， MSR1表达高的小胶质细胞和巨噬细胞会从脑梗死组织中排出DAMPs，通过产生具有神经修复功能的IGF达到保护大脑的效果。

缩略语

CCL2：C-C motif chemokine 2；

CCR2：C-C chemokine receptor 2；

DAMPs：Damageassociated molecular patterns；

PRRs：Pattern recognition receptors；

HMGB1：High mobility group box1；

PRX：Peroxiredoxin；

MMP9：Matrix metalloproteinase 9；

NETs：Neutrophil extracellular traps；

TLRs：Toll-like receptors；

IL-1β：Interleukin-1β; 

TNF：Tumor necrosis factor；

TGF-β：Transforming growth factor β；

IGF-1：Insulin-like growth factor1；

rt-PA：Recombinant tissue plasminogen activator；

DHA：Docosahexaenoic acid

 

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

◆参考文献

 1. Mildner, A. et al. : Nat. Neurosci., 10, 1544 (2007).

 2. Gliem, M. et al. : Ann. Neurol., 71, 743 (2012).

 3. Huang, J. et al. : Ageing Res. Rev., 24, 3 (2015).

 4. Qiu, J. et al. : J. Cereb. Blood Flow Metab., 28, 927 ( 2008).

 5. Zhang, J. et al. : Stroke, 42, 1420 (2011).

 6. Qiu, J. et al. : Stroke, 41, 2077 (2010).

 7. Ma, Y. H. et al. : Arthritis. Res. Ther., 18, 2 (2016).

 8. Kim, S. W. et al. : Acta Neuropathol. Commun., 7, 94 (2019).

 9. Rashidian, J. et al. : J. Neurosci., 29, 12497 (2009).

10. Shichita, T. et al. : Nat. Med., 15, 946 (2009).

11. Shichita, T. et al. : Nat. Med., 18, 911 (2012).

12. Clausen, B. H. et al. : Neuroscience, 132, 879 (2005).

13. Pedragosa, J. et al. : J. Cereb. Blood Flow Metab., 40, S98 (2020).

14. Ooboshi, H. et al. : Circulation, 111, 913 (2005).

15. Cekanaviciute, E. et al. : Glia, 62, 1227 (2014).

16. Shichita, T. et al. : Nat. Med., 23, 723 (2017).

17. Zou, X. et al. : J. Neuroimmune Pharmacol., (2020). doi:10.1007/s11481-020-09911-0.

18. Wattananit, S. et al. : J. Neurosci., 36, 4182 (2016).

19. Fang, W. et al. : Theranostics, 8, 3530 (2018).

20. Ikeda, N. et al. : Stroke, 36, 2725 (2005).

21. Zhu, W. et al. : Stroke, 39, 1254 (2008).

22. Leker, R. R. et al. : Stroke, 38, 153 (2007).

23. Hankey, G. J. : Lancet, 389, 641 (2017).

24. Ye, Y. et al. : Front. Cell. Neurosci., 13, 553 (2019).

25. Cai, W. et al. : Transl. Stroke Res., 9, 669 (2018).

26. Kolosowska, N. et al. : Neurotherapeutics, 16, 1304 (2019).

27. Venkat, P. et al. : CNS Neurosci. Ther., 27, 48 (2020).

28. Zhang, W. et al. : CNS Neurosci . Ther., 25, 1329 (2019).

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◆小胶质细胞研究用Iba1抗体系列

产品编号	产品名称	来源	交叉反应	应用	规格
016-20001	Anti Iba1,Rabbit (for Western Blotting)	兔	小鼠，大鼠，人	WB	50 μg
019-19741	Anti Iba1, Rabbit   (for Immunocytochemistry)	兔	小鼠，大鼠，人	ICH(F)	50 μg
013-27691	Anti Iba1, Rabbit(for Paraffin Section)	兔	小鼠，大鼠	ICH(P)	50 μg
012-26723	Anti Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP24)	小鼠	小鼠（仅DAB）， 大鼠，狨猴	ICH(F)	10 μL
016-26721	Anti Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP24)	小鼠	小鼠（仅DAB）， 大鼠，狨猴	ICH(F)	50 μL
013-27593	Anti Human Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP27)	小鼠	人	ICH(P)	50 μL
017-27591	Anti Human Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP27)	小鼠	人	ICH(P)	10 μL
011-27991	Anti Iba1, Goat	山羊	小鼠，大鼠	ICH(F)	100 μL
016-26461	Anti Iba1, Rabbit, Biotin-conjugated	兔	小鼠，大鼠	ICH(F)	100 μL
013-26471	Anti Iba1, Rabbit, Red Fluorochrome(635)-conjugated	兔	小鼠，大鼠	ICH(F)	100 μL
015-28011	Anti Iba1, Rabbit, SPICA Dye™ 568-conjugated	兔	小鼠，大鼠	ICH(F)	100 μL

◆神经炎症相关抗体

产品编号	产品名称	来源	交叉反应	应用	规格
AG-20B-0042	anti-Caspase-1(p20) (mouse), mAb (Casper-1)	小鼠	小鼠	WB(1 μg/mL), IHC(PS), IP	100 μg
AG-20B-0048	anti-Caspase-1 (p20) (human), mAb (Bally-1)	小鼠	人	WB（1 μg/mL）	100 μg
AG-20B-0014-C100	anti-NLRP3/NALP3, mAb (Cryo-2)	小鼠	人，小鼠	ICC，IHC，IP，WB（1 μg/mL）	100 μg
AG-25B-0006	anti-Asc, pAb (AL177)	兔	人，小鼠	ICC (1:200),   IHC(P)(1:500),  IP (1:200),  WB (1:1000), Functional Application	100 μg
AG-20B-0044	anti-Caspase-1 (p10) (mouse), mAb (Casper-2)	小鼠	小鼠	WB (1 μg/mL)	100 μg
AG-20B-0060	anti-Caspase-4/11 (p20), mAb (Flamy-1)	小鼠	人，小鼠	WB (1 μg/mL), IP	100 μg
AG-20B-0064	anti-IL-1alpha (p18) (mouse), mAb (Teo-1)	小鼠	小鼠	WB (1 μg/mL)，ELISA	100 μg
AG-20T-0137	anti-Caspase-8 (mouse), mAb (1G12)	大鼠	小鼠	ELISA, FC,  IHC, WB	100 μg
AG-20B-0057	anti-Caspase-8 (human), mAb (C15)	小鼠	人	WB (1 μg/mL), IP,IHC	50 μg  100 μg
AG-25B-0036	anti-Gasdermin D (mouse), pAb (IN110)	豚鼠	小鼠	WB: (1:2000) ELISA: (1:2000)	100 μg

※以上所有产品仅供实验研究用，不可用于人体，不可用作医药品、食品、临床诊断等。

第5回 使用人血预测大脑内小胶质细胞的活动性进行心理逆转录研究

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

九州大学大学院 医学研究院 精神病医学 加藤隆弘

◆前言

近年有研究提出，在神经退行性疾病以及各种神经精神疾病中，免疫细胞小胶质细胞的参与对脑内炎症起着重要的作用，然而目前的发现还只是冰山一角。过去以小胶质细胞为目标的临床研究，其重点集中在死后的大脑研究和正电子发射型计算机断层显像（PET）研究。在这些研究中，主要报告了精神分裂症、抑郁症、自闭症谱系障碍和自杀患者大脑内小胶质细胞的过度活化。虽然利用PET技术可以对活体患者大脑内的部分小胶质细胞的活化进行测量，但实际上小胶质细胞活化的形式多样，而目前的PET技术能够检测到的活化种类只有TSPO这类占少数的活化形式。此外，关于分辨率也存在问题，仅使用PET，尤其是在分子水平上，评估动态且多样的小胶质细胞活化是非常困难的。特别是在新药开发方面，阐明分子基础是研究的关键，其局限性不容忽视。

理想的情况应当是采集并分析患者大脑中的小胶质细胞，但在伦理和技术层面上的难度太高。因此，分析从啮齿类等模型动物的大脑中采集的新鲜小胶质细胞，对于阐明小胶质细胞的病理而言必不可少，笔者的实验室也正在推进以小胶质细胞为重点的小鼠模型实验^1）。然而，想要制备能够满足所有精神疾病表现型的模型动物是不可能的。为了打破这些局限，我们将在本文中介绍正在推进以人为对象，使用易于采集的血液进行精神疾病的逆转录研究内容。

 

◆人血来源iMG细胞的开发及应用

2016年以来，关于人iPS细胞来源小胶质样细胞开发的案例屡见报道，对于阐明小胶质细胞在各种脑疾病中的病理机制的期待也越来越高^2,3）。尤其是在对遗传影响大的疾病中，分析iPS细胞来源小胶质样细胞十分有用，但在精神疾病中，相比遗传因子，更多的是环境因子造成的疾病，所以分析能够反映状况的疾病模型细胞显得非常重要。而笔者的实验室也一直在研发一种不使用重编程的iPS细胞，直接从体细胞中诱导小胶质样细胞的技术。

2014 年，通过向人外周血单核细胞添加GM-CSF和IL-34两种细胞因子，成功制备出只需两周即可完成的直接诱导小胶质（iMG）细胞（图 1）^4）。

图1. 人血液来源直接诱导小胶质样（iMG）细胞的特征（转载改编自文献4和5）

与iPS细胞不同，iMG细胞无需一切基因重组的操作，只需通过化学诱导即可在短时间内制备获得，并能以相对较低的成本制备出大量的样品。此外，iMG细胞可以检测吞噬作用和细胞因子生成能力等动态功能，并且可以分析活细胞的各种分子水平，有望弥补死后大脑研究和PET研究的不足^4,5）。

在2014 年开发时，发现iMG细胞具有人脑小胶质细胞的许多特性，并显示与单核细胞和巨噬细胞不同的表现型^4）。美国马萨诸塞州综合医院（MGH）的研究小组根据笔者团队的建议，通过微阵列分析发现所制备的iMG细胞与人脑小胶质细胞最为相似^6）。笔者团队通过和九州大学脑外科合作，使用RNAseq进行全面的基因表达分析，发现了外周血来源的iMG细胞与同一患者相同时期的大脑小胶质细胞类似（Tanaka, S. et al. : Frot. Immunol., in press）。

人iMG细胞已经应用于神经精神疾病和疼痛性疾病的病理阐明研究和生物标记开发研究。笔者团队首先着眼于代表性的原发性小胶质细胞疾病Nasu-Hakola病（NHD）。从一名30多岁时出现精神症状、40多岁时痴呆症状恶化并处于长期卧床状态的女性患者中制备的iMG细胞中发现，对于吞噬刺激，TNF-α和IL-6等炎症细胞因子的生成的应答具有延迟倾向，同时还发现了IL-10等保护性细胞因子的生成往往从早期阶段开始就被抑制^4）。这些患者来源iMG细胞的反应，表明了由小胶质细胞引起的慢性脑内炎症参与了Nasu-Hakola病等多种精神症状的出现和青年性痴呆的发病^4）。

接着，当笔者在进行临床相关的双相情感障碍I型和快速循环型（Rapid cycler）患者的iMG细胞分析时，发现1名男性患者在躁狂状态下显示的mRNA分析为M1型显性；与佐贺大学精神科合作，并尝试对3名患者进行分析时，发现作为M2型代表性标记的甘露糖受体CD206，其mRNA表达处于“抑郁状态”时，同时表现亢进^7）。这些结果表明，小胶质细胞免疫应答的变化可能在双相情感障碍的“躁狂”和“抑郁”的转变过程中起重要作用^7）。

此外，我们还与九州大学心理科合作，使用不单是精神疾病患者，更针对身体疾病患者的iMG细胞进行了逆转录研究^5），在女性纤维肌痛患者的iMG细胞中，发现了TNF-α mRNA的高表达，我们提出其可能会成为疼痛性疾病的客观性生物标记^8）。在与九州大学脑外科合作时，我们还发现iMG细胞CD206的表达模式可能是可以预测脑肿瘤（神经胶质瘤）进展的标记（Tanaka, S. et al. : Front. Immunol., in press）。

iMG细胞已经在国外的研究机构中得到灵活应用。上述的MGH团队通过对精神分裂症患者血液来源的iMG细胞和同一患者iPS细胞来源的神经元进行共培养实验，发现在精神分裂症患者中，活化的小胶质细胞对补体介导的神经突触损伤非常重要，据报道称，通过使用对小胶质细胞活化具有抑制作用的抗菌剂米诺环素，可以挽救神经突触损伤^9）。美国和荷兰等国际合作研究团队也开始使用精神分裂症患者来源的iMG细胞进行研究，据报道称，患者来源的iMG细胞对LPS反应更为灵敏，可产生更多的TNF-α^10）。

 

◆人血代谢组学分析

在笔者的实验室中，不仅研究血细胞成分，还从血浆和血清中寻找线索，以了解大脑中小胶质细胞的动态。例如，在使用血浆进行神经来源外泌体相关的分析中，发现小胶质细胞活性所必需的细胞因子IL-34可能与抑郁症的病理相关^11）。另外，在与九州大学检查部合作期间，从呈现抑郁的患者中采集外周血进行代谢组学分析时，发现了部分与抑郁症严重程度相关的血液代谢物，并且还发现了自杀意愿的强烈程度与小胶质细胞活化密切相关的色氨酸-犬尿氨酸代谢途径中的多种代谢物相关^12,13）。

这些结果支撑了死后大脑研究中自杀患者大脑内小胶质细胞活化的报告内容。假设的控制和掌握小胶质细胞的活化有助于应对自杀这一紧迫的社会问题，我们目前正在结合各种方法来推进双方向性研究^14）（图2）。

图2. 阐明精神疾病的病理和开发生物标记的多轴方法

（例：自杀相关行为的对策），参考文献14的引用·改编

◆结语

小胶质细胞的过度活化和活化控制不足可能与抑郁、不安、妄想以及产生自杀念头等精神症状或精神病理相关。今后，我们将继续以各种精神疾病为对象获取临床数据，进行人体血液分析（iMG细胞分析和代谢组学分析）以及推进结合人脑分析的逆转录研究，通过阐明分子细胞水平上小胶质细胞介导的精神病理学机制，有望开发出以小胶质细胞为靶向的新型治疗药。通过采血制备iMG细胞的分析和代谢组学分析，有望用作能够反映不止在精神疾病上，更能对在各种疾病中大脑小胶质细胞动态的客观性生物标记。

 

本系列在九州大学大学院药学研究院 药理学领域 津田 诚 老师的协助下策划并撰写。

◆参考文献

 1. Ohgidani, M. et al. : Brain Behav. Immun., 55, 17-24 （2016）.

 2. Muffat, J. et al. : Nat. Med., 22, 1358-1367 （2016）.

 3. Pocock, J. M. and Piers, T. M. : Nat. Rev. Neurosci., 19, 445-452 （2018）.

 4. Ohgidani, M. et al. : Sci. Rep. , 4, 4957 （2014）.

 5. Ohgidani, M. et al. : Front. Cell. Neurosci., 9, 184 （2015）.

 6. Sellgren, C. M. et al. : Mol. Psychiatry., 22, 170-177 （2017）.

 7. Ohgidani, M. et al. : Front. Immunol., 7, 676 （2017）.

 8. Ohgidani, M. et al . ; Sci. Rep. , 7, 11882 （2017）.

 9. Sellgren, C. M. et al. : Nat. Neurosci., 22, 374-385 （2019）.

10. Ormel, P. R. et al. : Brain Behav. Immun., 90, 196-207 （2020）.

11. Kuwano, N. et al. : J. Aff ect. Disord., 240, 88- 98 （2018）.

12. Kuwano, N. et al. : J. Aff ect. Disord., 231, 74- 82 （2018）.

13. Setoyama, D. et al. : PLoS One, 11, e0165267 （2016）.

14. Suzuki, H. et al. : Front. Cell. Neurosci., 13, 31 （2019）.

◆小胶质细胞研究用Iba1抗体系列

产品编号	产品名称	来源	交叉反应	应用	规格
016-20001	Anti Iba1,Rabbit (for Western Blotting)	兔	小鼠，大鼠，人	WB	50   μg
019-19741	Anti Iba1, Rabbit (for Immunocytochemistry)	兔	小鼠，大鼠，人	ICH(F)	50   μg
013-27691	Anti Iba1, Rabbit(for Paraffin Section)	兔	小鼠，大鼠	ICH(P)	50   μg
012-26723	Anti Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP24)	小鼠	小鼠（仅DAB），大鼠，狨猴	ICH(F)	10   μL
016-26721	Anti Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP24)	小鼠	小鼠（仅DAB），大鼠，狨猴	ICH(F)	50   μL
013-27593	Anti Human Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP27)	小鼠	人	ICH(P)	50   μL
017-27591	Anti Human Iba1, Monoclonal Antibody(NCNP27)	小鼠	人	ICH(P)	10   μL
011-27991	Anti Iba1, Goat	山羊	小鼠，大鼠	ICH(F)	100   μL
016-26461	Anti Iba1, Rabbit, Biotin-conjugated	兔	小鼠，大鼠	ICH(F)	100   μL
013-26471	Anti Iba1, Rabbit, Red Fluorochrome(635)-conjugated	兔	小鼠，大鼠	ICH(F)	100   μL
015-28011	Anti   Iba1, Rabbit, SPICA Dye™ 568-conjugated	兔	小鼠，大鼠	ICH(F)	100   μL

※以上所有产品仅供实验研究用，不可用于人体，不可用作医药品、食品、临床诊断等。

第2回 小胶质细胞的发育起源及脑疾病

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

京都药科大学综合药科学院

高田 和幸

◆前言

小胶质细胞是位于中枢（脑/脊髓）的组织巨噬细胞，在中枢系统位居免疫第一线。随着发育方式和生态特殊性的不断阐明，小胶质细胞备受各个学科领域的研究人员的关注，对小胶质细胞生物学的学术研究日益活跃。本文着眼于小胶质细胞的发育起源及其生态，并介绍其与脑疾病的相关性以及作为治疗靶点的地位。

 

◆小胶质细胞的发育

1919年，西班牙神经科学家Pío del Río Hortega生动地描述了仅次于神经细胞和星形胶质细胞的第三位大脑组成细胞群的形态学特征，并将该细胞群命名为小胶质细胞。Hortega还涉及到了小胶质细胞的发育起源，指出前体细胞是在大脑发育初期从大脑外部移入的。长期以来，其前体细胞被认为是外周血中的单核细胞，但十年前小鼠实验中利用胚外组织卵黄囊造血，发现产生的是“原始巨噬细胞”¹⁾。该原始巨噬细胞是从被称为erythro-myeloid progenitor（EMPs）的细胞，不依赖于转录因子Myb²⁾ ，不经过单核细胞生成的，遍及包括大脑在内的全身各个器官，暂时性形成组织巨噬细胞（图）。之后，EMPs转移至胎肝，继承了造血的场所后，此时在EMPs中产生Myb依赖性单核细胞（fetalliver monocytes）。这些单核细胞遍及全身，将先前已植入的原始巨噬细胞取代或与之共存，作为新的组织巨噬细胞形成种群^3）。此时，大脑中已经形成发育阶段的血脑屏障，几乎不会被入侵。也就是说，在全身器官中存在常在性组织巨噬细胞时，只有小胶质细胞把在卵黄囊中产生的原始巨噬细胞作为主要的发育起源。

 

◆根据细胞起源赋予小胶质细胞的特点

由于EMPs延缓造血，在胚胎期的主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-me-sonephros : AGM）区域中形成造血干细胞（hematopoietic stem cells HSC）（图）。HSCs也在小鼠胎肝中开始胎儿期的二次造血，但在出生前不久会转移至骨髓，全面担任出生后的二次造血。HSCs来源的单核细胞也被认为是组织巨噬细胞的来源之一，但在生理条件下，它对小胶质细胞种群几乎没有任何贡献^1,4）。另外，HSCs来源单核细胞随血液循环全身，响应感染和受损信号并转移至组织，分化成巨噬细胞。这些HSCs单核细胞来源的巨噬细胞生命短暂，并且会在组织中暂时性停留引起炎症反应，而EMPs来源的组织常在性巨噬细胞主要作用于营养和组织重塑。此外，HSCs来源巨噬细胞高表达趋化因子受体CCR2，EMPs来源巨噬细胞高表达F4 / 80、colony-stimulating factor-1 receptor（CSF-1R）和分形碱受体CX3CR1，不同的基因表达模式中都深刻地残留了细胞起源⁴⁾，估计与功能角色划分相关。CSF-1R介导的信号诱导microRNA-21，抑制炎症因子的表达并促进营养因子的表达^5）；这在以小胶质细胞为代表的EMPs来源组织巨噬细胞的细胞起源伴随的功能特征的说明上来说也让人十分感兴趣。最近有研究推测，存在于与脑实质成为边界的血管周围间隙、硬脑膜和脉络丛中的巨噬细胞（border-associated macrophages : BAMs）和实质小胶质细胞，不仅与卵黄囊EMPs的细胞起源相同，而且在卵黄囊存在的时刻就已经决定了各自的命运^6），并且还明确了BAMs与小胶质细胞的基因表达模式的区别⁷⁾。如此一来，小胶质细胞这一组织巨噬细胞在特点上，就不仅可以从植入目的地中的大脑和脊髓这样的环境中接收信号，还可以很大程度地反映从其独特的发育起源受到的影响。所以想要更深入并且更准确地理解小胶质细胞的生态和功能的话，就必须充分考虑其发育起源。

 

◆维持小胶质细胞种群

如上所述，小胶质前体细胞仅在胎儿期产生，出生后由骨髓HSCs来源单核细胞几乎很少参与小胶质细胞的补充。关于维持该小胶质细胞出生后的种群数，近年的报告显示，在小鼠大脑中的所有小胶质细胞以约96天为周期发生周期性交换，重复细胞死亡（凋亡）和分裂的过程，来稳定脑内的细胞数量⁸⁾。这种利用自我分裂来维持种群的模式，以表观遗传修饰的形式，分裂后的细胞也传达发育起源。此外，不时还会继承植入后在中枢内时刻发生变化的微环境的信息，估计与时空依赖性的小胶质细胞亚群和脑疾病中特异性亚群的出现密切相关^9,10)。

 

◆小胶质细胞与脑疾病

21号染色体三体引发的Down syndrome（DS），在胎儿期神经发生减少的原因至今尚未阐明。在与京都药科大学的石原庆一博士等人的共同研究中，分析DS模型小鼠时发现，在胎儿期的大脑中，包含小胶质细胞在内的脑组织巨噬细胞的比例减少，中性粒细胞以及单核细胞等炎症细胞的比例增加，由此看出大脑皮层中神经新生降低^11）（图）。 结果表明，包含小胶质细胞在内，在胎儿期的大脑免疫环境的破绽与DS的病发密切相关，其正常化将是DS胎内治疗法中新的治疗目标。

另一方面，Alzheimer’s disease（AD）的最大风险因素就是年龄衰老，发病前几十年间在大脑中积蓄的淀粉样蛋白-β(Aβ)被当做是病态形成的诱因。而且很久以前我们就知道小胶质细胞会在Aβ聚集部位（老年斑）积蓄。考虑到小胶质细胞通过自我分裂来维持种群的机构，或许年龄衰老、Aβ长时间暴露等积累的小胶质细胞性质的变化，正是连接从Aβ到AD发病的主要途径。我们从小鼠骨髓和外周血中收集HSCs，在CSF-1的刺激下制备巨噬细胞，将其移植至可呈现脑内Aβ积蓄的AD小鼠模型的海马体中，发现小鼠的认知功能障碍得到了改善^13,14)（图）。最初认为是只有移植的巨噬细胞的Aβ吞噬带来了治疗效果的作用机制，但结果发现，是该移植细胞分泌的transforming growth factor-β1（TGF-β1）引起的小胶质细胞的功能变化也与治疗相关¹⁵⁾。有报告称TGF-β信号在发育初期阶段中，从原始巨噬细胞转变为小胶质细胞的命运是必须的⁶⁾。另一方面还有报告称，去除包含小胶质细胞在内的老化胶质细胞与改善认知功能相关¹⁶⁾。由于Aβ长期暴露和年龄衰老的累积，导致小胶质细胞的性质改变降低认知功能，小胶质细胞发育初期所须的TGF-β信号会抵消部分变化，这或许与改善认知功能相关。

 

◆结语

在小胶质细胞通过重复自我分裂来维持种群的机构中，遗传其发育起源和植入后的微环境信息以表观遗传修饰的形式继承，从而获得小胶质细胞时空依赖性的特点。我们在与Agency for Science, Technology and Research（A*STAR）的 Florent Ginhoux博士的共同研究中，已成功从多能诱导干细胞（iPS）细胞中制备可反映胎儿早期造血的原始巨噬细胞（iMacs）¹⁷⁾（图）。像这样使用原始细胞再现发育起源的分析，有望引导我们进一步正确的理解小胶质细胞的生态。为研究大脑从发育到衰老各阶段引起的脑疾病发病机制，为了获取开发治疗发的线索，有必要正确地了解小胶质细胞发育、成熟和衰老等阶段。将巨噬细胞移植至AD模型小鼠的研究是与札幌医科大学的下滨俊教授、京都药科大学的芦原英司教授、立命馆大学的北村佳久教授的共同研究。

图. 包含小胶质细胞在内的组织巨噬细胞的发育与脑疾病的关联

在小鼠卵囊中，EMPs不经过转录因子Myb非依赖性单核细胞生成原始Mφ，并作为包含小胶质细胞的Mφ组织植入至各组织中。小胶质细胞和去往BAMs的方向在此时确定，小胶质细胞的分化需要TGF-β信号。其他原始Mφ的方向尚未明确。之后，向胎肝移动的EMPs生成胎肝单核细胞，一边替换原始φ或与原始φ共存，一边形成新组织Mφ，但由于中枢中存在血脑屏障而未被替换。随后，在AGM区域产生的HSCs来源单核细胞，在生理条件下也不会变成小胶质细胞，而是响应感染/受损信号，从血液中转移至组织成为Mφ。小胶质细胞的发育起源是卵黄囊的原始Mφ，之后通过细胞死亡和自我分裂维持种群。在DS模型小鼠胎儿期的大脑内，小胶质细胞和BAMs的比例减少，炎症细胞的比例增加，神经发育降低¹¹⁾。将通过CSF-1刺激的HSCs制备的Mφ移植至AD模型小鼠中后，移植细胞不仅会吞噬Aβ，还会分泌TGF-β1促进内源性小胶质细胞的Aβ吞噬，从而改善认知功能障碍^13-15)。

左图： 再现iPS细胞来源Mφ(iMacs)是原始Mφ的发育过程，可分化诱导小胶质细胞，显示Aβ吞噬功能。（Scale bars:20 μm）

右图：成年小鼠海马体的小胶质细胞（经过Goat抗Iba1抗体染色）。（Scale bars:20 μm）

Aβ: amyloid- β , AD: Alzheimer’s disease,

AGM: aorta-gonad-mesonephros,

BAMs: border-associates macrophages,

CSF-1: colony-stimulating factor -1,

DS: Down syndrome,

EMPs: erythro-myelord progenitors,

HSCs: hematopoietic stem cells,

Mφ: macrophages ,

TGF-β: transforming growth factor-β。

 

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◆参考文献

  1） Ginhoux, F. et al. : Science, 330, 841（2010）.

  2） Schulz, C. et al. : Science, 336, 86（2012）.

  3） Hoeffel, G. et al. : Immunity, 42, 665（2015）.

  4） Hagemeyer, N. et al. : EMBO J., 35, 1730（2016）.

  5） Caescu, C. I. et al. : Blood, 125, e1（2015）.

  6） Utz, S. G. et al. : Cell, 181, 557（2020）.

  7） Mrdjen, D. et al. : Immunity, 48, 380（2018）.

  8） Askew, K. et al. : Cell Rep., 18, 391（2017）.

  9） Masuda, T. et al. : Nature, 566, 388（2019）.

10） Keren-Shaul, H. et al. : Cell, 169, 1276（2017）.

11） Ishihara, K. et al. : Brain Pathol., 30, 75（2020）.

12） Baik, S. H. et al. : Cell Metab., 30, 493（2019）.

13） Kawanishi, S. et al. : J. Alzheimers Dis., 64, 563（2018）.

14） Kuroda, E. et al. : J. Alzheimers Dis., 73, 413（2020）.

15） Kuroda, E. et al. : Neuroscience, 438, 217（2020）.

16） Tyler, B. et al. : Nature, 502, 578（2018）.

17） Takata, K. et al. : Immunity, 47, 183（2017）.

第六回 小胶质细胞-星形胶质细胞相互关联控制脑卒中

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

山梨大学大学院　综合研究部　医学域　药理学讲座　小泉修一

◆前言

如今，胶质细胞在大脑功能中发挥的作用被不断地阐明。尤其是在各种大脑疾病中，胶质细胞的变化迅速、大且多样，因此研究人员认为这些胶质细胞的变化在大脑的异常和修复过程中可能发挥了重要的作用。这些假设逐渐被认可的同时，仍残留了许多课题。例如，胶质细胞研究在体外和体内实验的研究结果差异大，目前在体外实验获得的研究结果无法直接运用至体内实验研究。

此外，至今为止的大部分研究，都将各类胶质细胞分为小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等分别进行研究，忽略了大脑功能受异源胶质细胞间交流结果的控制。当然，胶质细胞研究的历史和经验尚浅，先阐明各类胶质细胞的性质十分重要，而近期的研究以各类形式提出，胶质细胞可能作为集结者，通过异源胶质细胞间的协作控制大脑功能。

本文着眼于体内脑卒中模型中小胶质细胞-星形胶质细胞的关联，阐述其交流在控制大脑功能时发挥作用的重要性。

◆小胶质细胞-星形胶质细胞的关联

小胶质细胞对大脑内外环境的变化非常敏感，能够感知细微的变化，并先于大脑做出变化。例如，小胶质细胞在中年期就已活化并开始衰老^1），而在肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病中，它们在发病前就已活化并与疾病的发病机制和难以治疗相关^2）。虽然活化的小胶质细胞可以直接控制神经细胞的功能，但通过作用于星形胶质细胞能影响大脑功能。在外伤性脑损伤模型中，小胶质细胞首先感知到损伤并传达给星形胶质细胞，从而发挥保护作用^3），另外感知到炎症的小胶质细胞通过传达信息给星形胶质细胞来控制神经细胞的功能^4）。

若先经历过非侵袭性缺血应激，在后来的侵袭性缺血时便可获得抗性，这种现象称为“缺血耐受性”，在实验和临床上比较常见（图A，B）。在短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型小鼠中，首先发生强烈变化的细胞是小胶质细胞，其次是星形胶质细胞^5）。即使是不会造成显著伤害的非侵袭性MCAO（预处理，PC），灵敏的小胶质细胞仍会活化。

另外，非侵袭性MCAO以外的PC也能够诱导缺血耐受性，出现交叉缺血耐受性现象，但诱导交叉缺血耐受性的典型代表PC是革兰氏阴性细菌细胞壁成分的lipopolysaccharide（LPS，脂多糖）。LPS在中枢对小胶质细胞Toll样受体4的作用特别强，表明小胶质细胞对于缺血耐受性诱导来说至关重要。

这些小胶质细胞性缺血耐受性的诱导机制与Ⅰ型干扰素介导的通路密切相关，其他小胶质细胞依赖性神经胶质递质、细胞因子、神经营养因子等也非常重要。因此，小胶质细胞不仅能够直接作用于神经细胞，还通过作用于星形胶质细胞等其他类型的胶质细胞，间接诱导缺血耐受性的机制，近年有人提出了后者的重要性。

图. 通过胶质细胞交流获得缺血耐受性的机制

A. 侵袭性脑缺血导致的神经细胞严重损伤或死亡。

B. 经历非侵袭性缺血（PC）后，诱导其在侵袭性缺血时获得抗性的缺血耐受性。

C. PC类的轻度刺激由小胶质细胞先感知。小胶质细胞转化为活性小胶质细胞，直接参与缺血耐受性诱导，同时诱导星形胶质细胞活化（反应性星形胶质细胞）。反应性星形胶质细胞通过多种机制促进缺血耐受性的形成，特别是通过P2X7受体表达和P2X7受体依赖性HIF1α表达介导的神经保护机制，缺血耐受性持久且强效。

◆从小胶质细胞到星形胶质细胞的信号传递

感知到PC后的小胶质细胞如何把信号传达给星形胶质细胞呢？一般有多种DAMP，而ATP作为最初的信号尤为重要。ATP/P2受体信号的显著变化是脑卒中初期及LPS负荷小胶质细胞最初的应答变化。

感知到LPS后的小胶质细胞通过表达囊泡核苷酸转运蛋白（Vesicular nucleotide transporter），增强ATP的胞吐作用^6）。感知到脑卒中后的小胶质细胞会表达一般情况下不表达的P2Y1受体，并结合ATP，使小胶质细胞自身的功能发生巨大变化^7）。尤其是ATP，即使在脑卒中以外，在受到高度的兴奋性刺激时^4）,在外伤性脑损伤^3）等的初期应答中，作为从小胶质细胞到星形胶质细胞的信号起着核心作用。小胶质细胞自身也有保护大脑的作用^7），第一时间感知到更敏感的小胶质细胞信息，并将该信息传达给大脑保护功能更强大的星形胶质细胞，通过这种级联反应，发挥作为各脑部疾病安全装置的作用。

◆作为缺血耐受性执行细胞的星形胶质细胞

PC可使星形胶质细胞活化（反应性星形胶质细胞）。抑制该功能就会使缺血耐受性消失，因此可以说反应性星形胶质细胞是诱导缺血耐受性的必要条件。反应性星形胶质细胞是缺血耐受性诱导的执行细胞，其自身直接或通过与神经细胞和其他细胞的交流间接地在缺血耐受性诱导中发挥核心作用。

例如，反应性星形胶质细胞具有产生神经保护分子、增强兴奋性神经递质和去除有毒物质的功能、调节能量代谢等多种作用，特别是通过P2X7受体介导的作用更强^5，8，9）。通过PC，反应性星形胶质细胞通过星形胶质细胞特异性大量（100倍以上）且长期（8周以上）地使P2X7受体的表达增强，并以受体依赖性诱导缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor1α，HIF1α），发挥强烈的缺血抵抗性（图C）。

包括这种星形胶质细胞特异性的P2X7受体表达增强机制在内，缺血耐受性型星形胶质细胞的诱导机制还有很多尚不明确的地方。如上所述，由于小胶质细胞在PC诱导反应性星形胶质细胞之前活化，因此认为是小胶质细胞诱导了缺血耐受性型星形胶质细胞。然而这种推测是否正确，有关小胶质细胞诱导的星形胶质细胞表型多样性等相关问题，仍有许多不明之处，有待今后进一步研究。

此外，小胶质细胞如何感知非侵袭性的温和PC？又会产生怎样的表现型？小胶质细胞向星形胶质细胞和神经细胞传达的信号分别又是什么？等等一系列的问题尚待解决。但是，小胶质细胞-星形胶质细胞如同继电器一样传达大脑环境内的变化，并以此改变其在大脑中的应答性机制，被认为是各种脑部疾病发病前的常见现象。揭示了这是一种溢出效应较大的现象，期待未来的研究进展。

◆结语

本文以缺血耐受性为例，表明了小胶质细胞在控制神经胶质细胞脑功能方面的重要性。虽然小胶质细胞和星形胶质细胞均具有诱导缺血耐受性的潜力，但事实上小胶质细胞-星形胶质细胞关联的相互作用很可能发挥更重要的作用。随着各类胶质细胞的研究日渐活跃，预计未来异源细胞间相互作用控制神经细胞的观点也会越来越重要。

◆参考文献

1）Zhang, G. et al. : Nature, 497, 211 (2013). DOI: 10.1038/nature12143

2）Sanagi, T. et al. : J. Neurosci. Res., 88, 2736 (2010). DOI: 10.1002/jnr.22424

3）Shinozaki, Y. et al. : Cell Rep., 19, 1151 (2017). DOI: 10.1016/j.celrep.2017.04.047

4）Pascual, O. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E197 (2012). DOI: 10.1073/pnas.1111098109

5）Hirayama, Y. et al. : J. Neurosci., 35, 3794 (2015). DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4218-14.2015

6）Imura, Y. et al. : Glia, 61, 1320 (2013). DOI: 10.1002/glia.22517

7）Fukumoto, Y. et al. : J. Cereb. Blood Flow Metab., 39, 2144 (2019). doi: 10.1177/0271678X18805317

8）Hirayama, Y. and Koizumi, S. : Glia, 65, 523 (2017). DOI: 10.1002/glia.23109

9）Hirayama, Y. and Koizumi, S. : Neurosci. Res., 126, 53 (2018). DOI: 10.1016/j.neures.2017.11.013

““小胶质细胞研究的前沿—从基础到临床—”系列：结语 九州大学大学院　药学研究院　药理学领域　津田诚     从和光纯药时报2020年第3期开始连载的“小胶质细胞研究的前沿-从基础到临床-”系列共6篇，最终以综述“小胶质细胞-星形胶质细胞连     锁调控脑卒中”作为完结篇。本系列对阿尔茨海默病、癫痫、脑梗塞、精神疾病、慢性疼痛等小胶质细胞发挥重要作用的疾病进行了探讨，     以简明易 懂的方式介绍了其近期的新发现和前景，并毫无保留地讲述了小胶质细胞的魅力。衷心感谢引领世界小胶质细胞研究的各位老师     们，在百忙之中为本系列文章执笔，同时由衷期待有朝一日能够阐明目前小胶质细胞研究结果尚无法克服的神经疾病的发病机制，并实现诊     断和治疗方法的开发。

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