小鼠生殖工程学技术——5冻存运输小鼠２细胞期胚胎

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◆材料

1.     2细胞期胚胎（新鲜或冻融复苏后的胚胎）

2.     培养皿（coring　35mm X 10mm　Cat.No.430588）

3.     电动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-200）

4.     M２ Medium (Sigma Cat.No.M7167)

5.     0.5 mL EP管（Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5 mL, Fisher Scientific Cat.No. FS-MCT-060-C）

6.     微管

7.     KSOM/AA

8.     流动石蜡（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）

9.     纽扣式温度记录仪（KN Laboratories temperature data logger Samokuron G type）

10.  CARD 冷藏运输试剂盒

o    纸盒（free-s1 Cat.No. 11-1585）

o    棉布

o    保温瓶（Thermos Co., Ltd.　Cat.No.JMK-501）

o    冰袋（小）（Kyoritsu Co., Ltd.　冰袋雾凇　Cat.No. H-120）

o    冰袋（大）（shiro产业　冰袋R 500g 140 mm×250 mm、Cat.No. M250R-50）

o    泡沫箱（KARUX　KC-3）

 

◆步骤

　

2細胞期胚胎的冻存

１.　用移液器（P-200）在培养皿上制作两个１００μL M２的滴液（不要被流动石蜡覆盖）。
２.　把冻存的胚胎从被流动石蜡覆盖着的培养液里移至到一个M2滴液里。

３.　更换新的微管，将胚胎从一个M2滴液移至另一个M2滴液里。

      ＊把从被流动石蜡覆盖的培养液滴液移至制作好的M2滴液里的胚胎移至到另一个M2的滴液时，尽量避开附着流动石蜡的滴液位置。

４.　往０.５mL EP管内加入０.６mL的M２。 
    

    ＊如果EP管顶部留有气泡时，需轻拍出气泡。

５.　从3个滴液里取出胚胎后放置在装满０.６mL的M２０.５mL EP管底部（一只EP管能放40个2细胞期胚胎）。

＊ 移动胚胎后，在3个滴液里移液，确认微管里是否残留胚胎。

６.　合上EP管盖子，并用封口膜包封。
７.　在纸盒里装入EP管、纽扣式温度记录仪和棉布后，盖上盒盖紙箱。
　　 M２、紙盒、EP管、纽扣式温度记录仪和棉布全在室温（20～25°C）下使用。

８.　纸盒保存在冷冻柜里（最长可保存72小时）。 

2細胞期胚胎的冷藏运输

与上述冻存步骤一样，把EP管放进纸盒（2细胞期胚胎的冻存1~7步）后，按以下操作包装纸盒。

样品是常温的情况只需用保温瓶和小冰袋，4~8°C冻存的样品，则需要使用泡沫箱及大冰袋，包装时动作要迅速。

１.　把纸盒放进保温瓶内。

２.　再放进两个小冰袋至保温瓶内。 

３.　紧紧盖上保温瓶盖。

４.　确认瓶盖盖紧后，在泡沫箱内铺上大冰袋，然后放入保温瓶（这时，请注意请勿倒放保温瓶里装有胚胎的EP管）。 接着，保温瓶两侧也放上大冰袋。最后用包装带固牢泡沫箱盖。 

５.　用快递运送，整个泡沫箱保存在（４～８°C）冷冻柜里。

６.　用快递冻存运输最长保存时间可达72小时。
    

  ＊冬季的室外气温会低至０°C以下，如果运输过程中泡沫箱长时间放置在室外，2细胞期胚胎就会死亡。寄方应首先联系附近的快递配送站，跟他们强调泡沫箱内放有活细胞，请注意切勿放置在室外。

更改 : 2013.03.06 放有2细胞期胚胎的纸盒与冰袋放进保温瓶的顺序互换，因为先放冰袋后放纸盒，使纸盒难以受到内外气温差的影响，原页面请点击此处。

从冷藏运输试剂盒里取出2期细胞胚胎

1. 　注入3滴100μL 的KSOM/AA在培养皿上，然后用流动石蜡覆盖。把培养皿放入培养箱里孵育至少30分钟。 

2. 　从保温瓶里取出放有样品的纸盒。

3.　 纸盒在室温下放置30分钟。

       注意: 胚胎将在30分钟内沉在EP管底部。

4.　 打开纸盒，轻轻地取出棉花，一旦取出棉花后，要拿起装有胚胎的EP管，并打开盖子。

5. 　用灌注凝胶枪头收集EP管中M2上清液200μL，然后转移到培养皿的边缘。

6. 　用灌注凝胶枪头小心地把全部M2包括在EP管底部的胚胎移至培养皿的中心。
      注意: 为了方便操作，在使用移液器时尽量避免吸入空气。

7.  　从M2里采集的胚胎，分别转移至3个100μL KSOM/AA 滴液中，进行清洗。

 注意:  如果不能移走所有的胚胎，可以用培养皿边缘上的200μL M2滴液来清洗EP管内部。

8.　 然后把胚胎移植到代孕小鼠的输卵管内。

　  注意:　理论上，在胚胎清洗完至移植到代孕小鼠体内的这一过程需在短时间内完成。 (请参考“胚胎移植入输卵管”)

小鼠生殖工程学技术——7冻存小鼠胚胎

便捷的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

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◆材料

1. 　1M DMSO (Cat. CSR-R-T072)

2. 　DAP213 (Cat.# CSR-R-T073)

3.　培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

4.　过滤装置(Millex-GV 0.22µm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)

5.　灌注凝胶枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)

6.　移液管

7.　冻存管(Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan is recommended. If you cannot get it, use 366656; NUNC.)

8.　微管

9.　冻存架

10.　Nalgene 冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)

11.　液氮

12.　显微镜.

13.　0.25 M 蔗糖

14.　KSOM/AA

15.　液体石蜡

 

◆步骤

 

冷却器和冻存管的准备

1. 　使用前一天，把冷却器放置-20°C 的冷藏库里。

2. 　在实践玻璃化步骤的前10分钟，从冷藏库里取出冷却器。

3. 　冻存管放入冷却器里 (5115-0012; NALGENE, USA)。
       一只冻存管能装大约40个胚胎，换而言之，当你想装120个胚胎时，你需要放3只冻存管在冷却器里。

4. 　开始实验之前，请检查冻存管内的温度是否为0°C 。

玻璃化

1. 　过滤1M DMSO后，在培养皿上滴入4个滴液（~100µL / 个）。其中一滴用于清洗从培养基里采集的胚胎，其余三个用于存放已清洗的胚胎。

2. 　把全部胚胎放入其中一个滴液里，清洗沾有培养基的胚胎。清洗后的胚胎平均放进其余的3个滴液里。这3个等份的胚胎最终将会转移至储存小瓶里。

例如，采集了120个胚胎，分成3个等份，每一等份40个，这些胚胎首先会一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放进3个滴液里。

3.　使用20µL移液管和灌注凝胶枪头 , 转移5µL 的1M DMSO溶液的胚胎至冻存管内。转移后，立即将冻存管放置0°C 冷却器内5分钟。

注意: 冻存管可以放在0°C 冷却器中超过5分钟 (<20分钟)。

       注意: 如果胚胎都集中在滴液的中央，就能把全部胚胎轻易地吸进5µL 的M DMSO 溶液中。

4.　在0°C 下，往冻存管里加入45µL 的冻存液(DAP213) ，并在在0°C冷却器里静置5分钟。 

注意: 加入 DAP213冻存液后，不要把低温管的塞子拧得太紧，否则胚胎复苏后很难快速转移。

5.　迅速将冻存管放到冻存架上，然后直接放进液氮里。

参考文献

【1】 Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fert. 87: 479-483.

【2】 Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 77-80.

【3】 Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp. Anim. 44: 1-8.

【4】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234. 118.

小鼠生殖工程学技术——8胚胎移植入输卵管

在实验中，我们通过输卵管壁将2细胞期胚胎移植入代孕小鼠体内。与传统胚胎移植的过程相比，更简易，而且适合没有经验的实验操作员。

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◆材料

1.　假孕第一天的雌性小鼠(这天观察小鼠阴栓)

2.　微型弹簧剪刀（5mm刀片）

3.　钳子（Pair of watchmaker's #5 forceps）

4.　动脉夹

5.　伤口缝合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

→clip applicator

6.　塑料培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

7.　用于胚胎的移植和操作的玻璃微管

◆步骤

准备小鼠

1.　麻醉一只雌性小鼠。

2.　常规方法是取出卵巢、输卵管及部分子宫。

3.　用动脉夹固定附着在卵巢囊上的脂肪

定位输卵管

如下图所示，通过切割输卵管，往切口处插入微管，然后朝输卵管的壶腹部注入胚胎。

但是，正如我们所看到的输卵管的图示(A)，小鼠的输卵管呈细微而复杂的折叠式结构。而且，微管是从上方插入的，胚胎难以到达输卵管的壶腹部。

为了简化此过程，在操作前，可以通过动脉夹来改变输卵管的定位，如图(B)。

1.   立体显微镜下观察输卵管，并使用钳子的尖端来确认输卵管伞部和壶腹部的位置，或者改变动脉夹的位置。

2. 　通过改变动脉夹和小鼠的位置来定位输卵管。

      注意：因为每只小鼠的输卵管折叠形状都不一样，需要仔细观察和定位输卵管才能更容易地进行实验。
      注意：如果你是左撇子，就能轻易地完成定位输卵管的步骤。

胚胎与玻璃微管的制备

１.   在培养皿上制作一个200μL的 KSOM/AA滴液 (无液体石蜡)，然后在滴液里放入20个胚胎。

2.   制作转移胚胎的玻璃微管，管内的空气和溶液交替间隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10个胚胎。

 

     注意：如上图所示，当玻璃微管首次插入滴液时，液体石蜡会残留在滴液的表面。玻璃微管应从另一边吸入胚胎，以免吸入液体石蜡。

有证据表明，如果输卵管沾上液体石蜡会对胚胎发育造成不利的影响。 

转移胚胎

１.   使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型弹簧剪刀，解剖伞部和壶腹部之间的输卵管壁。

2.　将含有胚胎的微管插入输卵管的切口处，朝壶腹部注入胚胎。

3. 　用钳子固定微管插入的输卵管的位置。

4. 　排出胚胎和2~3个气泡到壶腹部处。

注意： 如果实验进程顺利，你可以通过壶腹部的壁看到气泡。

　　注意：如果你无法将胚胎和气泡排进输卵管，稍微往后移动玻璃微管，再次尝试。 

5.　将切口处的微管移走。

注意：调整输卵管的位置和方向后才能转移胚胎。如果微管平行对齐输卵管，就能更容易地插入输卵管内。 

6.　把卵巢、输卵管和子宫放回小鼠的腹部，用伤口缝合器缝合伤口。 

7.　重复上述步骤，把剩余的10个胚胎移植到另一只小鼠的输卵管内。

8.　在37°C 加热板上保持小鼠的体温，直到小鼠苏醒。

参考文献

【1】  Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.

【2】  Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.