小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

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◆材料

1、12周以上的雄性小鼠
2、noesu剪刀（森田制造所  电话03-3811-9730 特别订制品）

3、FERTIUP^® 精子冻存液（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、mHTF
5、培养皿（Corning 35mm X 10mm　Cat.No.430588）
6、黄色枪头（BM医疗器 Cat.No.110-96R）
7、填充精子用的吸管(My Science Cryo Bio System 0.25mL cotton-plugged Sperm StrawsReferences.010261 or My ScienceFrance Cassou type Straws (AAA201)　0.25mL Cat.No.005565）
8、配套吸管用的注射器
9、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-10 P-100）
10、加热板（37℃）
11、封口包装机（富士MPULSE 专业包装机器Cat.No.P-200）
12、冻结精子用的吸管
13、Triangle Cassette
14、液氮储存器和干式液态氮筒
15、剪刀

◆步骤

制作冻存精子悬浮装置

1、3厘米厚的泡沫切成圆柱状，塞进50mL的注射器外筒内（泰尔茂Cat. No.SS-50ESz）。

2、用火加热50mL注射器前端，来封堵前端口。

3、用铁丝把注射器固定在50cm的玻璃棒上。

※该装置也可从Cosmo Bio直接购买

准备吸管及制作配套吸管的注射器

1、 在填充精子用的吸管中部贴上标签，剪下棉塞处。
2、 把1mL注射器（泰尔茂Cat. No.SS-01T）、三方活塞（泰尔茂 Cat.No.TS-TR1K）、橡胶管・塑料管（DRUMMOND　Cat.No.2-040-000）以及硅帽组装成如下图
3、 精子填充用的吸管的棉塞一侧插进注射器的硅帽里使用。

制作精子悬浊液

1、在培养皿上制作冻存滴液（FERTIUP^®精子冻液：60μL），用流动石蜡覆盖滴液；

2、往被覆盖的滴液里再注射进冻存液（FERTIUP^®精子冻液：60μL）,得到一个更大的滴液。

※制作后的培养放置在37℃的加热板上至使用时才拿出。

3、让成年雄性小鼠安乐死，把收集的左右附睾尾放置过滤纸上，在实体显微镜下小心地取出血液和脂肪。

4、在培养皿上少量的FERTIUP^®精子冻存液的滴液里小心地清洗附睾尾。

5、FERTIUP®精子冻存液的滴液里放进2个附睾尾，用noesu剪刀在附睾尾处剪开5~6切痕。

※只有一个附睾尾时，只需60μL FERTIUP^® 精子冻存液的滴液。

6、培养皿在37℃加热板上静置3分钟，为了得到均匀的精子悬浊液，需每分钟搅拌一次。

精子悬浊液填充吸管

1、 把填充精子悬浊液的吸管插进吸管配套用的注射器内，往吸管注入约100μL的mHTF。
※一根吸管只能注入10μL的精子悬浊液，如果把吸管就这样浸泡在液氮中，吸管就会浮起来，所以mHTF充当砝码，让吸管沉浸在液氮底部。

2、注入mTHF后，吸管前端需留有15mm的空隙。
3、用黄色枪头吸取培养皿上10μL的精子悬浊液，然后注射进吸管里。

4、 接着再留15mm空隙，用封口机封住吸管端口。

※拉开注射器内筒，观察精子悬浊液和mHTF的状态来确认是否已完全密封。如果精子悬浊液和mHTF移动了，就需再次封口。
5、 从注射器内，移走吸管，用封口机把吸管的另一侧封住。
6、 重复1~5个步骤，制作10~11根填充了精子悬浊液的吸管。

冻存（使用液氮储存）

1、 吸管内精子悬浊液一侧朝下放进浮物里。
2、 浮物浮在液氮面上，大概静置10分钟后，让浮物浸泡在液氮里。

3、 捞起装满了液氮的浮物，把吸管移至预先在液氮内冷却的Triangle cassette，存放在液氮里

冻存（使用干式液态氮筒）

1、 吸管内精子悬浊液一侧朝下，放进Triangle cassette内。
2、 从干式液态氮筒里取出一个容器（金属制造的筒），然后把Triangle cassette翻入容器里，盖上干式液态氮筒的盖子。

※在使用干式液态氮筒的前一天，筒内装满液氮，让筒内的吸附剂充分吸收液氮，吸收不了的多余的液氮，使用前之前倒掉。

3、静置10分钟

※用干式液态氮筒冻存精子时，可以直接运输放进干式液态氮筒里的精子。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

 

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◆材料

1、  过量排卵处理后的雌性小鼠
2、  FERTIUP^®精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、  CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、  mHTF（Cosmo Bio Co., Ltd）
5、  枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）
6、  培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
7、  与吸管配用的注射器
8、  恒温水箱（37°C）
9、  精子复苏用的Float
10、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）
11、CO₂培养箱
12、剪刀
13、吸水纸

◆方法

 

制作复苏精子的漂浮装置

1、50mL的离心管与泡沫组合成漂浮装置如下图，用于精子复苏。

复苏精子前的准备

1、  准备恒温水箱（37°C）
2、  用37°C的温水装满装置里的离心管后，放进水箱里，漂浮装置就会浮起来，如下图

3、  在复苏精子前30分钟，制作精子预孵培养皿（滴入90μL FERTIUP^® 精子预孵培养基），准备静置在培养箱里。

4、  收集卵子的前10分钟，制作受精用的培养皿（滴入一个90μL CARD MEDIUM^® 滴液，静置在培养箱。

※根据体外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM^® 调试方法也不同。具体请参考操作说明书。

5、  制作清洗卵子用的培养皿（80µL mHTF滴液4个），在培养箱里静置30分钟以上。

采集卵子

1、 让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17个小时后安乐死，然后把卵子放进受精用的培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液里（一滴液里可放2~3只小鼠的卵子）

※ 从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM^® 滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）

※一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只地进行，并迅速提取卵子。
2、采集卵子后，把受精用培养皿放进 CO₂培养箱里预孵培养30~60分钟。

精子的复苏

1、用钳子取出液氮储存器里的吸管，在空气中逗留5秒，立刻放置37°C恒温水箱的装置里，进行加热。

要点：为确保在37°C下加热，将吸管里的冻存精子朝下方放进浮动物里。

要点：冻融的精子会因处在的周围环境的变化而变弱，在精子运动前，从高粘性精子保存液里移至低粘性培养基（FERTIUP^® 精子预孵培养基），复苏后的精子的运动能力不会完全恢复。为了能让复苏后的精子在37°C加热5分钟以上精子就能很好地运动，请让试管在37°C温水中静置10分钟后，将精子悬浊液移至预孵培养基中(FERTIUP^®精子预孵培养基)。
2、 加热后，从37°C恒温水箱里取出试管，用吸水纸把试管表面的水分吸干。

取出精子悬浊液进行预孵

1、 切断吸管内的mHTF与封口的中间处（要提前拉出注射器的内筒）

2、 把剪断后的吸管插入到注射器里。

3、 吸管插入注射器后，吸管内气压变高，为了释放气压，需要转动一次三路活塞的一个旋塞。

4、旋塞往上回正后，切断精子悬浊液与封口中间处。

5、慢慢按下注射器内筒，只把精子悬浊液注射进精子预孵培养皿的滴液中。

6、  往培养箱内放入5个精子预孵培养皿，培养30分钟。

要点：精子预孵培养皿需要静置在培养箱里直到精子已完全复苏。请注意不要在精子完全复苏前摇动培养皿，否则精子的运动性能就不能完全得到恢复。

受精

1、 用枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics），吸取预孵后的精子悬浊液10μl，注射进含有卵子的受精培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液里。（受精）
2、 受精后，把受精用的培养皿放进培养箱里进行3小时培养。

要点：受精用的精子悬浊液是从集合优良精子的预孵培养液滴液的边缘里收集。（请参阅下图

要点：一个滴液里可收集3~4次精子悬浊液。

要点：精子悬浊液要注射进受精用培养皿的滴液里，使卵子充分接触精子悬浊液。

3、 受精后3小时 ，在清洗卵子用培养皿的滴液清洗正常形态的卵子，培养至次日。

※清洗前，由于卵子的透明带上会附着许多精子，所以用装上枪头的自动移液器，把受精用培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液移液20~30次后，才清洗卵子。

※清洗的时候，请注意，尽量不要把CARD MEDIUM^® 带入到清洗卵子用培养皿的滴液里。

4、 受精6个小时后，仔细观察卵子，摘取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。
5、 次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。