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外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体

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外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体

外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体

公益财团法人癌研究会 爱研究所 细胞老化项目 冈田 辽

国立研究开发发热科学技术振兴机构 高桥 晓子


◆前言


日本人的平均寿命每年都在持续延长，世人皆知如今日本已成为屈指可数的长寿国。然而，像癌症、动脉硬化、阿尔茨海默病、肺纤维化、骨质疏松等随之而来的老年病的增加，已成为深刻的社会问题。老年病的发病原因各有不同，最近有报道称引发老年病的诱因之一，可能是随年龄增长储存在体内的老化细胞。老化细胞是指在生物体内发生了“细胞老化”、且细胞发生了不可逆停止增殖的细胞。众所周知，老化细胞会分泌出各种炎症蛋白；但我们研究发现老化细胞不仅分泌炎症蛋白，还促进外泌体的分泌，因此老年病与外泌体的研究分析还在持续进行。本文主要就老化细胞分泌外泌体为中心的研究发展进行了概述。

◆细胞老化是什么


除去部分的组织干细胞，构成我们身体的大部分细胞的分裂次数是有限的，正常的体细胞达到细胞寿命并不可逆地停止增殖的状态称为细胞老化1）。另外，就算添加活性正常的细胞至有致癌危险的应激反应（染色体缩短、癌基因的活化、氧化应激等）中，还是会被细胞老化诱导而不可逆地停止增殖。因此，我们认为细胞老化与细胞凋亡相同，有防止异常细胞增殖、抑制癌症的作用2）。然而，细胞老化不同于细胞死亡，老化细胞会在生物体内长期生存，因此随着年龄的增长，体内的老化细胞会越来越多3）。另一方面，老化细胞中的染色质结构会根据持续的DNA损伤应答而改变，如炎症性细胞因子、趋化因子、基质分解酶和增殖因子等各种炎症蛋白基因活化表达4）。已知老化细胞会分泌炎症蛋白到细胞外，这样的细胞老化的表现型被称为SASP（Senescence-associated secretory phenotype）。从老化细胞中分泌出来的SASP因子会引发周围组织的慢性炎症，可以看出这很可能是形成老年病的原因5）。我们在分析老化细胞分泌的SASP因子的过程中发现，SASP因此还能促进老化细胞外泌体的分泌6)。

◆外泌体是什么


外泌体是直径约为50~150 nm的细胞外囊泡，是细胞膜内吞成为内体，再成为多泡体而形成的。外泌体含有蛋白质、脂质、核酸等细胞内组成分子，并具有将其转运到其它细胞的功能，因此近年来有报道称外泌体具有细胞间信息传递的作用，引起了广泛地关注7）。

◆细胞老化和外泌体


使用人正常纤维细胞诱导的具有分裂寿命的细胞老化（eplicative senescence）和癌基因RasV12活化的细胞老化（Oncogene-induced senescence），用NTA（Nanoparticle Tracking Analysis）检测外泌体的分泌量后，老化细胞的分泌量比年轻细胞高约30倍6）。因此，我们针对老化细胞中促进外泌体分泌的生物学机能进行了分析。分别敲除老化细胞中参与外泌体生物合成和分泌的Alix 和 Rab27a两个基因，切断外泌体的通道后诱导细胞凋亡状的细胞死亡。令人惊讶地是，即使是年轻增殖中的正常细胞，切断外泌体的路径也会激活DNA损伤应答和诱导细胞死亡，所以正常的细胞有可能会通过外泌体通道将有些有害物质分泌到细胞外。因此，我们在探索分泌外泌体的正常细胞中引发DNA损伤的诱导分子过程中，发现了其细胞质中的基因组DNA片段。细胞质中存在的DNA片段通过细胞质DNA传感（cGAS-STING 通道）被感知，从而引起自然免疫应答。总之，正常的细胞通过外泌体将有害的基因组DNA片段分泌到细胞外，防止对自身DNA的自然免疫应答。外泌体还作为如腺病毒等的外来性DNA病毒感染的屏障，表明外泌体通道是维持细胞稳定性的重要的生物体防御机制之一6）。

在正常的细胞中，细胞质中的DNA片段可通过DNase2a 和 TREX1等DNA分解酶快速清除，但是我们发现老化细胞中DNA分解酶的表达水平下降8）。为此，我们报道了在老化细胞中，储存在细胞质中的基因DNA片段通过激活DNA感应通道引起自然免疫应答，诱导SASP，参与肥胖引起的肝癌的病发（图1）。


外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体


图1. 老化细胞和外泌体

◆作为SASP的外泌体


众所周知，癌微环境中的老化细胞作为CAFs（Cancer-associated f ibroblasts）通过SASP因子促进癌细胞的增殖和转移和浸润。我们为了调查老化细胞分泌的外泌体的机能，分别向从年轻细胞和老化细胞中回收外泌体片段，分别向其中添加乳癌细胞株（MCF-7），观察到只有老化细胞分泌的外泌体片段对癌细胞的增殖有促进作用。接着，从各个细胞中回收的外泌体片段进行蛋白质组分析，结果显示，在老化细胞分泌的外泌体中， Ephlin-A2（EphA2）（酪氨酸激酶型受体之一的癌转移促进因子）的含量显著增加。并且，由于调节EphA2去磷酸化的PTP1B失活，外泌体会选择性地摄取被磷酸化的EphA2，我们发现在老化细胞中，外泌体有存在决定装载何种物质的机制。因此，指出老化细胞分泌的外泌体膜上的EphA2与癌细胞中高表达的受体（Ephlin-A1）相结合，通过激活下游的Erk信号来促进癌细胞的增殖。在该研究中我们明确发现了老化细胞来源的细胞外分泌膜囊泡作为促进癌细胞增殖的SASP因子起作用9）。



◆结语


外泌体迄今为止作为细胞间信息传递工具的功能和诊断工具的实用性被关注并研究，但是细胞为何会分泌外泌体，其在生物学的意义上还有许多的未解之谜。最近，有报道称通过去除下丘脑干细胞和祖细胞的早衰症模型小鼠实验，调节下丘脑干细胞来源的外泌体中miRNA量改变了老年病的发病速度和个体寿命10）。而且由于将有治疗效果的特定的siRNA和mRNA加载到外泌体并送入靶细胞的技术不断被开发11,12），所以期待今后外泌体可以不仅作为疾患的生物标记，还能作为 DDS（Drug delivery system）被有效运用。

◆参考文献


１） Hayflick, L. : Exp. Cell Res., 37, 614 （1965）.

２） Takahashi, A. et al. : Nat. Cell Biol., 8, 1291 （2006）.

３） Yamakoshi, K. et al. : J. Cell Biol., 186, 393 （2009）.

４） Takahashi, A. et al. : Mol. Cell, 45, 123 （2012）.

５） He, S. et al. : Cell, 169, 1000 （2017）.

６） Takahashi, A. et al. : Nat. Commun., 8, 15287 （2017）.

７） Tkach, M. and Théry, C. : Cell, 164, 1226 （2016）.

８） Takahashi, A. et al. : Nat. Commun., 9, 1249 （2018）.

９） Takasugi, M. et al. : Nat. Commun., 8, 15729 （2017）.

10） Zhang, Y. et al. : Nature, 548, 52 （2017）.

11） Kamerkar, S. et al. : Nature, 546, 498 （2017）.

12） Kojima, R. et al. : Nat. Commun., 9, 1305 （2018）

第三回 利用CUBIC实现组织透明化与3D观察

发表于由

第三回 利用CUBIC实现组织透明化与3D观察

第三回 利用CUBIC实现组织透明化与3D观察


东京大学研究生院医学系研究科系统药理学教室 洲㟢 悦生

 


◆前言


　　距今一百多年前，德国的Spalteholz开发出有机溶剂苯甲醇和水杨酸甲酯混合的组织透明化试剂，并报告了3D观察人体组织的案例1） （其中一部分样品至今仍在德累斯顿的公众卫生博物馆展览）。但在上世纪八十年代之前，组织透明化技术并未出现明显的发展与应用案例，直至在1989年，Dent提出关于Murray's clear或称为BABB法的改良Spalteholz试剂的应用实例报告2） ，并且在 九十年代以后俄罗斯的Tuchin等，台湾的Chiang等又提出了利用水溶性化合物进行的组织透明化方法3、4） ，开拓了近代组织透明化技术开发的道路。其中，以2007年的Dodt等5） ，2011年的滨等6）的荧光3D成像的使用案例为开端，以及随着近10年来数十种组织透明化方法的开发，组织透明化方法已经成为主要的组织观察手段之一。

　　我们团队于2014年发表了命名为CUBIC的全器官、全身级别细胞分析技术的概念7、8），并且不断开发高度组织透明化方法，以作为实现该概念的重要技术要素之一。本文将围绕其详情与应用实例进行介绍。

 


◆CUBIC技术概念与开发历程


　　CUBIC（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis）是一项将整个器官，或全身所有细胞作为观察对象，无偏差且详尽地收集并分析细胞种类、细胞功能、细胞间的连接等信息的技术概念（图1）。

　　收集细胞分辨率的图像数据需要适合的光线模式，为了3D观察不透明的大型组织样品，必须使组织光学性透明。特别是在现实的时间尺度上，以整个器官与全身作为CUBIC的光学观察对象时，适合使用一种名为光片显微镜的特殊显微镜，通过在样品内产生光学切片并收集二维图像堆栈5） （图1、"整个器官的3D成像"部分）。

第三回 利用CUBIC实现组织透明化与3D观察


图1.　CUBIC技术概念概略图


　　CUBIC是一项实现对整个器官和全身进行全面细胞分析的技术概念。将添加了荧光标记的组织样品光学性透明化，使用能够高速摄影大型样品整体的光片显微镜获取细胞分辨率的图像。根据所获图像的定量分析，提取细胞种类、细胞活动、细胞网络结构等信息。图谱图像来源Allen Brain Atlas（http://portal.brain-map.org）。

　　但是，由于光片显微镜从侧面照射激发光并从上方观察荧光信号，因此需将样品整体高度透明化（就如"透明"的字面意思几乎完全看不到的程度）。当然，荧光信号在透明化后仍需保留下来，以方便观察。

　　在笔者和研究人员开始开发CUBIC的2010年至2011年间，满足这些规范要求的组织透明技术尚未存在，因此需要开发新技术。恰逢理化学研究所的滨、宫胁等团队，发表了适合荧光蛋白信号保存的水溶性复合碱的组织透明化试剂"Scale"6），随即我们推出了独特的筛选方法，无需依赖直觉即可选择理想的水溶性化合物，并对40种化合物进行了定量筛选。 最后，成功开发了"ScaleCUBIC试剂"，即在Scale的主要成分尿素中添加我们新发现的氨基醇 7） 。不仅如此，我们发现氨基醇能够去除组织中的主要吸光物质——血红素，并在后续 "脱色"过程中发挥重要作用8）。凭借这些特点，ScaleCUBIC试剂能够实现小鼠大脑、小鼠全身、人体组织等高度透明化并进行3D观察。

　　随后我们团队接连发表了观察小鼠全脑全细胞的膨润透明化法"CUBIC-X"、筛选1600种以上水溶性化合物后更新推出的"第二代 CUBIC试剂（CUBIC-L/R等）"、作为小鼠全脑分析基础的单细胞分辨率图谱 "CUBIC-Atlas"等的技术组成部分9-11）（表1）。

　　现在，我们更是准备发表3D染色方案、小鼠全脑单细胞分析基础、高速全细胞观察显微镜等新的基础技术。希望考虑使用CUBIC技术的各位用户也能继续关注这些研发成果。

试剂世代

功效

主要成分

文献

ScaleCUBIC-1

第1代

脱脂、脱色

氨基醇（四羟丙基乙二胺）、

尿素、Triton X-100

13）

ScaleCUBIC-1A

第1代

脱脂、脱色

氨基醇（四羟丙基乙二胺）、

尿素、Triton X-100

http://cubic.riken.jp/

ScaleCUBIC-2

第1代

调整折射率

氨基醇（三乙醇胺）、

尿素、蔗糖

13）

CUBIC-X

第1代

膨润+

调整折射率

安替比林、咪唑

9）

CUBIC-L

第2代

脱脂、脱色

氨基醇（N-丁基二乙醇胺）、Triton X-100

11）

CUBIC-P

第2代

脱色

1-甲基咪唑、氨基醇（N-丁基二乙醇胺）、Triton X-100

11）

CUBIC-B

第2代

骨脱钙

EDTA、咪唑

11）

CUBIC-HL

第2代

脱脂、脱色

（部分人组织）

1,3-双（氨基甲基）环己烷、

十二烷基苯磺酸钠

11）

CUBIC-R

第2代

调整折射率

安替比林、

烟酰胺或N-甲基烟酰胺

11）

 

表1.　CUBIC试剂一览


　　第二代试剂未使用Scale的主要成分尿素，因此将其统一记录为"CUBIC-〇〇"。


◆利用CUBIC进行组织透明化


　　所谓物体的光学透明，就是在入射光进入内部后几乎直线射出，不发生散射或吸收。组织之所以不透明，就是因为组织中各种成分的光学性质不均一，使入射光强烈散射。除此之外还含有像血液中的血红素那样强烈吸收可见光的色素。因此，组织透明化就是要通过1）去除组织中的光散射和光吸收物质，2）均一化组织成分与周围溶剂成分的光学性质（尤其是折射率），这两个步骤来达成。CUBIC试剂中表面活性剂（Triton X-100）与氨基醇对于上述1）中的过程十分重要。而 ScaleCUBIC试剂中的蔗糖，第二代CUBIC试剂中的安替比林与烟酰胺衍生物则对于上述2）中的过程尤为重要。

　　折射率调节剂拥有接近蛋白等生物体内物质折射率1.5左右的高折射率，"透明化"便是通过更换为折射率调节剂得以完成的。然而，ScaleCUBIC-1试剂也通过氨基醇与尿素的组合实现了相对较高的折射率（1.43），因此单种试剂便可实现较为明显的透明化，对于不熟悉透明化方法或想要在短时间内透明化少量样品并用共聚焦显微镜或双光子显微镜观察的用户，建议先尝试使用该试剂。

　　更高度的透明化则推荐使用脱脂和脱色剂+折射率调整剂这两个步骤进行透明化。此外，骨组织还需要进一步脱钙。我们在筛选1600多种大型化合物时也将脱钙化合物作为筛选对象，向EDTA中加入咪唑的脱钙试剂（CUBIC-B）。由于包含人在内的灵长类动物组织比啮齿动物组织的脱脂难度更高，因此，通过同样的大规模筛选开发了拥有更强脱脂能力的试剂（CUBIC-HL）11） 。

　　CUBIC试剂虽然拥有出色的荧光蛋白（GFP变体、mCherry、tdTomato、mKate2等）保存性，但是在表达量极少的情况下也无法获得足够的信号。不仅如此，该试剂还与部分荧光蛋白不兼容。因此，我们建议使用实际样品评估残留荧光信号。

　　将样品最小化并缩短处理时间的同时，在室温而不是37°C下进行脱脂，可改善荧光信号。另外，我们也公布了提高ScaleCUBIC-1试剂荧光信号保存性的ScaleCUBIC-1A（Reagent-1A）的试剂成分表（http://cubic.riken.jp/）。我们建议您将其与新的CUBIC-L试剂一起使用。图2总结了组织透明化过程。组织透明化是一种应用于固定的组织样品的技术，必须根据使用方案选择适合的固定方法。

第三回 利用CUBIC实现组织透明化与3D观察


图2.　使用CUBIC的组织透明化和成像流程


　　CUBIC试剂针对多聚甲醛（PFA）固定组织进行了优化。固定组织经过脱脂、脱色后通过调整折射率实现透明化。中间的清洗过程可保存样品。试剂详情请参考表1。

 


　　在使用CUBIC时，通常推荐4%多聚甲醛进行固定。固定剂的pH值保持中性，且样品间的固定温度和交联时间原则上应保持一致。脱脂、脱色期间根据样品不同而有所区别，若是推荐实验方案中没有应用实例的组织请务必探讨实验条件。

　　由于脱脂、脱色后的样品呈现海绵状，需要进行防止样品损害的操作。对此，笔者团队是将样品放置在药勺上进行处理。此外，该阶段样品的长期保存可以使用含有防腐剂的PBS等。

　　由于折射率调节剂是浓度极高的试剂，需要提前替换成使用蒸馏水稀释为50%浓度的试剂处理1天以上后，再替换为100%浓度的试剂。假如稀释后的折射率调节剂的处理时间不足的话，可能导致内部无法透明化、组织变形等问题。观察后的组织通过使用PBS清洗，即可与脱脂、脱色后的样品在相同条件下进行保存。

 


◆CUBIC应用实例


　　医学生物学研究中组织透明化技术的应用实例逐年迅速增加，检索文献就可以查找到各种各样的生物种类以及组织的应用实例。例如在google scholar中搜索"CUBIC tissue clearing"，即可发现8000多个匹配项和各种目标样品。其中还有鼠妇、蟹等甲壳类的适用案例12），另外，笔者意料之外的应用实例亦比比皆是。因此，考虑使用本试剂的用户，可先行搜索文献等寻找适用案例将会有助于研究的顺利开展。

　　接下来将介绍笔者团队关于CUBIC的应用实例。如上述所示，CUBIC将"整个器官和全身细胞的全面分析"作为概念，在开始的论文中7、13），首先提出了有无光刺激下两个个体在两种条件下的小鼠全脑神经活动比较分析的案例报告（图3A）。其后，还提出了将样品数量扩大，对给药后的小鼠进行时间顺序采样，分析其全脑神经活动的案例报

告14）。在该案例中，使用了总计8种条件下20只小鼠的大脑，最后进行在微阵列分析等方法中广泛应用的聚类分析，成功确定了特定时间段、实验条件下进行特异性活动的神经细胞群。感兴趣的读者可以参考原著论文。

　　另外，还有使用第二代CUBIC试剂使小鼠全身透明化，进行癌细胞转移模型小鼠全身分析的案例报告10）。从该案例的小鼠全身3D成像数据中可以看出，器官中四处分布的微小转移灶也可毫无遗漏地检测出来（图3），证明了CUBIC在全身分析研究中的实用性。

　　CUBIC还可以兼容核染色与免疫染色等组织学研究方法，并且部分抗体还可以将大脑、消化道、肾脏等器官整体染色并成像8、10、15）（图3C）。此外，还探讨了关于人组织与透明化、免疫染色、石蜡包埋术的相容性，并报告了CUBIC能够将3D病理学案例中的结肠癌淋巴结转移检测率提高至100% 16）。

第三回 利用CUBIC实现组织透明化与3D观察


图3.　CUBIC的应用案例


A：在光刺激后，对表达荧光蛋白Venus标记的转基因小鼠（Arc-dVenus Tg）19）的神经活动进行采样，然后与没有光刺激的对照组进行比较。将两组数据嵌入标准大脑数据并进行标准化后，制作重合图像进行比较。使用数据改自文献13）。

B：癌细胞转移模型小鼠全身透明化，并进行3D成像的案例。能够毫无遗漏地检测出用mCherry标记的癌细胞的微小转移。使用数据改自文献10）。

C：小鼠全脑免疫染色案例。使用标记血管平滑肌的α-Smooth Muscle Actin（SMA）抗体染色整个大脑后，进行透明化、3D成像。使用数据改自文献10）。

 


　　在3D抗体染色时，建议使用抗体信噪比高且染色性好的单克隆抗体。笔者等人制备脱脂、脱色后的组织冷冻切片，确认抗体性能。

　　此外，为了不反复进行3D浸透过程，建议一抗使用直标荧光的抗体。根据抗体的不同，有些抗体会在折射率调节剂中剥离，建议在染色后用1%左右的PFA进行后续固定。但是，过强的固定会阻碍透明化，因此建议在保留抗体信号的最低限度下进行固定。

　　目前发表的实验方案仍未完全解决抗体的深层浸透问题，笔者等人正准备发表能够大大改善该问题的理想实验方案。感兴趣的用户请关注今后发表的论文。

 


◆结语

　　对于想要了解更多详情的用户，可以参考透明化、3D成像相关的英文综述17、18）。目前已经发表了数篇优秀的实验方案，用户可根据研究目的选择理想的实验方案。然而，包括我们研究团队在内的许多开发小组仍在不断地改进技术，希望各位不仅要关注早期的论文，更要关注新发布的研究文献。

　　若有CUBIC相关的技术问题需要咨询笔者（esusaki@m.u-tokyo.ac.jp），我们将随时为您解答。希望本项研究能够帮助到计划将组织透明化运用于自身研究中的各位用户。

 


◆参考文献

1） Spalteholz, W. : "Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten.", S. Hirzel, Leipzig (1914).

2）Dent, J. A., Polson, A. G. and Klymkowsky, M. W. : "A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus.", Development, 105, 61 (1989).

3）Tuchin, V. V. et al. : Proc. SPIE, 3863, 10 (1999).

4）Liu, Y.-C. and Chiang, A.-S. : "High-resolution confocal imaging and three-dimensional rendering.", Methods, 30, 86 (2003).

5）Dodt, H. U. et al. : "Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.", Nat. Methods, 4, 331 (2007).

6）Hama, H. et al. : "Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.", Nat. Neurosci., 14, 1481 (2011).

7）Susaki, E. A. et al. : "Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.", Cell, 157, 726 (2014).

8）Tainaka, K. et al . : "Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.", Cell, 159, 911 (2014).

9）Murakami, T. C. et al. : "A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.", Nat. Neurosci., 21, 625 (2018).

10）Kubota, S. I. et al. : "Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.", Cell Rep., 20, 236 (2017).

11）Tainaka, K. et al. : "Chemical Landscape for Tissue Clearing based on Hydrophilic Reagents.", Cell Rep., 24, 2196 (2018).

12）Konno, A. and Okazaki, S. : "Aqueous-based tissue clearing in crustaceans.", Zoological Lett., 4, 13 (2018).

13）Susaki, E. A. et al . : "Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.", Nat. Protoc., 10, 1709 (2015).

14）Tatsuki, F. et al. : "Involvement of Ca2+– Dependent Hyperpolarization in Sleep Duration in Mammals.", Neuron, 90, 70 (2016).

15）Hasegawa, S. et al. : "Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.", Kidney Int., 96, 129 (2019).

16）Nojima, S. et al. : "CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis.", Sci. Rep., 7, 9269 (2017).

17）Tainaka, K. et al. : "Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.", Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 32, 713 (2016).

18）Susaki, E. A. and Ueda, H. R. : "Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.", Cell Chem. Biol., 23, 137 (2016).

19）Eguchi, M. and Yamaguchi, S. : "In vivo and in vitro visualization of gene expression dynamics over extensive areas of the brain.", Neuroimage, 44, 1274 (2009).

第三回 BDNF与精神疾病的关系（BDNF通路介导的可塑性控制与精神疾病）

发表于由

第三回 BDNF与精神疾病的关系（BDNF通路介导的可塑性控制与精神疾病）

阐明BDNF-从基础到临床-

第三回 BDNF与精神疾病的关系（BDNF通路介导的可塑性控制与精神疾病）

赫尔辛基大学 神经科学中心 梅森十三

第三回 BDNF与精神疾病的关系（BDNF通路介导的可塑性控制与精神疾病）

◆前言

此前，我们阐述了BDNF通路与神经可塑性的控制相关。如果可塑性提高，为适应学习以及环境的变化，神经回路会进行结构以及功能上的重组。据病理生理学的（前）临床研究报告，精神分裂症和抑郁症等精神疾病患者身上发现了通过BDNF及其受体TrkB介导的信号传导异常。最近，研究人员还阐明了抗抑郁药通过BDNF/TrkB信号传导来调节神经可塑性的机制。本文将结合最新的研究结果，讲解BDNF/TrkB通路异常与精神疾病的关系，以及以该通路为靶标的精神疾病症状的改善。

◆精神分裂症中的BDNF/TrkB通路异常

BDNF通路不仅在胚胎期和临界期的大脑发育中发挥作用，在成年的海马体以及大脑皮层神经细胞的可塑性和生存调节中也发挥重要作用。因此，BDNF通路的异常可能与精神分裂症患者的大脑变化相关。实际上，在精神分裂症的动物模型中确实发现了BDNF的失调，TrkB前脑特异性敲除小鼠也出现了类似精神分裂症的行为，如异常多动、刻板行为以及认知功能障碍等。

另外，据精神分裂症患者死后的大脑分析报告称，虽然在大脑皮层区域以及海马体中BDNF的浓度下降，但在前扣带回中BDNF的浓度呈上升状态。研究人员推测，这些BDNF的表达异常可能导致了精神分裂症患者的神经发育和神经可塑性的异常1-3）。

◆情绪障碍中的BDNF/TrkB信号传导异常

研究表明，在自杀者和重度抑郁症患者死后的大脑中，BDNF的mRNA和蛋白的数量有所减少，尤其是在海马体和小脑扁桃体中更为明显4）。另外，在抑郁症患者和自杀者的外周血单个核细胞中，BDNF基因启动子的DNA甲基化也有所增加，推测为BDNF表达的不完全调节5）。

在本连载系列的第二回中，提到了人血清中可能来源于血小板的BDNF，检测出高水平。有趣的是，抑郁症患者血清或血浆BDNF的水平较低，但使用抗抑郁药物治疗成功后又会恢复到原有水平。另外，与成功治愈的抑郁症患者以及健康组相比，未经过治疗的抑郁症患者的血清BDNF水平也显著下降4,6）。

与健康组相比，BDNF和proBDNF的比率在双向情感障碍中较高，在抑郁症中较低，由此，其有望作为区分两者的标记物7,8）。但这些BDNF水平如上文所述，在精神分裂症1,3）中呈下降趋势，而在自闭症中则显示上升和下降两种情况9）。由于血清BDNF含量在个体间以及个体内存在高度差异，其可信度和疾病特异性还需进一步探讨。

在抑郁症患者死后的大脑中，除了BDNF，TrkB的蛋白以及mRNA的水平也有所下降，且有报告称TrkB的基因突变与自杀相关。此外，研究人员发现在抑郁症患者的大脑样本中，处于激活状态的磷酸化TrkB数量也有所减少4）。

◆BDNF和精神疾病的遗传相关

BNDF的第66号氨基酸残基大部分为缬氨酸，但此位置上，Caucasoid（高加索人种）的20%~50%为蛋氨酸（Val66Met多态性）10,11）。研究人员认为，此多态性并不只是抑郁症和精神分裂症等精神疾病的风险因素，也可能是多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的风险因素12,13）。

有报告称，在抑郁症中，这种多态性与儿童期虐待、贫困和成年期慢性压力导致的抑郁症易感性有关14）。在动物实验中，此多态性会影响空间记忆和焦虑性行为，以及细胞内BDNF的运输和神经活动依赖性BDNF的释放10,15），还会损伤BDNF mRNA的树突运输16），并降低长时程抑制（long-term depression : LTD）17）。也就是说，此多态性可能会影响BDNF活动依赖性的神经可塑性。

◆抗抑郁药物通过BDNF/TrkB信号提高可塑性

鉴于BDNF/TrkB信号传导在抑郁症患者的血液以及大脑中不断减少，所以抗抑郁药物能提高BDNF水平的这一发现非常重要。实际上，在动物实验中已经发现三环类的单胺氧化酶抑制剂以及选择性血清再摄取抑制剂（Serotonin selective reuptake inhibitor : SSRI）的抗抑郁药能够提高大脑中的BDNF表达水平6）。

另外，小鼠海马的齿状回细胞BDNF和齿状回颗粒神经元前体细胞TrkB的表达缺失，会降低抗抑郁药对抑郁行为和神经发生的效果6）。近年来，即使是作为速效性抗抑郁药物备受瞩目的麻醉药氯胺酮（NMDA型谷氨酸受体拮抗剂），也会由于小鼠前脑区域的BDNF或TrkB的基因缺失，而导致其减少抑郁样行为和增强海马突触等抗抑郁效果受到抑制18）。

此外，Val66Met多态性的小鼠模型，已丧失抗抑郁药物对行为以及神经可塑性的相关反应15,19）。而且在这些小鼠中，由氯胺酮和其代谢物（2R、6R）-羟基化去甲基氯胺酮（hydroxynorketamine ; HNK）所诱导的树突棘形成的增加也受到了抑制18,20）。HNK在氯胺酮的抗抑郁疗效中起主导作用，并且通过BDNF/TrkB信号传导使神经可塑性发生变化21）。

然而，临床研究表明，Met等位基因可能可以改善传统抗抑郁药物的反应22-25），另一方面也有报告显示反应减少26）。要想阐明BDNF信号传导在抑郁症患者的抗抑郁反应中的作用，目前还需要更多的基因学分析依据4）。

◆幼年期可塑性诱导（iPlasticity）对于神经性精神疾病患者的症状改善

笔者所在的赫尔辛基大学神经营养因子研究室（Eero Castren教授），以长期给药抗抑郁药诱导幼儿期关键期样可塑性（induced juvenile critical period-like plasticity : iPlasticity）为焦点进行研究。Castren教授提出，此种可塑性的提高，在配合某种“锻炼”的情况下，不仅是抑郁症，或许也能应用于其他神经性精神疾病的治疗27）。

也就是说，长期给药大鼠或小鼠典型的SSRI药物氟西汀后，结合单眼遮蔽可改善弱视、结合恐惧记忆消除训练可改善创伤后应激障碍（PTSD），而且结合社会化训练还能改善攻击性28-31）。这是由于氟西汀通过激活BDNF/TrkB提高了神经可塑性，再加上内部与外部的刺激使神经激活，并引起脑神经网络重组。

但关于抗抑郁药物如何激活TrkB，又是哪一部分的神经网络受到了何种变化目前尚且不明。最近的研究显示，氟西汀、丙米嗪、氯胺酮等不同类别的抗抑郁药物能够直接与TrkB结合32）。形成二聚体的TrkB会在跨膜结构域互相交叉，形成一个能够与抗抑郁药物结合的口袋。抗抑郁药物能够与口袋内的胆固醇结合域直接结合，稳定突触膜的TrkB，并促进BDNF介导的TrkB信号传导32）。以上的发现提出了一个全新的假说，即抗抑郁药物的主要作用部位不是单胺转运体，而是直接与TrkB相结合。而这一假说同时也成为了热门话题。

而且，我们使用由光刺激引起的二聚化optoTrkB系统，进行了由于BDNF的扩散性而难以进行的靶细胞可塑性研究。小清蛋白阳性神经元通过与TrkB激活和单眼遮蔽结合，可唤起眼优势，提高突触可塑性、以及去抑制引起的LTP增加和脑电波同步33）。现在我们使用optoTrkB系统，以治疗PTSD、改善空间记忆能力和降低药物依赖性为目的进行研究。

第三回 BDNF与精神疾病的关系（BDNF通路介导的可塑性控制与精神疾病）

图：幼年期可塑性诱导（iPlasticity）引发的神经精神疾病患者的症状改善

◆结语

自发现Val66Met多态性以来，众多的基因研究表明，这种基因因素对抗抑郁药效果的影响存在差异。另一方面，也有部分研究表明其效果无法重现。这是由于不同的年龄、性别、环境因素、民族性、在分析时使用的基因模型、以及基因间的相互作用等多种因素混合，产生了复杂的影响而导致的结果34）。在使用动物模型的研究中，利用Val66Met多态性小鼠模型、抗抑郁药物作用的新模型和optoTrkB，有望阐明涉及BDNF通路的精神疾病的发病机制并发现全新的治疗方法。

◆致谢

感谢藤田医科大学 小清水老师提供的有益建言，谨在此表达由衷的谢意。

◆参考文献

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第三回 富士胶片和光纯药助力利用细胞外囊泡的治疗方法的实现

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第三回 富士胶片和光纯药助力利用细胞外囊泡的治疗方法的实现


干细胞来源EV ~治疗，诊断，化妆品的开发~

第三回 富士胶片和光纯药助力利用细胞外囊泡的治疗方法的实现



富士胶片和光纯药株式会社 生产工序开发部 西部隆宏

◆前言

细胞外囊泡（Extracellular vesicle/EV）是由细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的微小囊泡的总称，包括外泌体和微囊泡等1）。近年来，部分细胞（如间充质干细胞 [Mesenchymal stem cell : MSC] 等）来源的EV已被证明在疾病治疗方面发挥作用2），由此促进了使用EV的治疗用试剂、与EV制剂的应用相关的技术开发。

本文将介绍富士胶片和光纯药提供的，参与EV的生成、提纯、保存、质量管理等一系列生成工序的技术以及产品。

◆使用MSC来源EV生成的优化培养基

近年来，我们对各种细胞来源EV的治疗应用进行了尝试，其中MSC来源EV的研究开发尤其受瞩目。事实上截至2022年，在利用EV进行的临床试验中就有六成以上使用了MSC来源EV3）。另一方面，为了获得MSC来源EV而使用的培养液大部分都是传统的基本培养基，优化的培养条件目前尚未确定。

MSC来源EV的生成中大多使用两步工序：在血清培养基（含有牛胎儿血清（FBS）的基本培养基）中增殖MSC后，更换成不含FBS的血清培养基或已去除EV但含有FBS的血清培养基，使EV在培养上清液中生成。敝司针对上述的各阶段工序分别开发了优化培养基。

在MSC的增殖环节，敝司开发了能够使MSC在高品质的状态下高效进行增殖的培养基：MSCulture™（产品编号：133-19331、132-19345）。本培养基是添加了FBS的基本培养基，但与αMEM等传统基本培养基相比细胞增殖效率更高。另外也确认到增殖后的MSC生成的EV的生物活性也得到了提高（图1）。

另外，敝司也开发了用于MSC增殖后生成EV这一阶段的EV生成专用无血清培养基：EV-Up™（产品编号：053-09451、298-84001）。本培养基不仅能提高EV的生成量，还能通过抗纤维化活性确认到生物活性大幅上升4）（图2）。

通过组合使用MSCulture™培养基与EV-Up™培养基，可高效获得高品质的MSC来源EV。在以MSC来源EV的治疗应用为目的进行研究时，请务必考虑使用上述两款培养基。

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图1.  MSCulture™培养基中MSC的增殖能力上升与获得的EV的生物活性之间的对比结果

A）αMEM及MSCulture™培养基中MSC增殖时的细胞数对比

A）αMEM及MSCulture™培养基中各添加了15%的FBS进行测试

B）在各培养基中增殖MSC，从其中获得EV并使用EV-Up™培养基比较它们的抗纤维化活性

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图2.  评估EV-Up™培养基中MSC来源EV的生成量和生物活性的结果

A）MSC在血清培养基中扩大培养后，培养基更换为去除EV、含FBS的DMEM或EV-Up™培养基。

A）对获得的培养上清液中提取的外泌体粒子数进行纳米粒子追踪分析后的检测结果

B）在抗纤维化评估中比较从A的各条件中获得的EV的生物活性的结果

◆特有的EV纯化技术、使用PS亲和法的EV纯化技术

敝司与现金泽大学医学部的華山教授合作，研究可应用于从EV生成后的培养上清中纯化EV的工序的技术，开发出了特有的EV纯化方法——PS亲和法5）。使用了本技术的研究用EV纯化试剂MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver. 2（产品编号：290-84103）现已上市。

PS亲和法是使用了与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine : PS）特异性结合的T 细胞免疫球蛋白结构域和含有粘蛋白结构域的蛋白4（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4, 简称Tim4）亲和纯化方法，同时作为一种优秀的纯化方法，它在MSC来源EV培养上清液中的回收率约有80%。已确认在in vitro的抗纤维化活性评估、抗炎症活性评估中，通过PS亲和法纯化的EV表现出优秀的生物活性6）（图3）。为了能够将此PS亲和法应用于EV制剂的生成，我们目前正在开发一种使用固定化Tim4蛋白质亲和柱的大规模纯化技术，公升级规模的培养上清液中的EV的亲和柱纯化将指日可待。

◆提高纯化后EV的保存稳定性的技术

由于纯化后的EV会吸附在管壁上，因此在处理时一般倾向于添加能够抑制EV的非特异性吸附的成分。我们向来非常重视EV的非特异性吸附这一问题，在处理EV时我们也推荐使用吸附抑制试剂——EV-Save™细胞外囊泡保存稳定剂 （产品编号：058-09261） 。经确认，此EV-Save™细胞外囊泡保存稳定剂不仅能抑制EV的吸附，还能使EV在冷冻保存时的稳定性得到提高（图4）。敝司十分重视提高EV制剂在生成时的EV吸附抑制和冷冻保存时的稳定性，为此开发了仅由已被用作医疗药品添加剂的成分组成的EV保存液（in vivo用EV-Save™ 细胞外囊泡保存稳定剂，产品编号：050-09461；图4）。目前本产品作为用于in vivo实验的研究用试剂进行销售，而由于使用了旨在用于医疗领域的成分，所以也十分推荐将其利用于EV制剂的研究开发。

第三回 富士胶片和光纯药助力利用细胞外囊泡的治疗方法的实现

图3.  使用PS亲和法进行MSC来源EV的纯化

A）基于PS亲和法的EV纯化研究用试剂 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver. 2。

B）PS亲和法、超速离心分离法分别纯化MSC来源EV后，使用ELISA对其回收率进行定量的结果。分别使用抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体检

B）测。图表为与培养上清液中的EV标记量的相对值。

B）使用的ELISA为PS Capture™ Exosome ELISA Kit（Streptavidin HRP）（产品编号：298-80601）。

C）定量PCR分析MSC来源EV对抑制TGFβ刺激纤维芽细胞诱导的纤维化相关基因表达上升的结果。

D）定量PCR分析MSC来源EV对抑制LPS刺激PBMC来源单核细胞诱导的炎症相关基因表达上升的结果。

UC：超速离心分离法；PS：PS亲和法

第三回 富士胶片和光纯药助力利用细胞外囊泡的治疗方法的实现

图4.  评估保存在样品管中的EV吸附损失的结果

A）向使用PS亲和法纯化的COLO201细胞来源EV中添加EV-Save™和in vivo用EV-Save™，冷冻保存16小时后，使用PS Capture™ Exosome ELISA Kit

A）（Streptavidin HRP）检测样品管内的EV标记物量的结果。

B）将添加了EV-Save™和in vivo用EV-Save™的COLO201细胞来源EV融冻1或3次，之后使用PS Capture™Exosome ELISA Kit（Streptavidin HRP）检

B）测样品管内的EV标记物量的结果。

◆可应用于EV的生产过程管理和质量管理的ELISA技术

在EV的治疗应用中，重要的不仅是EV的生产技术，还有质量管理技术的确立。其中，能够定性定量地分析EV标记物的技术在评估EV的质和量上也同样举足轻重。敝司开发了能够定性·定量分析EV标记物的ELISA产品，并以试剂盒的形式上市。使用针对EV标记物（CD9、CD63、CD81等）抗体的CD-Capture系列三明治法ELISA试剂盒，或是使用固定了Tim4的平板捕获EV后用针对任意EV标记物的抗体进行检测的PS Capture ELISA，都能够以符合目标的模式进行检测。以上方法在敝司的技术开发中也是十分有用的工具（用于图3 B、图4中的实验），因此也十分推荐将上述试剂盒用于EV生产过程中的监测和纯化EV的质量管理等方面。

 

◆结语

以MSC来源EV为中心的EV的治疗应用正备受期待，因此EV的制造技术和评估技术的优化和标准化也成为了一大课题。敝司至今将有关EV生成的一系列工序的技术以研究用试剂的形式推出上市，而今后将促进产品适配EV制剂的实际生产与质量管理部分，为实现EV治疗这一全新的疗法做出贡献。

◆参考文献

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