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第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

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第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

国立研究开发法人理化学研究所　脑神经科学研究中心　细胞功能探索技术研究小组

濱裕教授、星田哲志教授以及宮脇敦史教授共同执笔


第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

◆前言


固定组织的透明化技术将过去以二维为主体进行研究的组织学大幅扩展到三维层面上，使其获得全新视野。近年来，透明化技术不仅被应用于动物而且被应用到了植物的研究中，并且从基础生物学领域到其他医学领域方面，这项技术的应用范围也在逐渐扩大。

ScaleA2法[1]　和ScaleS法[2]（以下统称Scale法）都是作者团队开发的透明化技术。此外，作者团队还开发了AbScale法，这是一种与透明化技术相匹配的三维免疫染色法。上述两种方法配合使用可以获取小鼠全脑、大脑半球或厚脑切片内的精细结构。图1为实验图像。

第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

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第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

图1. 利用ScaleS法的透明化实验以及AbScale法的染色案例

ａ.　未处理的小鼠全脑（左）和透明化的小鼠全脑（右）。两者都取自固定的C57BL6/J雄性小鼠（13周）。

ｂ．从大脑表面到丘脑，用双光子激光器（直立型）显微镜观察（左下）透明化的YFP-H小鼠（14周，雄性）全脑（左上），再重建三维图像（VR）（右）。

ｃ.　使用Tomato lectin-texas red对已透明化处理的新生小鼠（C57BL6/J，出生后10.5天）大脑的冠状切片（1.2 mm厚）（左上）进行血管染色，利用直立共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察（左下）到的VR图像（右）。

ｄ.　此图是对阿尔茨海默病模型小鼠（(AppNL-F/NL-F，17个月，雄性）大脑的冠状切片进行Tomato lectin-texas red血管染色（图中蓝色部分），再用AbScale法免疫染色切片，并通过透明化后观察到的图像。染色时使用了红色荧光色素635结合Iba1多克隆抗体（FUJIFILM Wako 产品编号：013-26471，图中红色部分）和Alexa Fluor 488结合amyloid-β单抗（图中绿色部分）。用直立型CLSM观察皮质部分。左边是叠加10个浅黄色长方形区域的X-Y平面（Z-step =7 μm，对应右边的浅黄色长方形区域）获得的图像（max intensity projection）。右边表示2 mm高的角柱状观察区域的X-Z平面。比例尺分别为5 mm（a、b、c）和100 μm（d）

Scale法用到的试剂溶液都购自FUJIFILM Wako的SCALEVIEW系列试剂。作者将在下文中对透明化过程中用到的Scale试剂标记上对应的SCALEVIEW试剂名称。上述的ScaleA2法和ScaleS法分别使用了SCALEVIEW-A2及SCALEVIEW-S系列的试剂。使用这两种试剂进行透明化实验和三维染色的步骤请浏览FUJIFILM Wako官网，上面有相关内容的详细介绍。

本文围绕透明化技术的现状与基础，重点阐述Scale法。另外，还会像实验说明书一样，介绍显微镜观察透明化组织时的要点。

◆透明化技术的现状

透明化技术主要应用于神经科学领域。特别是在观察导入了荧光蛋白基因的神经细胞时，透明化技术能发挥巨大的作用。用导入了荧光蛋白基因的病毒（例如腺相关病毒（AAV））来感染大脑的特定区域，能标记特定的神经细胞。通过组织固定和透明化，利用显微镜可以观察目标神经细胞的轴突延伸程度。Economo[3] 和Ye研究团队[4] 在神经回路透明化分析方面表现出了浓厚的兴趣。

在过去的10年里，世界各国的研究人员开发并提出了多种透明化技术。所有这些透明化技术都有研究人员各自的特色。可以参考Tainaka（2016）[5] 和日置研究团队（2017）[6] 的技术文章，里面简单、系统地总结了这些特点。

最近备受关注的透明化技术应用是生物发光成像（BLI）技术与透明化技术的结合。首先，用病毒载体使荧光素酶基因和荧光蛋白基因在同一神经细胞中共表达，以生物发光信号进行非侵入性的实时检测。接下来通过观察检测固定好的透明化大脑中荧光蛋白信号，由此可以确认该神经活动来源于哪种细胞。尤其是本作者研究室开发的AkaBLI系统，灵敏度极高，即使体内只有一个标记细胞，也能追踪到它的信号[7]。BLI技术与透明化技术相结合的应用不仅限于神经科学领域，还能应用于癌症、免疫及干细胞的研究领域。

除了上述以in vivo为中心的研究外，透明化技术还有另一个值得关注的领域。就是在体外（in vitro）使用模拟球状体和类器官等组织的三维细胞培养研究。近年来，这些细胞团经常被用于药物筛选等实用性研究。应用透明化技术，能详细观察这种细胞团。在本文的最后，作者将举出一个神经球状体（Nsp）的例子来解释Scale法的应用。

 


◆Scale法进行透明化的基本原理


众所周知，大部分活组织都是混浊不透明的。这是由于组织的组成成分使光线发生散射而造成的。混浊的组织会对显微镜观察带来极大的不便。组成细胞膜的脂质、细胞外基质和结缔组织（如胶原纤维等）等物质都是造成光线散射的主要原因。为了尽量减少这种生物组织造成的光散射，大部分透明化技术都致力于用高浓度表面活性剂和有机溶剂主动去除组织中的脂质成分。

与上述方法不同， Scale法使用了以尿素为主要成分的试剂溶液。尿素是一种具有保水性的蛋白质变性剂。笔者利用尿素的这种性质来使组织亲水化（hydration），以达到减少光线散射的目的。换句话说，尿素在软化组成结缔组织纤维的同时还可使其注入水分，还能将水分运入细胞质膜的脂质分子之间，这就是Scale法进行透明化的基本原理。

作者在ScaleA2法之后又开发了ScaleS法（使用SCALEVIEW-S系列试剂的方法），使用的试剂溶液中除了尿素，还有一种叫做山梨糖醇的糖醇。山梨糖醇和尿素一样，都是具有高保水能力的物质。其协同尿素将水分配位到组织中，可以进一步减少组织的光散射。

用于ScaleS法的溶液含有低浓度的TritonX-100 [0.1-0.2 %(w/v)浓度]。在该浓度范围内，TritonX-100的脂质提取效果非常温和，对细胞膜的损伤也相对较小。用PBS(-)对已用ScaleS法透明化处理过的小鼠脑组织进行脱透明化，通过透射电子显微镜观察由同一组织制成的超薄切片来进行进一步的验证。结果显示，神经细胞质膜及兴奋性突触周围的超细微膜结构状态良好，确认了ScaleS法的作用温和[2] 。

 


◆观察Scale法透明化样品时的要点


“透明化组织的图像模糊不清”、“图像太暗”等都是观察透明化组织时会遇到的问题，可能使观察无法顺利进行。主要原因是研究人员对浸入样品的浸液（固定液）的折射率和物镜的相关信息了解得不够全面。

为了用共聚焦激光扫描显微镜或双光子激发荧光显微镜更好地观察有厚度的透明化组织的内部，我们需要特别注意物镜和组织、组织和固定溶液之间折射率的匹配。只要物镜和组织、组织和固定溶液之间的折射率存在差异（不匹配），组织内的焦点就会变得分散，在组织深层的方向（Z方向）上延伸形成模糊不清的图像，或者内部的图像过暗。

近年陆续开发出的透明化技术都倾向于使用SCALEVIEW-S试剂之类的高折射率（1.43～1.56）固定溶液。在Scale法中，固定溶液SCALEVIEW-S4（折射率1.47）或者能获得更高透明度的SCALEVIEW-SMt（折射率1.49）都能充分平衡透明化的组织。

也就是说，我们要注意固定溶液和物镜之间的折射率。观察的物镜最好要符合溶液的折射率。如果没有能匹配高折射率固定溶液的物镜，可尝试用SCALEVIEW-S4等试剂进行透明化后，再用SCALEVIEW-A2（折射率1.38）替代固定溶液，在37 ℃下平衡数小时，就能通过水浸物镜对组织1~2 mm的深度进行观察。但需要注意，用SCALEVIEW-A2替代SCALEVIEW-S4时，组织会轻微膨胀。详细信息将发布在Protocol Exchange中 [8]。

为了防止观察出现问题，必须提前收集要用到的固定溶液的特点和折射率等相关信息，了解物镜是否适用，以及镜片的工作距离，这些信息最好在进行观察前确认好。如果信息不明确，应联系各试剂和显微镜厂商，咨询观察样品适用的方法。以上内容对Scale法及其他透明化技术都通用。

 


◆Scale法在神经球中的应用


显微镜很难观察到固定的多细胞球状体的内部。多细胞球状体已形成细胞外基质，且细胞之间紧密堆积，导致中心部分的浊度特别高。为了观察细胞块的内部，过去通常需要用物理性切割制作出数十微米厚的切片，而透明化技术能有效解决制作小细胞块切片带来的麻烦和难度。FUJIFILM Wako官网介绍了染色、透明化成人海马来源的神经干细胞制备的神经细胞球状体（Nsp）的AbScale法的操作流程。本文将为大家介绍一种在该操作流程的基础上进行过优化的方法。

用4 %PFA/PBS(-)固定Nsp后，再使用SCALEVIEW试剂按照S0→A2→8M urea solution (要求是自制的) →A2的顺序进行前处理。除前处理外，后续所有液体的交换都要温和离心（500×g，15分钟，常温）Nsp的悬浮液，然后尽量吸出上清，再加入下一步的溶液。前处理的过程中，利用Nsp的膨胀可以提高细胞间的细胞外基质的柔软性。该过程不仅有助于对Nsp内抗体的渗透，还能促进染色后的Nsp的透明化。

接下来，透明化的Nsp在deScale中再次被还原。此过程具有为后续的免疫染色重新激活抗原性以及将膨胀的组织恢复到原来大小的双重意义。

在deScale之后进行封闭，然后通过使用荧光标记一抗的直接法，或在一抗后使用荧光标记二抗的间接法进行染色。间接法中二抗的反应时间、反应温度及清洗条件都要和一抗相同。接下来在染色后的再固定过程中要防止释放抗体发生反应。虽然多细胞球状体的尺寸较小，但能通过AbScale法的前处理使抗体充分渗透到内部。但是，一些抗体不易渗透，此时应尽量使用针对相同抗原的多种抗体进行检测。

下面介绍使用SCALEVIEW-A2试剂来透明化Nsp的新方法。由于SCALEVIEW-S4密度较高，容易使Nsp漂浮在液体中（简单地离心能沉淀出SCALEVIEW-A2溶液中的透明化Nsp），所以新方法不能使用SCALEVIEW-S4。

AbScale法进行染色、透明化、观察等一系列操作中，最需要注意的就是在用显微镜观察前的固定流程。作者将平时经常使用的琼脂糖固定流程总结在图2中。这个固定方法主要使用倒置显微镜，但观察时也可换成正置显微镜。


第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

图片的详细顺序如下。

①　加入75 µL 1.5%(w/v) 琼脂糖/ SCALEVIEW-S4溶液，温度已降

①　至37～40 ℃。

②　将神经细胞球（以下称为Nsp）和琼脂糖的悬浊液转移到盖玻

①　片上。然后用移液枪的枪头将凝胶平铺成薄薄的一层。

③　风干（10分钟，室温），使Nsp表面形成琼脂糖薄膜。

④　风干后加入1.5％(w/v)琼脂糖/ SCALEVIEW-S4溶液（温度已降

①　至37-40°C），覆盖黏贴盖玻片的孔（约110 µL），再次风干

①　（10分钟，室温）。接下来转入冰箱（4～8 ℃），使琼脂糖

①　凝固。

⑤　用少量速干粘合剂固定成点状（横跨凝胶和培养皿的底部）可

①　以防止琼脂糖脱落。让粘合剂充分凝固。

⑥　向培养皿中加入2 mL SCALEVIEW-S4或SCALEVIEW-A2，充

①　分摇匀并平衡（1~2小时，常温）。

⑦　镜头靠近盖玻片并观察Nsp。


（补充）

ⅰ）推荐使用表面有硅胶涂层的枪头和试管（避免Nsp附着在试管

ⅰ）壁上造成的损失）。

ⅱ）熔解1.5％(w/v)琼脂糖/ SCALEVIEW-S4溶液时，要放入微波炉

ⅰ）加热（500 W，4~5分钟），并混合均匀，避免气泡进入。然后

ⅰ）用水流将瓶子温度冷却至37~40°C。

ⅲ）在风干的条件下，Nsp也不能在30～40 分钟内干燥。


图2. 观察三维免疫染色后的神经细胞球的固定实例

用上述方法将AbScale法免疫染色和透明化的Nsp固定后，观察到的图像如图3所示。该实验例子在样品的固定溶液中加入SCALEVIEW-A2，再用配备了10倍空浸物镜的倒置显微镜进行观察。结果表明，这种方法能顺利观察到直径约500 µm的Nsp整体及内部。特别是位于Nsp中间位置的最大直径区域可以很好地观察到免疫染色图像以及碘化丙啶（propidium iodide）染色的核染色图像，表明抗体和荧光素已充分渗透了整个Nsp。


第一回 透明化技术Scale 的介绍和应用

图3. 三维免疫染色后的细胞球观察图像


a.用（冷藏）储存的成年大鼠海马来源神经干细胞配制细胞球（Nsp）。培养后第5天加入分化诱导剂，2天后再用AbScale法进行染色和透明化，最后按照图2的方法，用倒置显微镜观察固定后的细胞球。免疫染色使用了nestin（图中绿色)及doublecortin （图中红色）的对应抗体。另外，本实验在进行透明化及观察时的浸液中都使用了SCALCEVIEW-A2试剂。

a.-c.是添加了PBS(-)的Nsp对照图像，d.-f.是添加了分化诱导剂的Nsp图像。

a.和d.是用碘化丙啶（propidium iodide）对免疫染色的三维重建图像进行核染色（图中蓝色）（作者将荧光色素的染色称为ChemScale）。

c.和f.是Nsp最大直径区域X-Y的碘化丙啶（propidium iodide）图像。比例尺为100 µm（b、c、e、f）。

作者相信根据上述使用方法，Scale法和AbScale法将有助于观察和分析多细胞球状体。

 


◆结语


现在为了有效推动研究发展，透明化技术正处于包括观察在内等一系列实际应用的构建阶段。由此看来看，关于Boutin团队[9] 开发的Scale法高通量分析多细胞球状体的相关报告，提出了一个很有趣的Scale法应用实例。

Scale法和AbScale法不仅能用于小鼠，还能应用于人的正常组织及病理组织。作者期待更多科研组织的研究人员能够使用这种方法，并希望本文对大家有所帮助。此外，如果希望了解更多Scale法进行组织透明化的详细内容，大家可以参阅作者的其他技术文章[10.11] 。

 


◆参考文献


  [1]　Hama, H. et al. : Nat. Neurosci., 14, 1481-1488 (2011).

  [2]　Hama, H. et al. : Nat. Neurosci., 18, 1518-1529 (2015).

  [3]　Economo, M. N. et al. : eLife, 5, e10566 (2016).

  [4]　Ye, L. et al. : Cell, 165, 1776-1788 (2016).

  [5]　Tainaka, K. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 32, 713-741 (2016).

  [6]　日置寛之ら：「透明化技術の現状と今後の発展-ScaleS法に焦点を当てて」, 日薬理誌 149, 173-179 (2017).

  [7]　Iwano, S. et al. : Science, 359, 935-939 (2018).

  [8]　Hama, H. et al. : Protocol Exchange, doi : 10.1038/protex.2016.019 (2016).

  [9]　Boutin, M. E. et al. : Sci Rep., 8, 11135 (2018).

[10]　濱 裕ら：「組織の透明化技術」, 生体の科学, 68, 85-93 (2017).

[11]　濱 裕, 宮脇 敦史：「顕微鏡観察における組織透明化技術」, 生体の科学, 64, 595-601 (2013).

 


透明化技术 写在本系列前的话


在多方的配合协助下，“透明化技术”新信息的相关连载正式开始。借此机会对提供帮助的各位老师致以衷心的感谢！

活体组织的透明化技术能追溯到至今100多年以前，但日本近几年才兴起对透明化技术的研究。随着荧光蛋白观察和抗体观察的普及，显微镜技术不断革新的同时，透明化技术的开发也取得了长足的进展，研究人员可以按需选择合适的透明化技术。期待透明化技术能在生命科学研究中得到进一步的应用。

本系列将介绍更多活跃于透明化技术开发及应用研究领域的老师的研究成果。敬请期待！

第一回 神经性疼痛

发表于由

第一回 神经性疼痛


小胶质细胞研究前线~从基础到临床~

第一回 神经性疼痛

九州大学大学院药学研究院生活创新领域 津田诚

“小胶质细胞研究前线~从基础到临床~”系列的寄语

 

在发现小胶质细胞100周年之际，Wako举办了第35届Wako研讨会“小胶质细胞研究前线~从基础到临床~”（2019年11月）。此次作为和光纯药时报的系列文章，获得了连载“小胶质细胞研究前线”的好机会。神经胶质（glia；英文为glue），顾名思义神经胶质过去曾被认为是填充神经和神经之间间隙的胶状物质（neuroglia），但从最近的基础研究中，不断表明神经胶质是对神经活动有很大影响力的重要细胞。尤其是在现代医疗中，已明确了小胶质细胞在仍然难以克服的神经系统疾病中具有重要作用。因此以小胶质细胞为起点阐明疾病的机制并开发诊断和治疗方法的期望不断增高。在本系列中将邀请日本多位专业资深的老师来给我们分享有关在神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、癫痫、脑梗塞、精神疾病、慢性疼痛等中有重要作用的小胶质细胞的新知识以及展望。敬请期待。

 

◆前言

在对生物体施加有害刺激时，我们会利用痛觉系统产生疼痛并采取适当的防御措施。但是，晚期癌症或糖尿病、脑梗塞、脊髓损伤和带状疱疹治愈后，神经系统受损或受压迫引发功能障碍的话，就会发生被称为神经性疼痛的慢性疼痛。症状为自发性疼痛、痛觉过敏以及触觉刺激等一般不会引起疼痛的刺激引起的异常性疼痛。这些疼痛并不是单纯作为生物防御而不断产生的痛觉信号，比如像异常性疼痛那样的感觉方式本身发生了变化的症状，可能是由于体感信息传达系统的功能被破坏了。但是，在周围组织→初级传入神经→脊髓背角→大脑有关的神经传递系统中究竟是怎样的结构引起异常，其机制尚未阐明。在本文中，主要介绍小胶质细胞在脊髓和大脑中产生的痛觉传达异常中发挥的重要作用，并介绍由此产生的神经性疼痛机制以及今后的展望。

 

◆小胶质细胞

小胶质细胞是组成中枢神经系统的神经胶质细胞之一。成熟小胶质细胞存在于具有多个细小分支突起的小细胞体中（图1）。大脑小胶质细胞的生物成像分析表明，小胶质细胞经常活动其突起，以应答突触活动和细胞损伤等，在时空上拥有非常动态的活动性1）。从2010年以后开始的fate-mapping研究认为，小胶质细胞起源自存在于胚胎卵黄囊中的祖细胞，并通过血流移动至大脑并分化、成熟形成小胶质细胞2）。现在，小胶质细胞被分类为中枢神经系统的组织驻留巨噬细胞。为了维持成熟的小胶质细胞，自我更新的理论替代了以往的骨髓细胞供给理论。虽然详细情况还没有被阐明，但在细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）缺失3）、抑制剂治疗4）和白介素-34（IL-34）缺乏5）时，小胶质细胞数量会减少或消失，由此可以看出，这些都是维持的重要信号。

第一回 神经性疼痛

图1. 正常状态的小胶质细胞（脊髓背角）

 IBA1抗体免疫组织染色图像。比例尺：50 μm

 

◆脊髓背角小胶质细胞

在神经性疼痛的基础研究中，使用了周围神经直接损伤（主要是坐骨神经和腰椎神经）的动物模型。在1970年代，报道了由于切断坐骨神经从而激活了脊髓背角的小胶质细胞，之后在1990年代提出了神经性疼痛与小胶质细胞间的相关性，而在2003年首次明确了两者间的因果关系6）。此后，小胶质细胞作为神经性疼痛机制被全世界关注，至今为止小胶质细胞的研究仍然十分活跃。下文将概述至今为止已经阐明的分子细胞机制。

 

<小胶质细胞的激活机制>

由于周围神经损伤，脊髓背角的小胶质细胞显示出如细胞体肥大、突起收缩以及细胞数量急剧增加等剧烈的细胞应答7）。细胞数的增加与小胶质细胞自身的细胞分裂引起的自我增殖相关。其分子机制是在受损神经中，具有双亮氨酸拉链激酶（DLK）依赖性的CSF1表达增强，通过神经轴突转运至脊髓背角，作用于小胶质细胞的CSF1R，这一假设比较有说服力8,9）（图2）。另一方面，在与血脑屏障破坏相关的疾病模型的脑和脊髓中，观察到了外周血来源的单核细胞/巨噬细胞的浸润。在神经性疼痛模型中，虽然神经损伤后血液脊髓屏障的功能会暂时降低，但是未观察到外周血来源单核细胞在脊髓背角内的浸润10）。

第一回 神经性疼痛

图2. 脊髓背角的小胶质细胞激活和神经功能调节机制



受损后的原发传入神经表达的CSF1增强，与脊髓背角的小胶质细胞的CSF1受体作用，并伴随形态变化、细胞增殖和基因表达被激活。P2X4受体通过IRF8-IRF5转录因子级联表达增强。脊髓背角中间神经元释放的ATP刺激P2X4受体，从小胶质细胞释放体液因子。BDNF通过KCC2的表达降低来提高细胞内Cl– 的浓度，并将GABA和甘氨酸的作用转化为兴奋性。其神经兴奋，TNFα和IL-1β亢进了谷氨酸受体的功能，引起脊髓背角神经的过度兴奋，导致神经性疼痛。

<通过激活小胶质细胞的感觉传递调节机制>

激活的小胶质细胞在表观基因组水平上发生变化11），并通过细胞膜受体、细胞内磷酸酶和体液因子等各种基因表达功能性激活6）。作为代表性的分子，例如ATP等的细胞外核苷酸的受体（P2受体）。神经损伤后的脊髓中，离子通道型的P2X4和P2X7受体以及G蛋白偶联的P2Y12受体的表达主要在小胶质细胞中特异性增加，并且其功能和表达的阻碍明显抑制了了异常性疼痛6,12）。P2X4受体的表达增强是由于转录因子IRF8和IRF5的诱导13,14）。同受体被从脊髓背角中间神经元释放的ATP激活15），产生并释放大脑来源神经营养因子（BDNF）等的体液因子。这使向大脑传达疼痛信息的脊髓背角神经KCC2的表达降低，扰乱细胞内外的Cl－浓度梯度。将GABA和甘氨酸的作用转为兴奋性16），这还导致NMDA受体的激活，最终引起同一神经的异常兴奋（图２）6）。

小胶质细胞是大脑和脊髓中炎性细胞因子的主要产生细胞。IL-1β通过TREM2 / DAP12、toll样受体（TLR）和NLRP3炎症小体产生，亢进了脊髓背角神经中谷氨酸受体功能，并抑制了GABA受体和甘氨酸受体功能6）。TNFα在小胶质细胞中选择性表达，除了直接作用于脊髓背角神经外，还通过间接作用于星形胶质细胞和血管内皮细胞提高神经的兴奋性。此外，TNFα作用于小胶质细胞来提高BDNF的表达，增加疼痛传递神经的脊柱结构和突触连接17）。另外，小胶质细胞释放的血小板激活因子（PAF）形成刺激自分泌小胶质细胞的PAF受体并诱导PAF产生的正循环，与神经性疼痛相关18）。

 

◆大脑小胶质细胞

尽管与脊髓背角的小胶质细胞相比，形态变化并不大，但是周围神经损伤时在多个大脑部位被激活。在支配奖赏系统的腹侧被盖区激活的小胶质细胞与中脑边缘系统多巴胺能和奖赏系统的降低相关19）。海马小胶质细胞与CA1金字塔型脊柱密度、突触传递、BDNF表达水平以及记忆力降低有关17）。另一方面，在中央杏仁核中，外周血来源单核细胞/巨噬细胞在相对较晚的时期（神经损伤后4周）浸润，这与NMDA受体的磷酸化和焦虑行为有关20）。因此，笔者认为大脑中激活的小胶质细胞与神经性疼痛的情绪和记忆等相关。

 

◆治疗和诊断的发展

包含P2X4受体在内，已开发了多种靶向小胶质细胞表达分子的化合物和抗体，其有效性都在非临床测试中有报告6,21）。笔者期望它的有效性能在以神经性疼痛患者为对象的临床测试中显示出来。

人脑和脊髓中的小胶质细胞成像技术可以应用于药物发现、治疗和诊断。尽管小胶质细胞的活检非常困难，但是九州大学的加藤隆弘等人的研究小组发现，在纤维肌痛患者外周血中，从单核细胞分化出的小胶质细胞样细胞（iMG细胞）中发现了TNFα释放能高，这与疼痛相关22）。期望未来进一步的研究中，iMG可以应用于慢性疼痛的诊断和治疗。

 

◆结语

根据至今十几年间积累的大量研究结果表明，神经性疼痛的病发不仅是神经，也与伴随神经受损的脊髓背角和大脑激活的小胶质细胞有重要关系6）。另外，还有报告显示星形胶质细胞也参与神经性疼痛（请参考其他总论23））。迄今为止，神经胶质细胞一直被认为是仅支持神经的细胞，但这些研究表明，神经胶质细胞的活动对神经功能有极大的影响。根据神经性疼痛机制和中枢神经功能来看，神经和神经胶质间相互作用的观点很重要。另一方面，最近细胞分析显示的小胶质细胞的异质性在神经受损后如何崩溃，以及它对慢性疼痛拥有什么意义是完全未知的，这将是今后一个重要的课题。未来，通过阐明小胶质细胞亚群的作用以及与神经的相互作用，笔者相信可以开辟一条阐明神经性疼痛机制和开发治疗药物的重要途径。

 

◆参考文献

  1）Wake, H. et al. : Trends Neurosci., 36, 209 （2013）.

  2）Prinz, M. et al. : Cell, 179, 292 （2019）.

  3）Erblich, B. et al . : PLoS One , 6, e26317 （2011）.

  4）Elmore, M. R. et al. : Neuron, 82, 380 （2014）.

  5）Wang, Y. et al . : Nat. Immunol., 13, 753 （2012）.

  6）Inoue, K. and Tsuda, M. : Nat. Rev. Neurosci., 19, 138 （2018）.

  7）Kohno, K. et al. : Biol. Pharm. Bull., 41, 1096 （2018）.

  8）Guan, Z. et al. : Nat. Neurosci., 19, 94 （2016）.

  9）Wlaschin, J. J. et al. : Elife, 7, （2018）.

10）Tashima, R. et al. : Sci. Rep., 6, 23701 （2016）.

11）Denk, F. et al. : Cell Rep., 15, 1771 （2016）.

12）Tsuda, M. et al. : Nature, 424, 778 （2003）.

13）Masuda, T. et al. : Cell Rep., 1, 334 （2012）.

14）Masuda, T. et al. : Nat. Commun., 5, 3771 （2014）.

15）Masuda, T. et al. : Nat. Commun., 7, 12529 （2016）.

16）Coull, J. A. et al. : Nature, 438, 1017 （2005）.

17）Liu, Y. et al. : J. Neurosci., 37, 871 （2017）.

18）Shindou, H. et al. : Faseb J., 31, 2973 （2017）.

19）Taylor, A. M. et al. : J. Neurosci., 35, 8442 （2015）.

20）Sawada, A. et al. : Pain, 155, 1762 （2014）.

21）Williams, W. A. et al. : Pain, 160, 1989 （2019）.

22）Ohgidani, M. et al . : Sci. Rep., 7, 11882 （2017）.

23）Ji, R. R. et al. : Nat. Rev. Neurosci., 20, 667 （2019）.

◆产品列表

产品编号

产品名称

规格

包装

019-19741

Anti Iba1, Rabbit (for Immunocytochemistry)
小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体（免疫组化）

免疫化学用

50 μg

第一回 BDNF概论

发表于由

第一回 BDNF概论

阐明BDNF-从基础到临床-


第一回 BDNF概论




新潟大学　脑研究所肿瘤病态学　武井延之


第一回 BDNF概论


“阐明BDNF-从基础到临床-”系列连载开始之际

金沢工业大学　生物・化学部　应用生物学科　小岛正己   


1950年代，Rita Levi-Montalcini博士和Stanley Cohen博士及其研究人员开始了神经营养因子研究。继他们发现NGF（nerve growth factor）

后，Yves-Alain Barde 发现了BDNF（brain-derived neurotrophic factor）。BDNF和NGF具有高度同源性，并且还有相同的生物活性。由于

BDNF在中枢神经系统中高表达，所以关于它与记忆学习以及大脑疾病间关系的研究盛行。因此，为了更好地阐明BDNF，除了BDNF的检测技术

外，BDNF信号的分析技术也非常重要。

本系列连载会先介绍BDNF和神经营养因子的研究。关于BDNF与大脑和发育以及精神疾病间的关系，将由日本新进研究人员们对其现状和展望进行

充分地阐述，敬请期待。

 

◆前言


对BDNF研究已从最初的研究“经典”，维持神经细胞的生存和分化诱导发展为神经传递和控制突触可塑性等新机制的研究。与此同时，由于其与疾病的关系，研究人员开始将BDNF用于治疗伴随细胞死亡的神经退行性疾病，并逐渐关注治疗神经功能障碍（神经回路形成异常）的精神疾病和发育障碍的研究。图1所示为BDNF研究随时代的发展与变化，本文将主要阐述BDNF的概论。

第一回 BDNF概论

图1：BDNF（神经营养因子）研究的历史和发展趋势

◆BDNF和受体关系


BDNF（Brain-Derived Neurotrophic Factor : 脑源性神经营养因子）是大脑中最重要的神经营养因子。神经营养因子（neurotrophic factor）是具有维持神经细胞生存、分化诱导（突触延伸和神经递质合成酶表达诱导等）、促进成熟和调节功能等作用的蛋白分子的总称，NGF（Nerve Growth Factor : 神经生长因子）的发现和鉴定的研究从Levi-Montalcini开始，但由于NGF只能在特定的神经细胞中发挥作用，所以研究人员认为应该还存在与其作用相同的分子。

1982年，Barde和Thoenen从猪脑中纯化了BDNF1）。随后，1983年和1989年分别对NGF和BDNF克隆2）后发现，这两个分子的同源性超过50%。利用该同源域，克隆了第三个因子NT-3，之后，NT-4被鉴定为第四个因子。NT为neurotrophic的缩写，统称为neurotrophin family。

BDNF由preproBDNF加工成matureBDNF（ 即BDNF）。BDNF由112个氨基酸残基组成，分子量为13.5 kDa，等电点为9.99，与NGF相同，具有3个S-S键。从NGF的晶体结构分析，推断BDNF具有三个扁平的β片层，并通过它们形成具有生理功能的同源二聚体。研究认为，家族之间的非保守域决定了与受体的特异性结合3）。

从NGF结合实验的结果来看，受体有低亲和性和高亲和性2种，低亲和性受体鉴定为p75（p75NTR）。该分子与所有的neurotrophin低亲和性（Kd=10-9）结合。它属于TNF受体家族，参与细胞凋亡，并作为与neurotrophin前体作用的受体备受关注。1991年，高亲和性（Kd＝10-11）受体鉴定为Trk（Tropomyosin Receptor Kinase，原肌球蛋白受体激酶），最初被鉴定为在癌症中发现的trk原癌基因的基因产物，但其配体未知。

Trk有A、B、C三种，TrkA（基因名 NTRK1）是NGF的特异性受体，TrkB（NTRK2）是BDNF和NT-4的特异性受体，TrkC（NTRK3）是NT-3的特异性受体。

TrkA、TrkB、TrkC均由约800个氨基酸组成，经过糖基化成为分子量140-145 kDa的功能性分子。它是一种在细胞内具有激酶结构域的受体酪氨酸激酶。当二聚体配体结合时，Trk自身也会二聚体化，并相互磷酸化细胞的酪氨酸残基。该磷酸化酪氨酸与各种分子相结合，并通过传递细胞内信号来发挥以BDNF为首的neurotrophin生理活性4）。细胞内的主要信号系统与受体型酪氨酸激酶相通，具有1）控制细胞凋亡和翻译的PI3K-Akt系统；2）主要通过转录调节发挥分化诱导作用的Ras-MAPK系统；3）驱动细胞内钙信号的PLCγ-Ca2+系统5）。

 


◆BDNF的生理作用


BNDF研究初期主要围绕在外周神经系统中的作用，NGF是交感神经背根神经节的一部分。研究发现BDNF作用于结节神经节和部分背根神经节的感觉神经中彼此不重叠的神经细胞。针对外周神经系统的neurotrophin作用是绝对的，对于维持生存和突起延伸也是必不可少的，所以，外周神经衰竭会导致各敲除小鼠死亡。因此，神经细胞的维持生存和突起延伸作用被称为神经营养因子的“经典作用”。

随后，研究的中心转移至中枢神经系统，研究表明，NGF作用于基底神经节的乙酰胆碱活性神经细胞，BDNF作用于黑质多巴胺能神经细胞和脊髓运动神经细胞。这些作用都是经典作用，据报告还有诱导各神经递质的合成酶的表达，增加递质数量和维持生存等作用。NGF和TrkA的表达仅限于大脑内的部分细胞，但是BDNF，尤其是TrkB的表达在大脑中的大范围（几乎所有）的神经细胞中都有发现。因此，BDNF对中枢神经细胞的作用得到了更广泛的研究，此外，研究表明除了经典作用的维持生存和分化诱导以外，它还参与依赖于神经活动的神经可塑性。

神经可塑性是指通过释放递质和控制受体功能来改变传递效率以及突触重塑等，导致特定的神经回路发生强化或消除的可逆性变化。无需形态的变化，通过调节转录、翻译和分解来改变作用于突触中的分子数量（特定的分子数和分子类型）、翻译后的修饰（磷酸化等）以及位置的变化（易位）等。对于中枢神经细胞，BDNF可以诱发和增强神经递质的释放，以及增强受体的功能。此外，研究人员认为它还可以长期作用于形成和稳定神经回路。结果表明，它还参与了记忆学习等6,7）。

 


◆BDNF的表达和释放


BDNF的表达与神经活动密切相关。使用谷氨酸刺激原代培养神经细胞会诱导 BDNF mRNA 的表达，而GABA 刺激会降低表达 8）。BDNF在生理条件下会在神经细胞中表达，通过兴奋性神经传递升高，抑制性神经传递降低。BDNF的表达可以诱导被认为是记忆细胞基础的长时程增强（LTP）。在个体水平中，也能在视觉皮层中观察到依赖于感觉（视觉）输入的BDNF mRNA 表达水平的变化。此外，学习训练过程引起大鼠和猴子大脑中BDNF表达上升，阐明了通过激活神经回路诱导的活动依赖性表达9）。

不仅仅是表达调节，BDNF的释放也依赖于神经活动。在经典作用中，不仅BDNF，神经营养因子也是组成型分泌的。这是因为在维持生存中始终保持定量供给才是合理的。但是，为了引起参与神经传递的快速反应，需要调节性释放。实际上，BDNF是通过响应去极化刺激进行释放的。通过外周神经系统的NGF作用形态分析，研究人员认为BDNF的作用方式，是通过轴突投射到的靶细胞产生和分泌的，然后神经细胞向轴突方向延伸。但是，BDNF包含在突触前方的囊泡中，与递质相同会响应刺激进行释放。像这样的表达和释放机制可以支持其参与神经可塑性，由此表明，神经活动和BDNF是相互作用的。

 


◆BDNF和疾病


研究人员尝试使用神经营养因子的维持生存作用对神经退行性疾病进行治疗。虽然该作用在培养细胞和动物实验中非常有效，但是在治疗中还没有成功10）。首先是关于分子量的问题，由于BDNF是蛋白，所以无法通过血脑屏障。虽然也有小分子激动剂的开发，但其作用还有待证实。另一方面，由于BDNF直接参与神经功能，所以如本文所述，它在功能性脑疾病的精神疾病和发育障碍中的作用备受关注。虽然由于上述的理由无法直接用于治疗，但还是有望作为生物标记物发挥作用，并开发出模拟BDNF作用的试剂。

BDNF 还具有中枢拒食作用 11)，并且出于某种原因，它在血小板中含量丰富，还能调节性释放。因此，有报告称它还参与肥胖、糖尿病（生活方式疾病）和心血管疾病等，阐明BDNF的非中枢性作用相关的研究还在进一步扩大12）。

◆参考文献

 1. 

B arde, Y. A. et al. : EMBO. J., 1, 549 (1982).

 2. 

L eibrock, J. et al. : Nature, 14, 341149 (1989).

 3.

Lewin, G. R. and Barde, Y. A. : Annu. Rev. Neurosci., 19, 289 (1996).

 4.

武井延之：脳科学辞典（2020）．https://bsd.neuroinf.jp/wiki/高親和性ニューロトロフィン受容体，DOI：10.14931/bsd.9306（2021年6月21日閲覧）

 5.

Huang, E. J. and Reichardt, L. F. : Annu. Rev. Biochem., 72, 609 (2003).

 6.

Thoenen, H. : Prog. Brain. Res., 128, 183 (2000).

 7.

武井延之、那波宏之：生化学，76，111（2004）.

 8.

Lindholm, D. et al. : J. Neurobiol., 25, 1362 (1994).

 9.

Nawa, H. and Takei, N. : Trends Neurosci., 24 (12), 683 (2001).

10.

Thoenen, H. and Sendtner, M. : Nat. Neurosci., 1046 (2002).

11. 

Takei, N. et al. : Front Psychol., 5, 1093 (2014).

12. 

Marosi, K. and Mattson, M. P. : Trends. Endocrinol. Metab., 25, 89 (2014).

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第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

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第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

干细胞EV~治疗、诊断、化妆品未来发展~

第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法




新潟大学大学院 医齿学综合研究科 消化器内科学领域 寺井崇二、土屋淳纪

◆再生细胞治疗的开发现况

2003年，山口大学开始了世界首个应用 "自体骨髓细胞给药疗法 "治疗肝硬化的临床研究（于2003年11月14日开始临床研究）1-4）。通过基础和临床研究表明，自体骨髓细胞移植治疗可以改善肝硬化的肝纤维化，并诱导肝硬化的肝再生。自2017年以来，有企业使用异体脂肪组织来源间充质肝细胞移植疗法来治疗失代偿期肝硬化（企业临床试验），并且目前也在进行由医生主导的失代偿期肝硬化的临床测试（图1）。

第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

图1.

◆改善肝纤维化，对再生诱导起作用的细胞

2015年，新潟大学展开了旨在阐明骨髓中的有效细胞、改善肝纤维化和再生诱导机制、和以运用异体间充质干细胞为目标的研究。研究的结果表明，作为肝硬化模型治疗效果的表现机制，从外周移植的间充质干细胞主要迁移至肺部，作为 "指挥细胞"发挥作用。通过使巨噬细胞进入抗炎状态，诱导它们进入肝硬化区，可以诱导抗炎性巨噬细胞作为 "工作细胞"改善肝硬化导致的纤维化和再生（图2）5-8）。另外，我们还着眼于肺部存在的间充质干细胞与作为工作细胞的巨噬细胞的连接分子细胞外囊泡（exosomes），并进行分析。研究发现，间充质干细胞分泌的外泌体，特别是干扰素-γ刺激的间充质干细胞，可将巨噬细胞转变为抗炎性巨噬细胞，改善肝纤维化并诱导肝再生9）。此外，仅将这些外泌体施用于肝硬化模型中，就能改善肝纤维化并诱导肝再生（图3）。

第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

图2. 



第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

笔者改自：npj Regenerative Medicine volume 6, Article number:19(2021)

第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

图3. 

◆临床治疗面临的挑战


为使用细胞外囊泡（exosomes）进行治疗，作为日本再生医疗学会的“外泌体等调整，治疗相关的WG委员“，目前准备开发运用新一代外泌体的治疗法。虽然已公开发表各类指南，但过去所开发的间充质干细胞等的培养过程，都建立在安全性的基础上。另外，在建立临床概念验证Proof of Concept（POC）方面，如何规定细胞外囊泡的数量和质量（内部蛋白、miRNA）也非常重要。目前已在耳鼻科领域实施First in man疗法10）。图4是将来细胞外囊泡（exosomes）的治疗蓝图。期望将来制备出能生产诱导细胞组织修复的外泌体的设计细胞，并从中获得大量外泌体，最终以细胞移植或外泌体给药于细胞的方式来进行细胞治疗。


第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

图4. 



◆相关产品

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◆参考文献


 1. 

Terai, S., Ishikawa, T., Omori, K., Aoyama,K., Marumoto, Y., Urata, Y., Yokoyama, Y.,Uchida, K., Yamasaki, T., Fujii, Y., Okita, K.and Sakaida, I. : Stem Cells , 24（10）, 2292（2006）.

 2.

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 6.

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Watanabe, Y., Tsuchiya, A., Seino, S.,Kawata, Y., Kojima, Y., Ikarashi, S., Lewis,P. J. S, Lu, W. Y., Kikuta, J., Kawai, H.,Yamagiwa, S., Forbes, S. J., Ishii, M. andTerai, S. : Stem Cells Transl. Med ., 8 （3）,271（2019）.

 8.

Tsuchiya, A., Takeuchi, S., Watanabe, T.,Yoshida, T., Nojiri, S., Ogawa, M. and Terai S. :Infl amm. Regen ., 39, 18（2019）.

 9.

Takeuchi, S., Tsuchiya, A., Iwasawa, T.,Nojiri, S., Watanabe, T., Ogawa, M., Yoshida, T.,Fujiki, K., Koui, Y., Kido, T., Yoshioka, Y.,Fujita, M., Kikuta, J., Itoh, T., Takamura, M.,Shirahige, K., Ishii, M., Ochiya, T., Miyajima, A.and Terai, S. : NPJ Regen. Med ., 6 （1）, 19 （2021）.

10.

Warnecke, A., Prenzler, N., Harre, J., Köhl, U.,Gärtner, L., Lenarz, T., Laner-Plamberger, S.,Wietzorrek, G., Staecker, H., Lassacher, T.,Hollerweger, J., Gimona, M. and Rohde, E. :J. Extracell. Vesicles , 10（8）, e12094（2021）.