成功研发高纯度完整外泌体的提取新方法
—期待革新癌症等疾病的早期诊断及治疗效果的判断—
2016年9月23日
国立大学法人大阪大学
国立研究开发法人日本医疗研究开发机构
◆研究成果的要点
● 研发出提取高纯度完整细胞外囊泡和外泌体的新方法。
● 外泌体发挥作为癌细胞等患病细胞的生物标记物（注1）的作用，但用现有的提取法获得的外泌体
纯度较低，作为生物标记物不可靠。
● 运用本研究成果提取高纯度外泌体的日本产试剂盒已在市面销售。
◆概要
大阪大学免疫学前沿研究中心的华山力成特聘教授（金泽大学医学系免疫学教授）、中井涉特任研究员以及和光纯药工业株式会社的研究团队，成功研发出简便且重复性高的外泌体高纯度提取法（图）。
用该方法提取的外泌体可用于确定此前外泌体上无法鉴定的蛋白或RNA，期待能够为以癌症为首的各种疾病的早期诊断及治疗效果的判断带来革新。
本研究成果在线刊登于英国的科学杂志《Scientific Reports》（日本时间9月23日18点）。
◆研究背景
外泌体是由各种细胞释放出的直径为30~100nm的细胞外囊泡。最近有报告显示，外泌体中含有的蛋白或RNA能发挥作为癌细胞等患病细胞生物标记物（注1）的作用，与疾病的早期诊断及治疗效果的判断关系密切。
但是，用现有的提取法获得的外泌体含有较多杂质，用作生物标记物的可信度较低。
图.使用Tim4磁珠的新型外泌体提取法
◆本研究的内容
华山特聘教授的研究团队在标靶细胞中发现了一种称为Tim4的膜蛋白的外泌体特异性受体。然后制作出可令Tim4的细胞外区域与磁珠结合的“Tim4磁珠”，建立并补充了细胞培养基及体液中外泌体的分离方法（图）。利用Tim4磁珠亲和法可捕获高纯度的人白血病细胞释放的外泌体，其回收纯度比以往的提取方法高10~100倍以上。
◆本研究成果对社会的影响（本研究成果的意义）
今后，利用本技术提取的外泌体除了用作癌症的生物标记物，还可用于免疫系统、循环器官系统、脑神经系统、内分泌系统等各种疾病的生物标记物的鉴定和分析。
此外，本技术无需使用超速离心机（注2）等昂贵设备，操作简便可在大部分临床检测现场使用。期待这项技术今后可应用在各种疾病的早期诊断、治疗效果的判断及预后预测中。
和光纯药工业株式会社根据该项技术开发生产的试剂盒MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS已在世界各地开始销售。
◆特别事项
本研究成果在线刊登于英国的科学杂志《Scientific Reports》（日本时间9月23日18点）。
作者：WataruNakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez, Yuji Miyatake, Takahiro Nishibu, Naoko Imawaka, Ken Naruse,
YoshifusaSadamura and RikinariHanayama.
题目：A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles.
本研究包含在国立研究开发法人日本医疗研究开发机构（AMED）的“创新癌症医疗实用化研究业务”中，是研究开发课题“通过高纯度外泌体提取法鉴定新的肿瘤标记”（研究开发代表者：华山力成）的一部分研究成果。此外，大阪大学免疫学前沿研究中心（IFReC）是被日本文部科学省的“世界顶级研究基地计划（WPI）”选定的机构，是以用科学的力量引领世界为目标的研究中心。
◆研究内容的详细说明
研究背景
外泌体是各种细胞释放出的直径为30~100nm的细胞外囊泡，它作为一种在分泌细胞与标靶细胞间交换脂质、蛋白质、RNA等的新载体而备受瞩目。最近有报告发现，组成外泌体的分子（特别是蛋白质和RNA）能作为癌细胞等患病细胞的生物标记物（注1），而且与疾病的早期诊断、治疗效果的判断及预后预测关系密切。例如，恶性黑色素瘤细胞释放出的外泌体中含有高浓度的TYRP2、VLA-4、MET等蛋白，能用作预测肿瘤转移可能性或发展情况的标记物（Nat Med.18:881-891(2012)）。另外，外泌体中含有大量来源于分泌细胞的mRNA或non-coding RNA，只需微量的样本就能用PCR法进行扩增，作为划时代的生物标记物可广泛用于和疾病相关性及特异性的研究中（BiochimBiophys Acta.1806(2):200-207(2010)）。
现时主要使用超速离心法（注2）或PEG沉淀法（注3）提取外泌体，但此类方法提取出的外泌体含有较多杂质，用作生物标记物不可靠。超速离心法存在很多弊端，不仅操作复杂回收量不稳定，无法进行定量分析，还需要购买昂贵的超速离心机，无法同时进行多个测量样本的分析。以上情况限制了外泌体作为生物标记物的使用，所以人们希望研发出一种能简便提取高纯度外泌体的技术。
◆本研究成果的内容
我们在标靶细胞中发现了一种叫Tim4的膜蛋白的外泌体特异性受体。发现Tim4的细胞是通过Tim4的细胞外区域的IgV结构域，在钙离子存在的情况下强力结合外泌体膜表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后将外泌体吸收到细胞中。因此，我们制作出可令Tim4细胞外区域和磁珠结合的“Tim4磁珠”。Tim4依赖钙离子结合外泌体表面的PS，所以能用含有螯合剂（注4）EDTA的洗脱缓冲液（注5）高效地洗脱并提取出高纯度的外泌体（图1）。
实际上，比较用Tim4磁珠法提取人白血病细胞释放出的外泌体和用超速离心法或PEG沉淀法提取的外泌体的纯度时，Tim4磁珠法能以良好的重复性回收高纯度的外泌体，比其他方法提取的外泌体纯度高10~100倍以上（图2）。这样，就能确定大多数之前无法鉴定的外泌体上的蛋白质和RNA。从上述的结果可知Tim4磁珠法是有效的，并成功地研发出了简便且能提取高纯度外泌体的方法。
图1.使用Tim4磁珠的外泌体提取法
Tim4磁珠依赖钙离子与外泌体膜表面的磷酯酰丝氨酸结合。通过使用EDTA螯合钙离子，能解离亲和了Tim4磁珠的外泌体。
图2.各种外泌体提取法的纯度比较
Tim4磁珠法与超速离心法及PEG沉淀法相比，不仅能强力检测出外泌体特异性蛋白（左），而且几乎不会混入外泌体以外的杂质（右）。
◆本研究成果对社会的影响（本研究成果的意义）
近年，有关外泌体的研究进展迅速，但事实上我们并不知道，在研究中使用超速离心法或PEG沉淀法提取的低纯度外泌体是否能发挥其原有的作用。期待这次我们研发的外泌体高纯度提取技术能够成为改变外泌体研究方法的革新分析技术。今后，利用本技术提取出的外泌体不仅用作癌症的生物标记物，还能用作鉴定和分析免疫系统、循环器官系统、脑神经系统、内分泌系统等各种疾病的生物标记物。此外，本技术无需使用超速离心机等昂贵设备，简便的操作可在大部分临床检查现场使用。期待今后这项技术可应用在各种疾病的早期诊断、治疗效果的判断及预后预测中。和光纯药工业株式会社根据该项技术开发生产的试剂盒MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS已在世界各地开始进行销售。
◆术语说明
（注1）：生物标记物
血液或尿液、脊髓液等体液中含有的蛋白质或RNA等物质，其浓度可作为特定的疾病存在或进展情况的相关指标。
（注2）：超速离心法
使用超速离心机对样本施加强大的离心力从而分离样本成分的方法。
（注3）：PEG沉淀法
使用聚乙二醇（PEG）从试剂中沉淀出高分子的方法。
（注4）：螯合剂
结合金属离子，阻止金属离子作用的物质。
（注5）：洗脱缓冲液
解离特定的物质之间结合的溶液。
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