腺相关病毒定量——Cell Biolabs的AAV滴度滴定及定量试剂盒

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)作为基因治疗的载体存在一些非常突出的优点,比如能感染分裂和非分裂细胞、不具有明显的致病性、整合至宿主特定染色体长期表达目的蛋白等,已成为基因治疗被广泛应用的安全、有效的载体。腺相关病毒定量——Cell Biolabs的AAV滴度滴定及定量试剂盒

在腺相关病毒的应用过程中,我们经常需要获得病毒液的病毒含量或者腺相关病毒的滴度数据。传统的方案是使用DNA点杂交或其他类似方法来测量腺相关病毒感染滴度,但是这种传统的方法实验周期较长,操作繁琐。对于已获得了高纯度AAV颗粒的检测,使用OD260nm处光吸收度数值来衡量AAV的病毒颗粒含量不失为一种更便捷的方案,遗憾的是,这种方法不适用于未纯化的病毒颗粒,因为其它的杂质会干扰260nm处的吸收度。另外,采用免疫学的办法,使用与AAV病毒颗粒结合的抗体来检测腺相关病毒含量也有被使用,但是很显然,这种方法将会检测所有AAV病毒,包括不含有基因组DNA的包装颗粒。

Cell Biolabs的QuickTiter™ AAV Quantitation Kit试剂盒(目录号:VPK-145)很好的解决了上述问题,该试剂盒包括试剂A、试剂B、捕获Matrix、洗脱液、溶液C、Dye染料以及AAV DNA标准物。本腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺病毒DNA含量来测定其病毒含量。

该腺相关病毒定量试剂盒的工作步骤是首先降解悬液里的核酸成分,然后使用Matrix胶有效结合腺相关病毒颗粒,从而分离出杂质蛋白及蛋白复合物,洗脱下AAV颗粒后进行变性,随后用染料对核酸进行染色。

由于采用了专利技术的捕获Matrix胶,不但能专一性的结合腺相关病毒颗粒,因此能有效的提高检测效度;而且可以用于未纯化的AAV病毒液,因此可定量已经纯化的AAV病毒以及未纯化的AAV病毒。经过相关步骤后,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照AAV DNA标准曲线得出AAV滴度。该试剂盒检测灵敏,对于已经纯化的AAV DNA,可以在2小时内获得数据,可检测1×109GC/ml的AAV;对于未纯化的DNA,需要使用Kit提供的提纯试剂纯化再测量,大概在3-4小时左右完成,可检出5×1010GC/ml腺相关病毒。该试剂盒能从无辅助病毒的AAV病毒液内完成20次检测。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ AAV Quantitaiton Kit VPK-145 荧光检测,20次分析

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供高效简便的重组腺相关病毒相关产品和服务,产品包括腺相关病毒的纯化、定量和高效转染试剂。ViraBind™腺相关病毒纯化试剂盒采用特殊的纯化Matrix技术,无需超速离心,在大大减少试验时间的同时还保证了AAV的纯度。QuickTiter™腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺相关病毒DNA含量来测定其病毒含量,只需2小时。ViraDuction™腺相关病毒转导试剂能极大的增加腺相关病毒在多种细胞内的转导效率,包括传统转染方法转导效率低的非分裂细胞,如原代培养细胞和干细胞。如果您对腺相关病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺相关病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

ViraSafe™ 慢病毒表达系统——Cell BioLabs慢病毒表达载体

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合持久表达、免疫反应小等优点。市场上的慢病毒是由人类免疫缺陷病毒(HIV),通过去除env、vif、vpr、vpu等毒性基因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒G糖蛋白来代替HIV-1的包膜进行包装,从而更安全,宿主范围更广,还能增加病毒的滴度。

慢病毒载体的发展经历了3个阶段:第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转绿和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离,分别构建在三个独立的质粒表达系统上,即包装质粒(一个强启动子如CMV作用下,控制除env以外所有病毒结构基因的表达)、包膜质粒(包含VSV-G基因)和载体质粒(包含目的基因),用这三种质粒共同转染包装细胞如人胚肾293T细胞,在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第二代慢病毒载体系统从安全性角度又删去了HIV的所有附属基因。第三代慢病毒载体又进一步做了些安全方面的改进,如删除了U3区的3′LTR和tat基因。

ViraSafe™ 慢病毒表达系统——Cell BioLabs慢病毒表达载体

安全性始终是大家关心的问题,毕竟是HIV改造过来的,不容许有一点闪失。国内的实验室很多都达不到P2的级别,甚至是一堆人挤在一个房间里做各种各样的实验。Cell BioLabs的新一代慢病毒表达系统对广泛应用的第三代慢病毒进行了改进,将Rev与gag和pol基因分离,这意味着要产生原始的病毒,还需要更多的重组步骤。这样完整的ViraSafe™ 慢病毒表达系统包含5个载体(包括一个对照载体),安全性更高。

慢病毒的表达流程一般如下:将目的基因片段克隆到表达载体上;将重组表达载体,与包装混合物(通常是几个质粒的混合物)共转染293细胞;收集病毒上清,测定滴度;感染目的细胞,瞬时表达目的蛋白或用抗生素筛选稳定细胞株;分析目的蛋白。看上去并不复杂,但中间许多步骤需要不断优化。而且慢病毒有一个软肋,就是病毒滴度不高。你可能还需要纯化或浓缩,才能得到108TU/ml的慢病毒。

与目前市场上流行的新一代慢病毒相比,ViraSafe™ 慢病毒表达系统进行了进一步的优化。如在载体质粒上插入了cPPT(增加基因表达水平)及WPRE(增加感染滴度),在一个包装载体中插入腺病毒VA基因以增加感染滴度;同时在整个系统载体的多个部分做了一些基因的优化或删减和插入以增加病毒的安全性。经过这样的优化,ViraSafe™ 最新一代慢病毒表达系统的包装容量增大到10kb,在应用上更广泛;其感染细胞的滴度及外源基因的表达水平均提高,这也在一定程度上弥补了慢病毒在基因治疗领域内的不足;由于对整个慢病毒系统的多层面改造,降低了载体间的同源率和重组机率,更安全。如果您的实验需要长期稳定的基因表达或沉默,而目的细胞又很难转染,那ViraSafe™ 慢病毒表达系统将是您的最理想选择。

产品名称 货号 产品说明
ViraSafe™ Universal Lentiviral Expression System VPK-211-ECO 通用慢病毒表达系统,MCS位点前无启动子,克隆时可插入特异性启动子序列,分双嗜和多嗜两种
VPK-211-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Puro) VPK-212-ECO EF-1α真核细胞启动子类型,带有Puro抗性筛选标记,分双嗜和多嗜两种
VPK-212-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Neo) VPK-213-ECO EF-1α真核细胞启动子类型,带有Neo抗性筛选标记,分双嗜和多嗜两种
VPK-213-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Hygro) VPK-214-ECO EF-1α真核细胞启动子类型,带有Hygro抗性筛选标记,分双嗜和多嗜两种
VPK-214-PAN

另外,根据您实验的不同需求,ViraSafe™ 设计出不同的启动子类型供您选择。有不含有启动子的通用型慢病毒表达载体,您可以用来表达特异性启动子引导的基因;还有真核基因强力启动子CMV启动子类型以及用于表达shRNA的RNAi以及miRNA的启动子供您选择。

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe™ 慢病毒表达系统有多种样式供您选择;专门针对慢病毒滴度低的软肋而专门设计的ViraBind™慢病毒浓缩&纯化试剂盒,能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒;还有多种慢病毒快速定量以及感染滴度滴定检测方案;Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞,也可感染非分裂细胞,如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等,还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点,是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中,由于加入了GFP标记蛋白,因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度,病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外,还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便,且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示,首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解,然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒,从而分离出蛋白核酸复合物,洗脱下慢病毒后进一步降解,然后标记其病毒核酸,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液,定量步骤快捷,可以在45-60min内获得数据。检测灵敏,可以从100ul慢病毒上清中检测出1010VP/ml的慢病毒,足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit VPK-112 荧光法检测,20次分析

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择;多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案;ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒,解决了慢病毒低滴度的软肋;Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。