外泌体和生命现象——第二回 外泌体蛋白质组解析

公益基金会癌症研究小组 植田 幸嗣

　　外泌体是一种微分泌囊泡。它是细胞内囊泡转运的产物之一，具有将不需要的分子释放出细胞外、并将内含分子运输和传递到远端细胞的功能。通常，外泌体具有直径为几十至一百纳米的脂质双分子层结构，与细胞结构成分相比，特定蛋白质组（四次跨膜蛋白超家族，Rab家族，Tsg101，Alix等）和miRNA的含量特别多。然而，有研究结果指出，通过细分粒径进行组学分析时，发现特定粒径的分子结构明显不同^1），所以如今外泌体的分子生物学定义仍未明确。事实上，有不少报道认为通过使用各种不同的外泌体提取方法（使用提取纯度不同的外泌体样本）进行的功能分析实验发现，外泌体参与癌症转移、肿瘤浸润、血管新生、免疫细胞调节等现象。

　　另一方面， "从释放到外周血等体液中的、来自致病细胞的外泌体中，可以读取致病细胞的分子谱"这一点已被证实了。以诊断为目的外泌体应用已经商业化。例如，在CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证的实验室开发的，通过尿液中的外泌体同时检测前列腺癌特异性PCA3非编码RNA，ERG mRNA，SPDEF mRNA的测试（ExoDx^® Prostate IntelliScore），并且可以作为LDT（Laboratory Developed Tests：实验室内部研发、验证、使用的体外诊断测试）进行国际委托技术服务^2）。此外，Wako还建立了一项从血浆中一步分离外泌体DNA/RNA及cfDNA（circulating free DNA）的技术，并发表了一项从血液样本中检测非小细胞肺癌EGFR-T790M突变的检测方法（ExoDx^® EGFRT 790 M）。该突变导致60％接受EGFR抑制剂治疗的肺癌患者产生耐药性。有这种EGFR突变，就应及时替换Osimertinib等有效药物进行治疗，故快速的耐药诊断非常重要。通过对210例EGFR突变肺癌患者的对比试验，目前认可的cfDNA诊断法（cobas^® EGFR Mutation Test v2）检测T790M的灵敏度是58%，特异性是80%；而ExoDx^® EGFR T790M 检测的灵敏度是92%，特异性是89%。相比之下，ExoDx^® EGFR T790M 检测可获得更好的诊断结

果^3）。

　　在此背景下，无论是基础生物学研究还是临床应用，都需要实验室之间能够零差异再现的高纯度外泌体，一种任何人能轻松分离和纯化外泌体的工具是不可或缺的。特别是，如果研究对象是从血清和血浆样本中提取纯化的外泌体蛋白，则需要非常高的纯化水平。血清·血浆的蛋白浓度超过60mg/mL，还存在许多高分子量复合物如脂蛋白，即使是外泌体提取常用的超速离心沉淀法，仍然会存在大量血清游离蛋白（IgM，α2 -巨球蛋白，补体成分等）和脂蛋白。因此，通过LC/MS对超速离心法提取的血清蛋白进行全面定量蛋白质组分析时，几乎所有含量都是血清游离蛋白，只检测出了微量的外泌体蛋白。^4）

　　除超速离心法外，外泌体的提取方法还有抗体亲和法、聚合物沉淀法、凝胶过滤法以及从切除的组织浸液中直接回收的方法^5） 等。MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS（下文称为MagCapture试剂盒）的原理是亲和纯化磷酯酰丝氨酸PS （磷酯酰丝氨酸是构成外泌体膜的脂质之一）。与其它方法相比具有各种各样的优点。固定在磁珠上的Tim-4蛋白与PS在钙离子存在的条件下结合，通过螯合剂洗脱，可以不洗脱非特异性磁珠结合蛋白而特异性洗脱外泌体，因此提取的纯度很高。另外，只要磁珠纯化操作可以顺利进行，就不受样本容量的限制，即使是用稀释的样本也同样有效。此外，由于在没有变性溶解的情况下进行洗脱，后续的粒子计数检测、显微镜检查和细胞给药实验等应用均可放心使用。

　　根据图1A的方法，从相同血清中提取外泌体，并通过Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行综合蛋白质组分析。结果显示，超速离心提取外泌体的总蛋白质鉴定数为612种，MagCapture试剂盒提取外泌体的总蛋白质鉴定数为1,103种，后者是前者的约1.8倍（图1B）。这是因为超速离心法的血清中残留大量的游离蛋白质，掩盖了微量外泌体来源的信号。此外，比较鉴定的蛋白质以及相对定量值，可以看出，MagCapture试剂盒提取的外泌体中，被认为是外泌体标记蛋白的恒定分子组合以及相对含量都要更多（图2）。由此可见，通过试剂盒提取的外泌体纯度远高于现有的超速离心沉淀法。

　　使用高纯度的外泌体，有利于阐明外泌体的功能以及探索诊断和治疗药物，使研究结果更具可信度。从外泌体提取的纯度、灵活性、可重复性等方面来看，MagCapture试剂盒适合作为所有外泌体研究的起点。但是，通过该试剂盒回收的产物也是一组含有大量PS膜组分的无限定尺寸的集合，是否等同于其他现有研究指出的外泌体，还需要后期的组学分析来进行仔细评估和定义。随着包括MagCapture试剂盒在内的提取纯化技术以及检测技术的发展，我们期待对外泌体的本质阐明和临床应用的进一步发展。

图1. 提取纯度对外泌体蛋白质组分析的影响

A）通过超速离心沉淀法和MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取血清中的外泌体并进行质谱分析

B）鉴定出的蛋白数量和重叠部分

图2. 鉴定外泌体蛋白质的定量顶视图

A)   MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS及B)超速离心沉淀法提取血清中外泌体的蛋白质组定量分析结果

B）收集并记录了有报道作为外泌体标记物的蛋白。

◆参考文献

◆产品列表

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

外泌体和生命现象——第四回 外泌体糖链分析建议

庆应义塾大学 医学部医化学 松田 厚志

细胞分泌的细胞外囊泡中，粒径为100 nm左右的囊泡称为外泌体，外泌体内含有固有的蛋白以及microRNA等。另外，由于表面存在脂质和糖蛋白，外泌体成为继血液循环肿瘤细胞和血液循环DNA后的第三个被关注的液体活检标记物，并且现在世界各国也竞相开展以microRNA、蛋白组学分析为中心的研究。外泌体的最外层与细胞一样被糖链覆盖，在外泌体标记开发中糖链可作为合适的标靶。用于临床上的肿瘤标记物识别多种不同糖链结构，如果可以捕捉到疾病特异性外泌体上糖链的变化 ，则可以期待将外泌体应用于生物标记的开发。

大部分蛋白在经过糖基化等翻译修饰后都可作为功能蛋白发挥作用。糖链被称为继基因、蛋白质之后的第三生命链，并与细胞增殖、分化、细胞应答等多种生命现象相关。另外，癌症、免疫疾病、感染病、阿尔茨海默症等大多是与糖链相关的疾病，尤其是癌症，癌症的转移、侵袭、增殖等已阐明了糖链的重要性。在癌症的诊断、治疗法的开发中，对于糖链研究的期待值很高，阐明糖链的分子生物学意义已成为重要的课题之一。

与链状的核酸和氨基酸序列相比，糖链存在多样性的分支和不同的结合形式（α，β- 结合），糖链不能像核酸那样扩增，并且只限使用蛋白质样探针（抗体）进行解析，这使得糖链的分析更为困难。然而，最近以质谱，微阵列技术为中心的糖链分析技术发生了惊人的革新，迄今为止已经报道了许多新的糖链肿瘤标记以及开发方法的案例。糖链这种高门槛的研究，随着这些技术的革新，现在使得每个人都可以轻松地进行分析研究。至今为止，研究人员利用结构特异性识别糖链的结合蛋白，并固定了几十种凝集素的凝集素微阵列系统^1），进而促进了各类糖链生物标记物的开发^2,3）。本方法的优点是与质谱分析相比，其灵敏度与通量方面更为优越（图1）。作为本系统应用的一环，能够实施对多种生物样本进行解析的实验方案，现在，凝集素阵列（Lectin‐Array）分析的对象涉及多方面，如体液、组织、细胞等等。粒子状的外泌体与细胞相比粒径虽然很小，但其表面却存在无数的糖蛋白、糖脂糖链。因此，可以成为很好的凝集素阵列分析对象。凝集素阵列（Lectin‐Array）分析是通过几十种的凝集素结合方式来推断糖链结构，进而发现与比较对象有差异的糖链（凝集素）模式，这被称为糖链分析。我们采用的外泌体分析实验是将提纯的外泌体粒子上的蛋白标记荧光。因此，外泌体的回收及其颗粒形态的保持是十分重要的。另外，因为凝集素微阵列具有高灵敏度，即使回收量低也可以进行分析，但是如果混入其他糖蛋白的话就会造成干扰，无法进行正确的糖链分析。因此，对提取的外泌体的纯度是有要求的。为了能够得到高纯度并保持完整颗粒状态的外泌体，使用MagCapture^TM Exosome Isolation Kit PS （下文简称为MagCapture）进行了外泌体提取实验。该试剂盒在后述的血液中外泌体糖链分析时发挥了出色的作用。

图1. 凝集素微阵列系统和外泌体糖链分析的流程

首先，我们以培养细胞作为模型，从培养上清中分离、提取外泌体，接着尝试通过凝集素微阵列进行糖链分析比较。作为比较对象，从相同细胞株的沉淀中提取细胞膜蛋白，并对蛋白上的糖链进行分析比较（图2）。从3种类型的胰腺癌细胞株（Capan-1,-2, HPAF-II）中获得的凝集素阵列数据进行层次聚类分析后发现，这些数据不是反映细胞株之间的差别，而是出色地反映出了膜蛋白和外泌体之间凝集素的差异（图2A）。说明了即使是相同的细胞株，其细胞膜糖蛋白上糖链和分泌的外泌体上糖链的结构也是不同的。另外，即使都是外泌体，它详细的糖链图谱结果也是不同的（图2B），由此可以看出，将外泌体用作糖蛋白分析比较的标记是可行的。

图2. 胰腺癌细胞来源外泌体和细胞膜糖蛋白的糖链比较图

（A）通过层次聚类分析进行clustering

（B）各细胞株来源细胞膜蛋白，外泌体表层糖链的凝集素阵列结合形式

以培养上清液作为模型的外泌体分析已取得了一定程度的进展。进行血清来源外泌体的比较分析时，由于含有混杂的糖蛋白，因此要极为小心。换言之，在进行血液中外泌体糖链分析时，提取高纯度的外泌体是十分重要的。比较了超离法、聚合物沉淀法和MagCapture三种外泌体提取方法并进行糖链的分析。使用超离法和聚合物沉淀法时，健康者和癌症患者的糖链分析结果的差异不是很大。原因是用该类方法提取的外泌体组分用电泳分析后，可以看到过量的以球蛋白为首的血清糖蛋白的条带，这会干扰糖链的分析比较，而血清外泌体糖链分析中，使用可以提取高纯度外泌体的MagCapture可能是较为合适的试剂盒。最后根据MagCapture试剂盒提取外泌体的实验流程，作为凝集素阵列分析中必要使用的外泌体量，在换算后仅相当于数微升的血清样品量，因此，确认该方法可以用于血液中高灵敏度的外泌体糖链分析比较实验。并且本试剂盒提取的外泌体可以很好的保持完整颗粒状态。根据该实验流程，实际上可以在健康者和疾患群（A、B、C）混合血清中进行外泌体的比较糖链分析。分析主要成分的结果中显示，各患者血清外泌体表层的糖链分析结果都有所不同（图3），建议将外泌体糖链作为新的外泌体诊断指标。

图3. 血清外泌体的比较糖链分析图

（A）各混合血清中提取外泌体的银染和抗CD63抗体蛋白印迹

（B）使用了凝集素阵列分析数据的主要成分分析

现在正在尝试开发临床应用的糖链外泌体标记物。以基因组和蛋白组学分析为中心的外泌体的本质正逐渐被阐明。近年，随着不断创新的血液中外泌体检测方法的开发，对外泌体进行定量检测成为了可能，使其临床应用也更进了一步。如果可以发现疾病特异性外泌体糖链，就可以期待应用这样创新的外泌体定量系统，开发出实用的标记物。通过与其他组学分析的结合，发现特异性糖链的验证方法等还有很大的改良空间，但是我们已经迈出了外泌体糖链标记物开发的第一步。

◆参考文献

1）Kuno, A. et al. : Nat. Methods, 2, 851 （2005）.               

2）Matsuda, A. et al. : Hepatology, 52, 174 （2010）.

3）Matsuda, A. et al. : Anal. Chem., 87, 7274 （2015）.          

4）Yoshioka, Y. et al. : Nat. Commun., 5, 3591 （2014）.

5）Kabe, Y. et al. : Clin. Chem., 64, 1463 （2018）.

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体

公益财团法人癌研究会 爱研究所 细胞老化项目 冈田 辽

国立研究开发发热科学技术振兴机构 高桥 晓子

◆前言

日本人的平均寿命每年都在持续延长，世人皆知如今日本已成为屈指可数的长寿国。然而，像癌症、动脉硬化、阿尔茨海默病、肺纤维化、骨质疏松等随之而来的老年病的增加，已成为深刻的社会问题。老年病的发病原因各有不同，最近有报道称引发老年病的诱因之一，可能是随年龄增长储存在体内的老化细胞。老化细胞是指在生物体内发生了“细胞老化”、且细胞发生了不可逆停止增殖的细胞。众所周知，老化细胞会分泌出各种炎症蛋白；但我们研究发现老化细胞不仅分泌炎症蛋白，还促进外泌体的分泌，因此老年病与外泌体的研究分析还在持续进行。本文主要就老化细胞分泌外泌体为中心的研究发展进行了概述。

◆细胞老化是什么

除去部分的组织干细胞，构成我们身体的大部分细胞的分裂次数是有限的，正常的体细胞达到细胞寿命并不可逆地停止增殖的状态称为细胞老化^1）。另外，就算添加活性正常的细胞至有致癌危险的应激反应（染色体缩短、癌基因的活化、氧化应激等）中，还是会被细胞老化诱导而不可逆地停止增殖。因此，我们认为细胞老化与细胞凋亡相同，有防止异常细胞增殖、抑制癌症的作用^2）。然而，细胞老化不同于细胞死亡，老化细胞会在生物体内长期生存，因此随着年龄的增长，体内的老化细胞会越来越多^3）。另一方面，老化细胞中的染色质结构会根据持续的DNA损伤应答而改变，如炎症性细胞因子、趋化因子、基质分解酶和增殖因子等各种炎症蛋白基因活化表达^4）。已知老化细胞会分泌炎症蛋白到细胞外，这样的细胞老化的表现型被称为SASP（Senescence-associated secretory phenotype）。从老化细胞中分泌出来的SASP因子会引发周围组织的慢性炎症，可以看出这很可能是形成老年病的原因^5）。我们在分析老化细胞分泌的SASP因子的过程中发现，SASP因此还能促进老化细胞外泌体的分泌⁶⁾。

◆外泌体是什么

外泌体是直径约为50~150 nm的细胞外囊泡，是细胞膜内吞成为内体，再成为多泡体而形成的。外泌体含有蛋白质、脂质、核酸等细胞内组成分子，并具有将其转运到其它细胞的功能，因此近年来有报道称外泌体具有细胞间信息传递的作用，引起了广泛地关注^7）。

◆细胞老化和外泌体

使用人正常纤维细胞诱导的具有分裂寿命的细胞老化（eplicative senescence）和癌基因RasV12活化的细胞老化（Oncogene-induced senescence），用NTA（Nanoparticle Tracking Analysis）检测外泌体的分泌量后，老化细胞的分泌量比年轻细胞高约30倍^6）。因此，我们针对老化细胞中促进外泌体分泌的生物学机能进行了分析。分别敲除老化细胞中参与外泌体生物合成和分泌的Alix 和 Rab27a两个基因，切断外泌体的通道后诱导细胞凋亡状的细胞死亡。令人惊讶地是，即使是年轻增殖中的正常细胞，切断外泌体的路径也会激活DNA损伤应答和诱导细胞死亡，所以正常的细胞有可能会通过外泌体通道将有些有害物质分泌到细胞外。因此，我们在探索分泌外泌体的正常细胞中引发DNA损伤的诱导分子过程中，发现了其细胞质中的基因组DNA片段。细胞质中存在的DNA片段通过细胞质DNA传感（cGAS-STING 通道）被感知，从而引起自然免疫应答。总之，正常的细胞通过外泌体将有害的基因组DNA片段分泌到细胞外，防止对自身DNA的自然免疫应答。外泌体还作为如腺病毒等的外来性DNA病毒感染的屏障，表明外泌体通道是维持细胞稳定性的重要的生物体防御机制之一^6）。

在正常的细胞中，细胞质中的DNA片段可通过DNase2a 和 TREX1等DNA分解酶快速清除，但是我们发现老化细胞中DNA分解酶的表达水平下降^8）。为此，我们报道了在老化细胞中，储存在细胞质中的基因DNA片段通过激活DNA感应通道引起自然免疫应答，诱导SASP，参与肥胖引起的肝癌的病发（图1）。

图1. 老化细胞和外泌体

◆作为SASP的外泌体

众所周知，癌微环境中的老化细胞作为CAFs（Cancer-associated f ibroblasts）通过SASP因子促进癌细胞的增殖和转移和浸润。我们为了调查老化细胞分泌的外泌体的机能，分别向从年轻细胞和老化细胞中回收外泌体片段，分别向其中添加乳癌细胞株（MCF-7），观察到只有老化细胞分泌的外泌体片段对癌细胞的增殖有促进作用。接着，从各个细胞中回收的外泌体片段进行蛋白质组分析，结果显示，在老化细胞分泌的外泌体中， Ephlin-A2（EphA2）（酪氨酸激酶型受体之一的癌转移促进因子）的含量显著增加。并且，由于调节EphA2去磷酸化的PTP1B失活，外泌体会选择性地摄取被磷酸化的EphA2，我们发现在老化细胞中，外泌体有存在决定装载何种物质的机制。因此，指出老化细胞分泌的外泌体膜上的EphA2与癌细胞中高表达的受体（Ephlin-A1）相结合，通过激活下游的Erk信号来促进癌细胞的增殖。在该研究中我们明确发现了老化细胞来源的细胞外分泌膜囊泡作为促进癌细胞增殖的SASP因子起作用^9）。

◆结语

外泌体迄今为止作为细胞间信息传递工具的功能和诊断工具的实用性被关注并研究，但是细胞为何会分泌外泌体，其在生物学的意义上还有许多的未解之谜。最近，有报道称通过去除下丘脑干细胞和祖细胞的早衰症模型小鼠实验，调节下丘脑干细胞来源的外泌体中miRNA量改变了老年病的发病速度和个体寿命^10）。而且由于将有治疗效果的特定的siRNA和mRNA加载到外泌体并送入靶细胞的技术不断被开发^11,12），所以期待今后外泌体可以不仅作为疾患的生物标记，还能作为 DDS（Drug delivery system）被有效运用。

◆参考文献

１） Hayflick, L. : Exp. Cell Res., 37, 614 （1965）.

２） Takahashi, A. et al. : Nat. Cell Biol., 8, 1291 （2006）.

３） Yamakoshi, K. et al. : J. Cell Biol., 186, 393 （2009）.

４） Takahashi, A. et al. : Mol. Cell, 45, 123 （2012）.

５） He, S. et al. : Cell, 169, 1000 （2017）.

６） Takahashi, A. et al. : Nat. Commun., 8, 15287 （2017）.

７） Tkach, M. and Théry, C. : Cell, 164, 1226 （2016）.

８） Takahashi, A. et al. : Nat. Commun., 9, 1249 （2018）.

９） Takasugi, M. et al. : Nat. Commun., 8, 15729 （2017）.

10） Zhang, Y. et al. : Nature, 548, 52 （2017）.

11） Kamerkar, S. et al. : Nature, 546, 498 （2017）.

12） Kojima, R. et al. : Nat. Commun., 9, 1305 （2018）

外泌体与生命现象——第六回 外泌体与病毒

东海大学综合医学研究所造血肿瘤领域 东海大学医学部血液·肿瘤内科 柿崎正敏、幸谷愛

◆前言

病毒感染有史以来就已经存在，但直到1898年口蹄疫病毒的发现，病毒才被定义为病原体。与人类疾病相关的病毒就有数百种，从日常生活中经常会遇到的呼吸道、消化道等急性感染病，到艾滋病、乙型肝炎和宫颈癌等慢性疾病都与各种病毒感染有关。近年来，有报道称，细胞外囊泡（Extracellular vesicles: EVs）中的外泌体与病毒的生存策略具有相关性。

本文将介绍病毒感染细胞释放出的外泌体与病毒性疾病的相关研究，然后进一步概述作者研究的B型肝炎病毒（Hepatitis B virus: HBV）感染细胞来源外泌体的功能。

◆外泌体的分泌

外泌体来源于向晚期内体中的多囊泡体（Multi vesicular body: MVB）出芽的腔内囊泡（intraluminal vesicles: ILVs），是约100 μm大小的囊泡^1）。ILVs的形成与被称为ESCRT（endosomal sorting complex required for transport）的蛋白质复合物有关。MVB与细胞膜融合后，外泌体被分泌到细胞外。

◆病毒的出芽

病毒有几种出芽的途径，包括从细胞膜中直接出芽及通过MVB出芽等。有报道称，逆转录病毒、黄病毒、弹状病毒和副粘病毒等具有多层包膜的RNA病毒，可以通过ESCRT复合物和ESCRT相关蛋白的相互作用促进病毒从细胞膜中出芽^2）。另外，HBV及E型肝炎病毒（Hepatitis E virus: HEV）也能与ESCRT复合物及ESCRT相关蛋白相互作用，然后通过MVB途径释放而出^2,3）。综上，病毒会通过劫持ESCRT机制，来使自身顺利出芽。

◆病毒感染细胞来源外泌体的功能

除出芽之外，病毒还会劫持ESCRT机制向外泌体中输送病毒基因组和病毒相关蛋白，因此，外泌体有利于病毒的存活。实际上，HIV感染细胞来源的外泌体中，含有一种HIV病毒蛋白Nef，吸收了含有Nef的外泌体的细胞更容易感染HIV^4,5）。另外，EBV阳性B细胞淋巴瘤来源的外泌体中含有EBV编码的miRNA，吸收了该外泌体的巨噬细胞会发生肿瘤相关的巨噬细胞样的特性改变，并且会促进肿瘤细胞的生长^6）。

如上所述，迄今为止，有关各种病毒感染细胞来源的外泌体的功能分析一直在进行。下文将概述作者正在研究的HBV感染细胞来源的外泌体的功能。

◆HBV

HBV是世界范围内的传染病，全球估计有4亿持续性HBV感染患者，大部分集中在亚洲和非洲，而日本估计也有大约

100万HBV携带者。在日本，防止母婴传染的措施减少了新的感染，病毒复制逐渐能被核酸类似物控制，但仍未发现能完

全清除病毒的疗法。为了开发能完全消除HBV的治疗方法，首先需要明确B型肝炎变成慢性病的过程，然而，B型肝炎向

慢性病发展的过程中仍存在很多不清楚的部分。近年来，在慢性B型肝炎患者的血液中的单核细胞中，PD-L1的表达增

加^7），尤其是HBV特异性CD8阳性T细胞中的PD-L1的表达，细胞毒性显著下降^8）。  因此，PD-1/PD-L1-axis有可能是慢性B型肝炎致病原因之一。对此，作者假设含有HBV感染细胞释放出的外泌体的EVs参与了B型肝炎发展成慢性B型肝炎的过程，并对此进行了研究。

◆HBV感染细胞来源EVs的功能

除外泌体外，HBV感染细胞还会释放大量仅含有HBs抗原的非感染性中空颗粒。这些中空颗粒具有HBs抗体诱饵的作用，但实际功能仍未明确。本文记述了含有外泌体、中空颗粒和HBV病毒颗粒的EVs。为了找出HBV感染细胞来源的EVs被何种细胞吸收，作者先向人末梢血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells:PBMCs）的培养上清中投放荧光标记的HBV感染细胞来源的EVs，24小时后再用FACS进行分析。结果，单核细胞会选择性地吸收EVs（图1A）。在吸收了EVs的单核细胞中，PD-L1的表达增加（图1A），免疫细胞的活性标记物CD69的表达减少。接下来，为了鉴定与PD-L1 和CD69表达增减相关的颗粒，作者利用密度梯度离心法分离外泌体、中空颗粒和HBV病毒颗粒，然后将各种颗粒分别投放到PBMC培养上清中，24小时后确认PD-L1的表达。结果发现，所有颗粒中的PD-L1表达增加，CD69表达减少，特别是外泌体和中空颗粒会使PD-L1表达增加（图1B），CD69表达减少。据以上所述，HBV感染细胞来源的外泌体与中空颗粒可能对吸收的单核细胞具有免疫抑制能力^9）。

图1

其次，为了调查HBV感染细胞来源EVs是否也会在体内诱导免疫抑制，作者使用HBV感染的小鼠模型进行了研究。为了在小鼠体内获得肝炎实验体系，在用HBs抗原免疫了三次的小鼠中，使用Hydrodynamic injection（HDI）法将野生型HBV复制子质粒转染到肝脏中。由此能获得HBV肝炎模型。进行HDI的2小时后，从尾静脉处注射HBV感染细胞来源的EVs，3天后再检查肝脏中的细胞浸润和HBc抗原表达。结果发现，在未注射HBV感染细胞来源的EVs的小鼠肝脏中能观察到大量的细胞浸润，而且几乎无法确认HBc 抗原（图2）。另一方面，注射了HBV感染细胞来源EVs的小鼠肝脏几乎没有细胞浸润，并且能观察到许多HBc抗原（图2）。上述结果表明，HBV感染细胞来源EVs会诱导体内免疫抑制。

图2

◆结语

在外泌体发现初期，其被认为是细胞释放出无用的蛋白质和核酸的机制。但如今，外泌体作为细胞间通信器，和各种疾病的诊断和治疗的目标而受到关注。在本文中，作者介绍了一些与病毒感染细胞来源外泌体功能相关的研究，研究表明外泌体参与了所有生命现象。许多研究都阐明了外泌体的生物学意义，但是关于其作用机制和产生过程的细节仍有许多不明确的部分。期待作者的研究能有助于未来的外泌体研究。

〔参考文献〕

1） Murk, J. L. et al . : Semin. Cell Dev. Biol ., 13（4）, 303（ 2002）.

2） Selzer, L. and Zlotnick, A. : Cold SpringHarb. Perspect. Med ., 5（ 12）, 0021394（ 2015）.

3） Nagashima, S. et al . : J. Gen. Virol ., 95, 2166（2014）.

4） Campbell, T. D. et al . : Ethn. Dis ., 18（ 2 Suppl 2）, S2-14（ 2008）.

5） Arenaccio, C. et al . : J. Virol ., 88, 11529（ 2014）.

6） Higuchi, H. et al . : Blood , 131 （23）, 2552（2018）.

7） Huang, Z. Y. et al . : Viral Immunol ., 30 （3）,224（ 2017）.

8） Boni, C. et al . : J. Virol ., 81, 4215（ 2007）.

9） Kakizaki, M. et al . : PLoS One , 13 （12）,e0205886（ 2018）.

◆外泌体相关试剂盒

外泌体与生命现象——第七回 外泌体与癌症

东京医科大学 医学综合研究所 分子细胞治疗研究部门 小坂 展庆

癌细胞与存在于微环境中的细胞保持紧密联系，癌症的恶化过程与其相关。阐明癌细胞与周边细胞间交流情况，与开发例如Nivolumab那样的划时代性癌症治疗药物息息相关。目前为止的研究主要围绕着黏附分子、细胞外基质、细胞因子和趋化因子等与细胞交流相关的因子进行。然而最近，外泌体作为崭新的细胞间交流因子备受瞩目，被分泌到细胞外的囊泡外泌体，由脂质双分子层构成，并含有蛋白与核酸。外泌体作为多种生理活性物质的复合体，不同于迄今已知的其他交流因子，尤其是从未作为交流工具被纳入考虑的细胞内蛋白与核酸分子等皆由外泌体运输。发现初期，外泌体被认为起着垃圾袋的作用，可以将细胞内的废物排出；然而众多研究表明，外泌体与生物体内的各种生理功能以及其破裂引起的疾病相关，尤其是在癌症中，它在癌症恶化的所有阶段都发挥着重要的作用^1）。接下来本文将简单介绍本研究室至今报告的癌症恶化中外泌体的作用。

由于癌细胞分裂极其迅速，为了生存就需要营养，因此癌细胞通过在肿瘤内诱导产生血管获得营养。我们已经阐明了癌细胞分泌的外泌体会诱导肿瘤血管生成^2）。 另外通过抑制神经酰胺合成酶之一的nSMase2（中性鞘磷脂酶-2）的表达，减少了癌细胞中外泌体的分泌后，肿瘤内的血管失去诱导，最终抑制了癌症的转移。

随着卵巢癌的恶化，癌细胞扩散到腹部产生腹膜播散，导致治疗困难，卵巢癌引起的腹膜播散也与外泌体相关。卵巢癌分泌的外泌体被形成腹膜的间皮细胞摄入，并诱导这些细胞的凋亡，因此导致腹膜穿孔，促进了癌细胞的腹膜播散^3）。另一方面，外泌体还与同样难以治疗的癌症脑转移相关。名为血脑屏障的生物屏障，虽然会限制除营养以外的物质自由转移至大脑中，但是癌细胞却可以突破屏障实现转移。我们发现，脑转移性乳腺癌细胞株的外泌体进入形成血脑屏障细胞之一的血管内皮细胞中，通过缓和血管内皮细胞间强烈的细胞间相互作用，实现癌细胞转移^4）。

另外，乳腺癌即使过了五年或十年，仍然存在着复发风险。有人提出原因之一，就是乳腺癌细胞进入骨髓，并进入长期地休眠状态，但关于其分子机制仍然有许多不清楚的地方。我们通过骨髓中的间充质干细胞的外泌体确认了乳腺癌细胞的休眠，并明确了外泌体在乳腺癌复发中的重要性^5）。

图1. 外泌体在癌症恶化中的作用

外泌体涉及癌症恶化的多个阶段。由于癌细胞反复增殖，所以为了适应不断变化的环境，会将周围环境改造成适合自己的微环境。此时，除细胞分子与趋化因子以外还有外泌体的参与。例如，在需要摄取营养与低氧环境下时，为了促进血管新生就会输送外泌体到血管内皮细胞中生成肿瘤血管（1）。在癌症转移时，诱导已形成生物屏障的腹膜间皮细胞的凋亡，使自身可以远距离转移（2）。并且还输送了缓和同样作为生物屏障的重要的血脑屏障处的血管内皮细胞间连接的外泌体（3）。另外存在于骨髓中的癌细胞，通过摄入间充质干细胞的外泌体进入休眠状态，我们认为这是导致癌症长时间复发的原因之一（4）。亦有报告称癌细胞来源外泌体与转移前微环境的形成相关（5）。

除了目前为止介绍的研究以外，世界上还有众多研究者也报告了外泌体在癌症恶化中的作用（图1）。当然，癌症恶化不仅仅是因为癌细胞分泌的外泌体，肿瘤微环境中存在的癌细胞以外的细胞分泌的外泌体也与癌症恶化相关。如果包含之前提到的细胞因子和趋化因子这些分泌因子与黏附分子等物质在内的话，癌细胞与其微环境中的周边细胞之间的细胞间交流就可谓是极其复杂了。既然是癌细胞分泌的外泌体促进癌症的恶化，那么以其外泌体为靶向的治疗法就可能有效地抑制癌症的转移。因此，下文将针对癌症恶化相关的外泌体靶向癌症疗法的案例进行概述（图2）。

图2. 针对癌细胞来源外泌体的新型癌症治疗方法

下面将举出两种以癌细胞分泌的外泌体为靶向的新型癌症治疗方法。例如，吸收癌细胞外泌体的血管内皮细胞，诱导血管新生以及为癌细胞提供相关的氧气与营养（A）。此时（1）抑制外泌体的分泌，（2）去除循环外泌体，通过使癌细胞来源外泌体无法到达血管内皮细胞，推动新型血管新生抑制剂的开发（B）。

1. 抑制癌细胞分泌外泌体

根据我们以及其他团队的研究，发现阻碍癌细胞外泌体的分泌可能会抑制癌症转移^1）。因此开始研究抑制癌细胞分泌外泌体的方法。然而，生物体内多种细胞都能够分泌外泌体，如免疫细胞来源外泌体，能够抑制癌症恶化，因此抑制所有外泌体的方法，显然不是一种有效的疗法。而且外泌体具有各种各样的生理性功能，抑制所有外泌体分泌的方法，可能会导致预想不到的副作用。所以，通过阐明癌细胞这种疾病特异性外泌体的分泌路径，并确立靶向疾病特异性外泌体分泌路径的治疗方法是十分必要的。虽然关于外泌体的分泌路径仍未明了，但与正常细胞相比，癌细胞的外泌体分泌量明显增多。这表明癌细胞分泌的外泌体存在着与正常细胞不同的分子机制。因此，识别这些分子并通过靶向该分子抑制外泌体分泌的研究，对于实现治疗是十分重要的。

2. 去除血液中癌细胞来源的外泌体

去除存在于血液中的癌细胞来源外泌体的研究，是一种抑制转移前微环境形成与耐药性等相关的外泌体功能的方法。转移前微环境（pre-metastatic niche）是指癌细胞在转移至目标器官之前，将该器官提前调整为适合癌细胞生存的环境。根据至今为止的研究，虽然提出了各种细胞因子与趋化因子对转移前微环境形成的重要性，但实际上癌细胞来源外泌体也与转移前微环境形成相关^6、7）。而血液中外泌体引起的癌症恶化的其他案例，也暗示了如帕妥珠单抗等以HER2为靶向的抗体药物会与血液中循环的HER2阳性外泌体结合，存在使其无法到达肿瘤发挥药效的可能性^8）。因此，诸如此类去除血液中循环的外泌体的癌症治疗法的可能性仍在研究中。

我们团队将人乳腺癌细胞株移植到小鼠中，投入靶向外泌体上的CD63或CD9的抗体后，成功抑制了乳腺癌细胞株的转移^9）。由此看来，虽然通过去除血液中的外泌体具有治疗癌症的可能性，但是在本文中，我们通过靶向已确认在外泌体上表达的CD63与CD9等众多分子，发现了它也有与正常细胞外泌体结合的可能性。所以，在实际临床应用中，必须识别出癌细胞特异性外泌体的抗原，并靶向该分子。

外泌体研究热潮席卷全球仅过了十年左右，因此仍有许多关于外泌体的未解之谜。外泌体是由多分子组成的复合体，并且根据细胞与细胞所处环境，分泌的外泌体的性质也会有所改变。而且外泌体大小仅为100 nm，传统生命科学研究用的机器与技术都不能直接用于外泌体分析。在此背景下，外泌体研究陷入复杂且困难的境地。但是，拥有大量癌细胞信息以及与癌症恶化相关的外泌体对于新型癌症诊断、治疗而言是极具吸引力的研究对象，我们期待着将来更进一步的研究发展。

◆参考文献

1）Kosaka, N. et al. : J. Clin. Invest., 126（4）, 1163-72（2016）.

2）Kosaka, N. et al. : J. Biol. Chem., 288（15）, 10849-59（2013）.

3）Yokoi, A. et al. : Nat. Commun., 8, 14470（2017）.

4）Tominaga, N. et al. : Nat. Commun., 6, 6716（2015）.

5）Ono, M. et al. : Sci. Signal., 7（332）, ra63（2014）.

6）Peinado, H. et al. : Nat. Med., 18（6）, 883-91（2012）.

7）Hoshino, A. et al. : Nature, 527（7578）, 329-35（2015）.

8）Ciravolo, V. et al. : J. Cell. Physiol., 227（2）, 658-67（2012）.

9）Nishida-Aoki, N. et al. : Mol. Ther., 25（1）, 181-191（2017）.