小鼠生殖工程学技术——10复苏玻璃化冷冻后的胚胎的步骤
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◆材料
1、 0.25 M 蔗糖
2、 KSOM/AA
3、 培养皿(Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588)
4、 蓝色枪头(BM器材 Cat.No.111-R100S)
5、 微管
6、 自动移液器(GILSON PIPETMAN P-1000)
7、 解剖针(夏目制造所 Broach holder Cat.No.E-14)
8、 酒精灯(或者台式微型煤气燃烧器 Cat.No.RK4102)
9、 CO2培养箱(37°C 5% CO2 95% air)
◆步骤
准备清洗胚胎用的培养皿和蔗糖溶液
1. 首先制作清洗复苏后胚胎的培养皿,静置在CO2培养箱内30分钟以上,稳定内部气体。
2. 预先在CO2培养箱内加热0.25 M 蔗糖溶液。
胚胎的复苏
1. 从液氮储存器内取出冻存的EP管后,立刻打开盖子,倒掉EP管内的液氮,在室温下静置30秒。
2. 用自动移液器把0.9ml已预热到37°C的0.25 M 蔗糖溶液添加进EP管内,在蔗糖溶液完全溶进冻存液前要迅速移液(10次左右)。
* 融解后的冻存液在常温下细胞毒性很强,因此需要迅速往EP管内添加0.25 M 蔗糖稀释冻存液。
移液
1. 如下图所示,首次移液需迅速把0.9mL 0.25 M 蔗糖溶液转移至EP管内加热(请注意如果枪头的尖端接触冻存液,枪头内的蔗糖溶液会冻结并阻塞在枪头的尖端)。
2. 第二次以后的移液,就按照下图蓝色箭头所示小幅度移液。
此外,第二次以后的移液,以免损坏胚胎,应小心且迅速有序地移液加热胚胎。(移液的速度请参考以下视频)
3. 使用自动给移液器,将冻存液和蔗糖溶液的混合溶液移至培养皿上,接着用0.4~0.5mL的0.25 M 蔗糖溶液清洗EP管。
注意:移液时,尽量避免产生气泡。在混合溶液移至培养皿上时,如果溶液表面产生气泡,气泡会阻碍取回胚胎,此时可用酒精灯加热解剖针的尖端,然后刺破气泡。
胚胎复苏时移液要点:请注意,移液过程中如果枪头内有气泡,混合溶液移至在培养皿后,溶液表面产生的大量气泡会导致难以在显微镜下观察胚胎,无法取回胚胎。
4. 直接从混合溶液里取出胚胎,小心地导入预先制作好(清洗前30分钟以上开始准备)、清洗胚胎的培养皿上的KSOM/AA滴液里,静置在培养箱内10分钟。
静置10分钟后
5. 用剩下的KSOM/AA滴液清洗胚胎两遍。
参考文献
【1】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos
by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.PDF