阿尔茨海默症β-淀粉样蛋白

神经退行性疾病研究前线

东京大学研究生院药学系研究科 功能病态学课题组  堀 由起子、富田 泰辅

◆序言 

  何谓β-淀粉样蛋白多肽Aβ

　　阿尔茨海默症（Alzheimer disease；AD）患者的大脑中，老人斑是最显著的病理特征之一，是不溶性蛋白质异常聚集形成丰富的β片层结构的淀粉样纤维，并积累于脑实质细胞间隙的构成物。 通过近年来开发的淀粉样蛋白PET成像分析人脑内积累的老人斑发现，认知功能障碍症状出现前的10-15年，就能明显看到老人斑的出现，因此老人斑被认为是AD发病过程中的最早期病变。1984年Glenner等人开始研究脑血管淀粉样蛋白，1985年Masters等人开始研究老人斑淀粉样蛋白，对其进行分离纯化和氨基酸测定，证实老人斑的主要构成成分为β-淀粉样蛋白多肽（Aβ）。

　　Aβ的肽链由约40~43个氨基酸组成。在N末端和C末端分别发生几种变异，老人斑积累的代表性物质Aβ包括由40个氨基酸组成且以40号Val残基结束的Aβ40和由42个氨基酸组成以42号Ala残基结束的Aβ。与Aβ40相比，Aβ42的凝集性非常高，在老人斑形成早期就已经积累起来了。积累的Aβ一部分被修饰，存在3号Glu残基被pyro化修饰的Aβ。

◆淀粉样蛋白假说

　　AD多数情况下为偶发性病症，但也有极小部分是以常染色体显性遗传的家族性AD（Family AD；FAD）形式存在。从遗传学研究角度鉴定FAD的致病基因——编码Aβ前体蛋白（APP）的APP基因、APP切断酶γ-secretase复合体的活性中心蛋白被PSEN 1和PSEN 2基因编码的Presenilin 1和2识别。在上述3种遗传基因的基础上，对FAD家族进行研究发现FAD变异存在以下病变结果：①Aβ产生总量增加；②高凝集性的Aβ42产生比率增加；③Aβ自体凝集性增强。 由此提出了Aβ的凝集·积累是诱发AD症的“淀粉样蛋白假说”。作为APP基因上的保护性变异，A673T的变异会使Aβ产生减少，由此更强有力地支持了Aβ是AD发病机制的“淀粉样蛋白假说”。

　　大脑中Aβ的浓度是通过对其产生和清除进行平衡调节，一旦平衡被破坏了，就会出现Aβ在脑内聚集的局面。本文通过Aβ的产生、清除和聚集三方面，靶向治疗Aβ展开论述根治AD的方法。

◆Aβ的产生过程

　　Aβ是由其前体蛋白APP切断出来的肽链片段。APP是I型单向膜贯通性蛋白质，普遍存在于各个组织中。根据氨基酸剪接不同主要分为695/751/770三种氨基酸类型，但在大脑中发现较多的是695氨基酸的APP695。

　　在健康的人脑脊髓液中也可检测出Aβ，它并不是AD病患者脑中病变产生的产物，而是APP正常代谢过程中产生、分泌的分子。Aβ是通过对APP 2阶段的剪切后产生的（如图1）。首先，APP的细胞外域被β-secretase切断，细胞外域片段（sAPPβ）被分泌出来。然后γ-secretase切断残留在细胞膜的APP的C末端断片（C99），并产生Aβ和AICD。Aβ的C末端变异是γ-secretase切断时引起的，氨基酸切断的部位不同，可以产生Aβ37到Aβ49等多种Aβ。以前人们瞩目于高产生量的Aβ40，或聚集性·毒性高的Aβ42，但近年来，聚集性·毒性高的Aβ43也备受瞩目。另外，除了γ-secretase的切断抑制作用，对于其切断活性调节的γ-secretase modulator（GSM）的开发和功能机制的研究也在进行中， Aβ37和Aβ38的短Aβ种类的产生机制也受关注。β-secretase的分子形态是以BACE1为活性中心，Aph-1、Pen-2、nicastrin的复合体；γ-secretase是以presenilin 1或presenilin 2为活性中心的，与Aph-1、Pen-2、nicastrin组成的复合体。

　　APP代谢过程中，除Aβ产生途径外，还存在非Aβ产生途径（如图1）。非Aβ产生途径也分为2个阶段的剪切，第2阶段的剪切酶同样是γ-secretase，但第1阶段的剪切酶为α-secretase。α-secretase是在APP上的Aβ内域16号Lys残基和17号Leu残基间切断的， 产生的约3kDa的片段（p3）是缺失Aβ N末端域16氨基酸的多肽片段。神经细胞中的ADAM10就是主要的α-secretase。

图1. Aβ产生途径和非Aβ产生途径

（A）Aβ产生途径模式图。APP被β-secretase、γ-secrease切断产生Aβ（Aβ产生途径）；被α-secretase、γ-secretase切断则产生p3（即非Aβ产生路径）。

（B）Aβ序列及其切断部位图像。蓝色部分表示Aβ序列。

　　近年来有报道指出，Aβ产生量是随神经活动的变化而变化的。在小鼠脑内可明显观察到，脑部位的神经活动量和Aβ产生量、Aβ积累量相关，小鼠进入睡眠状态时，神经活动受到抑制，Aβ产生量也明显减少^14、15）。利用光遗传学技术使神经活动长期处于连续亢奋的状态，则发现Aβ积累量增加^16）。虽然通过增强神经活动使Aβ产生的机制尚未明确，但随着神经活动亢奋，内吞作用增强可能使得被运送至细胞表面的APP更容易被内吞作用以及被BACE1切断。

◆Aβ清除过程

　　通常情况下，可以通过迅速清除脑内产生的Aβ，来维持大脑内Aβ的一定浓度。但是在一部分的FAD患者中，FAD的变异结果使Aβ产生量增加，破坏脑内Aβ平衡，引发AD症。另一方面，在偶发性AD患者群中发现，AD症的突破点不在Aβ产生的增强，而是Aβ的清除^17）。这个结果表明除了Aβ产生过程，Aβ清除过程的详细分子机制研究也至关重要。报道指出，Aβ分解酶的分解、胶质细胞的吞噬作用、通过血脑屏障（BBB）的排出输送等都可作为Aβ清除的主要机制。

　　代表性的Aβ分解酶有：金属蛋白酶——Insulin degrading enzyme（IDE）和Neprilysin（NEP），丝氨酸蛋白酶——Kallikrein-related peptidase 7 （KLK7）等^{18, 19, 20）}。从基因敲除小鼠案例中阐明了二者都能分解小鼠脑内的内源性Aβ，还可以减少AD患者脑内的Aβ量，降低其分解活性。另外，使用腺病毒相关载体表达NEP等也可以减少Aβ的积累^21），更表明了这些Aβ分解酶可能成为AD病症治疗的标靶。

　　脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞等胶质细胞吞噬Aβ也被推断出来。在小胶质细胞中，发现了与Aβ吞噬作用有关的scavebger receptor等受体。加之近年来从胶质细胞相关研究发现的可能与AD风险相关基因群（Genome wide association study；GWAS）中，发现小胶质细胞中含有多种高表达的遗传基因^22），这些胶质细胞可能以某种形式影响着AD症的发病。实际上，这些遗传基因中，关于CD33和TREM2等对Aβ清除造成的影响已被报道^{23, 24）}。

◆Aβ凝集过程

　　Aβ单体中，没有特定结构，聚集、积累后Aβ形成了丰富的β片段构造的淀粉样蛋白纤维。Aβ42的聚集性比Aβ40高，是脑内老人斑形成时最先积蓄的一种Aβ。Aβ40比Aβ42结构更容易发生改变，虽然原因暂时不明，但已有报道指出31-34号、38-41号氨基酸残基上组成β发夹结构可稳定C末端结构，使其更易形成β片段结构^27）。在Aβ分子内，淀粉样蛋白纤维与25-29号氨基酸组成转角结构形成β片段结构，通过分子间相互作用形成β交叉片段^25、26）。组成分子内转角结构的氨基酸域附近是增强Aβ聚集性效果的基因变异集中的热点部位，可从结构侧面推测出这些变异可促进Aβ的结构变化和纤维加速形成。

　　Aβ形成淀粉样蛋白纤维的过程，可以建立体外实验的核形成过程和伸长过程的模型^28）29）。核形成过程就是Aβ单体发生结构变化并发生核纤维伸长形成聚合（seed）的最初过程，是一个缓慢进行的淀粉样蛋白形成过程。Aβ42的这个成核过程比Aβ40要早。持续伸长过程是以形成的seed为起点，Aβ通过结构变化依次结合使纤维快速伸长的过程。在体外，单独孵育Aβ40聚集进展缓慢，预先添加纤维化的Aβ可以加速聚集速度。同样在体内，将AD患者脑来源或带有Aβ积累的AD模型小鼠来源的脑裂解液注入不带Aβ积蓄的小鼠脑中，注入的Aβ作为seed在脑中促进Aβ的积累^30）。由此证明了seed形成在Aβ积累中的重要性。上述的AD患者脑来源的Aβ淀粉样蛋白结构分析中，淀粉样蛋白结构并非相同的，病变过程不同的患者可能产生不同的淀粉样蛋白构造，由此也可证明最初形成seed结构的重要性。

　　初期提到的《淀粉样蛋白假说》提出Aβ积累形成老人斑，是AD症发病的原因。但是，老人斑和认知功能衰退之间并无明确的相关性、比起淀粉样蛋白纤维oligomer等Aβ聚集中间体具有强毒性被明确后，现在已将《特别是聚集中间体发挥着强毒性》作为《淀粉样蛋白假设》的一部分修改形式。Aβ聚集中间体与使淀粉样蛋白纤维构造不溶的Aβ不同，是可溶的低分子量Aβ重组体。有报告指出可溶性中间体在体外试验中有paranuclei、protofibrils、Aβ-derived diffusible ligands（ADDL）等Aβ聚集中间体^{31）、32）、33）}。在体内，除了dimer和trimer等low-n oligomer外，还检测到用12-mer组成的56kDa的Aβ^34、35）。这些Aβ凝集中间体的共同性是带有强烈的突触功能障碍和细胞毒性，其形成机制和性质很耐人寻味。

◆以Aβ为治疗靶点的AD根本治疗法

　　以《淀粉样蛋白假说》为立足点，人们提出各种以Aβ为治疗标靶的AD根本治疗法。主要是①抑制Aβ产生、②促进Aβ清除、③抑制Aβ聚集为目的研究，虽然经过基础实验水平探索、检测了一些候补化合物，但以下记载的两个观点是专门进行临床实验的。

　　第一是以抑制Aβ产生的各个secretase活性抑制法。但是γ-secretase除了含有APP外还有各种切断底物，特别是切断Notch会造成很大副作用。因此不能使用γ-secretase抑制剂，而是寻求开发以调节切断活性为目的的，可特异性减少Aβ42产生的γ-secretase modulator（GSM）。另外，作为β-secretase的BACE1、BACE1敲除小鼠没有出现presenilin敲除小鼠的异常表现型，β-secretase切断限制Aβ产生过程，因此BACE1抑制剂有望成为AD治疗的有效药物。

　　第二是促进Aβ清除。这个观点在临床实验中有抗Aβ抗体被动免疫法和Aβ疫苗主动免疫法。1999年，Schenk等人提出了在APP转基因小鼠体内免疫Aβ聚集，可以减少脑内Aβ积累的报告36）。之后还提出注射抗Aβ抗体，可也达到同样效果37），通过抗Aβ抗体也可以促进Aβ清除。尽管清除机制尚未完全明确，但是可认为活化了小胶质细胞活对Aβ的吞噬作用，促进Aβ向末梢延伸。对极少量抗体转移至脑内和抗体表位引起的效果差异，仍需要详细的机制说明。

　　这些以Aβ为目标的治疗药正在临床实验的困境之中，而造成这个局面的原因之一是治疗开始的时间太晚。前面所提到的老人斑是在认知功能障碍显现的10~15年前就开始积蓄，对表现出认知功能障碍且已演变为AD病症的患者，单纯以Aβ为目标的治疗策略不一定能改善AD症状。因此可在Aβ积累开始的未发病期或早期的临床前阶段进行预防性干预，开展预防性医疗38、39）。为了使治疗策略有效执行，必须开发Aβ积累的早期诊断方法，如开发简便的Aβ淀粉样蛋白图像诊断法和生物标记法等。

◆结语

　　从多年来对AD相关基础研究结果看，将Aβ作为AD发病原因的“淀粉样蛋白假设”和以Aβ为靶标的治疗策略有一定的合理性。但尚不能作为AD根本治疗方法，需要进一步对影响AD症的Aβ做详细的分子机制及临床应用研究。

【参考文献】

[1]　Glenner, G. G. et al. : Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 885-890 （1984）

[2]　Masters, C. L. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4245-4249 （1985）.

[3]　Iwatsubo, T. et al. : Neuron, 13, 45-53 （1994）.

[4]　Saido, T. C. et al. : Neuron, 14, 457-466 （1995）.

[5]　Selkoe, D. J. and Hardy, J. : EMBO Mol. Med., 8, 595-608 （2016）.

[6]　Jonsson, T.et al. : Nature, 488, 96-99 （2012）.

[7]　Ponte, P. et al. : Nature, 331, 525-527 （1988）.

[8]　Tanzi, R. E. et al. : Nature, 331, 528-530 （1988）.

[9]　Kitaguchi, N. et al. : Nature, 331, 530-532 （1988）.

[10]　Haass, C. et al. : Nature, 359, 322-325 （1992）.

[11]　Seubert, P. et al. : Nature, 359, 325-327 （1992）.

[12]　Qi-Takahara, Y. et al. : J. Neurosci., 25, 436-445 （2005）.

[13]　Saito, T. et al. : Nat. Neurosci., 14, 1023-1032 （2011）.

[14]　Kang, J. E. et al. : Science, 326, 1005-1007 （2009）.

[15]　Bero, A. W. et al. : Nat. Neurosci., 14, 750-756 （2011）.

[16]　Yamamoto, K. et al. : Cell Rep., 11, 859-865 （2015）.

[17]　Mawuenyega, K. G. et al. : Science, 330, 1774 （2010）.

[18]　Iwata, N. et al. : Nat. Med., 6, 143-150 （2000）.

[19]　Qiu, W. Q. et al. : J. Biol. Chem., 273, 32730-32738 （1998）.

[20]　Kidana, K. et al. : unpublished

[21]　Iwata, N. et al. : Sci. Rep., 3, 1472 （2013）.

[22]　Lambert, J. C. et al. : Nat. Genet., 45, 1452-1458 （2013）.

[23]　Griciuc, A. et al. : Neuron, 78, 631-643 （2013）.

[24]　Wang, Y. et al. : Cell, 160, 1061-1071 （2015）.

[25]　Petkova, A. T. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16742-16747 （2002）.

[26]　Lu, J. X. et al. : Cell, 154, 1257-1268 （2013）.

[27]　Sgourakis, N. G. et al. : J. Mol. Biol., 368, 1448-1457 （2007）.

[28]　Come, J. H. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5959-5963 （1993）.

[29]　Jarrett, J. T. et al. : Biochemistry, 32, 4693-4697 （1993）.

[30]　Meyer-Luehmann, M. et al. : Science, 313, 1781-1784 （2006）.

[31]　Walsh, D. M. et al. : J. Biol. Chem., 272, 22364-22372 （1997）.

[32]　Bitan, G. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 330-335 （2003）.

[33]　Lambert, M. P. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 6448-6453 （1998）.

[34]　Shankar, G. M. et al. : Nat. Med., 14, 837-842 （2008）.

[35]　Lesne, S. et al. : Nature, 440, 352-357 （2006）.

[36]　Schenk, D. et al. : Nature, 400, 173-177 （1999）.

[37]　Bard, F. et al. : Nat. Med., 6, 916-919 （2000）.

[38]　Sperling, R. et al. : Neuron, 84, 608-622 （2014）.

[39]　Reiman, E. M. et al. : Nat. Rev. Neurol., 12, 56-61 （2016）

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