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内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响

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内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响

内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响



基因疗法正在彻底改变我们治疗人类疾病的方式。任何通过修改个人基因来治疗或治愈疾病的技术都被认为是基因疗法的形式之一。这些技术可以通过几种潜在的机理实现。一个基因的致病之处可能被灭活，或被健康的版本所取代，又或者是引进一个新的基因来对抗一种疾病。基因治疗产品是通过将遗传物质引入细胞核而发挥作用的。为了引入遗传物质，科学家需要一个可将基因、核酸酶或短发夹RNA（shRNA）运送到人体细胞核的运输系统。携带这种遗传物质的运输工具被称为载体1。

应用于基因治疗的载体多种多样，可分为病毒型和非病毒型。病毒载体是目前美国食品和药物管理局（FDA）批准的基因疗法中使用的载体，而非病毒技术作为一种安全有效地将遗传物质运送给细胞以达到治疗效果的方法正在研究当中1。但与非病毒载体相比，病毒载体的基因转移效率高10倍至1000倍。然而我们应该意识到，基于非病毒载体的基因疗法安全水平高且生产成本低，具有非常高的吸引力，在未来的药物开发中具有很大的潜力5。


目前最常见的两种载体是质粒和病毒。质粒是细胞内的一种小型染色体外DNA分子，与染色体DNA物理分离，可以独立复制。最常以小型环状双链DNA分子的形式出现在细菌中，但有时也会出现在古细菌和真核生物中。在自然界中发现的质粒，往往携带着有利于生物体生存的基因，并能提供独特的优势，例如对抗生素的强烈抗性。染色体很大，并且含有在“正常条件“下生活的全部基本遗传信息，而质粒通常很小，只含有在某些压力、逆境或疾病状态下才可能发挥作用的额外基因2。另一方面，由病毒载体包装的基因可以整合到宿主细胞的基因组中并永久表达。一些类型的病毒可将其基因组插入宿主的细胞质中，但实际上并没有进入细胞，而另一些病毒会伪装成可穿透细胞膜的蛋白分子，进而很容易地进入细胞。可能发生的病毒性感染主要有两种类型，一种被称为裂解性感染，另一种为溶源性感染。裂解循环的病毒在插入其DNA后不久就迅速产生更多的病毒，随后从细胞中迸发出来，继续感染越来越多的细胞。溶源性病毒则是将其DNA整合至宿主细胞的DNA后，在对某个触发因素作出反应前可在体内存活多年。病毒会像细胞一样繁殖，并且不会对所依赖的宿主造成任何伤害，直至被某种方式触发。一旦被触发，病毒就会从宿主的DNA中释放出来，以此创造新的病毒3。


最早应用于基因治疗的病毒载体是以腺病毒为基础的，腺病毒会引起普通感冒以及人类呼吸道、肠道和眼部感染1。腺病毒以双链DNA的形式携带遗传物质。当进入宿主细胞时，这种遗传物质可短暂存在于细胞核中，因此能够像其他基因一样自由进行转录。并且，人们发现腺病毒会在患者体内引发强烈的、具有潜在危险的免疫反应，因此，使用该类型病毒进行基因治疗的研究仍在继续3。逆转录病毒、单纯疱疹病毒等其他病毒载体也已被使用。


基因治疗产品与所有人体治疗药物一样，关键在于不受内毒素污染。内毒素，也被称为脂多糖（lipopolysaccharide）或LPS，是革兰氏阴性细菌外细胞膜的一种成分。作为一种极强的热原，微量接触也会导致危险的发烧甚至败血症。此外，内毒素具有高度的耐热性，很难通过传统的方法来清除。


根据FDA管理指南，所有静脉注射药品的内毒素含量必须低于5 EU每公斤体重。但内毒素普遍存在于环境，实验室也不例外，因此，基因治疗产品在用于人体测试前进行内毒素污染测试是至关重要的。


2019年发表于《Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 》的一篇论文测试了一种从重组腺相关病毒（rAAV，一种常见的基因治疗载体）原液中去除内毒素污染的新方法。大肠杆菌通常是内毒素污染的来源，rAAV便是由大肠杆菌中分离出来的质粒DNA制备而来。8


该作者使用LAL（美洲鲎试剂）检测法来定量内毒素水平。清除rAAV原液的挑战之一是任何残留的洗涤剂都会引起毒性，还会干扰LAL检测试剂，从而导致假阴性。其原因在于掩蔽效应，即脂多糖分子被洗涤剂分子包围，无法与LAL试剂相互作用。因此，作者将洗净原液中的洗涤剂水平保持在临界值以下，以便于使用LAL精准地检测内毒素。8


这项研究强调了彻底净化基因治疗产品的重要性，以及为了去除残留的洗涤剂而进行严格的交换缓冲液冲洗的必要性。随着基因治疗的普及，科学家们仍须意识到内毒素污染潜在危险的重要性，以及需要避免由于洗涤剂残留而造成假阴性结果。8

与基于基因疗法的治疗方法一样，细胞治疗产品也需要考虑可能受到污染的问题。细胞治疗产品包括细胞免疫疗法、癌症疫苗和应用于某些治疗适应症的其他类型自体或异体细胞，如造血干细胞和成人及胚胎干细胞。基因治疗是通过蛋白载体或载体将遗传物质转移到合适的细胞中，而细胞治疗是将具有相关和必要功能的细胞转移到患者体内。4,6


 在实验室环境中培养任何一种类型的细胞时，所面临的首要问题始终是避免污染。生物污染往往是工作的重点，同时也是最容易检测和避免的。


例如，大多数细菌或真菌污染在细胞培养基中肉眼可见，并可以使用抗生素处理来预防。而支原体或其他细胞系等其他生物污染物则更难检出，但仍可通过市面上的检测试剂盒进行检测。


 化学污染与生物污染相比，受到的关注相对较少，并且更难检测和避免。其中，最隐蔽的化学污染物就是内毒素。潜在的内毒素污染源包括水、细胞培养基、血清、玻璃制品和塑料制品。正如本文在基因治疗产品部分中所提及，细胞治疗中发现的内毒素对高压灭菌和辐照都有很强的耐受力，这意味着它们可以在没有活细菌的情况下存在。其高疏水性也使其对塑料制品具有很强的亲和力，而且内毒素与活细菌不同，在细胞培养基无法通过肉眼确认。此外，内毒素不能用抗生素去除，需要使用专门的内毒素清除溶液。


采取措施避免内毒素引起的细胞培养问题，可以使研究人员对实验结果更有信心。为了帮助保持细胞培养物及其产生的疗法不受内毒素的污染，人们已提出了多种解决方法。其中，包括使用高纯度的水和低内毒素的FBS，以及使用经认证为无内毒素的塑料器皿。7 然而，除了使用纯化的原材料和试剂外，建立强大的无菌技术和灭菌程序，对减少内毒素污染的几率而言也非常重要。


无菌技术是每一位生物研究人员必备的核心技能之一。为避免出现实验伪像和潜在的细胞死亡，有必要防止细胞培养物的污染。此外，动物研究中的污染也可能导致感染或死亡。


大多数生物污染物可以使用漂白剂或乙醇等标准的消毒试剂来避免，但内毒素高度稳定，在没有活菌的情况下也能继续存在。因此，对于质控技术人员来说，保持严格的无菌技术标准操作程序至关重要。


定期更换手套是内毒素相关无菌技术的示例之一。没有经验的细胞培养技术员可能认为经常用乙醇喷洒手套就足以保持无菌状态，但乙醇可能会带来内毒素污染，因此，应为使用者制定更换手套的频率标准。

内毒素污染会极大地影响体外实验，特别是涉及免疫细胞的实验。巨噬细胞对内毒素的反应表现为IL-6分泌增加，而T细胞的表现为增殖和淋巴因子的产生增加。


受到内毒素的影响，非免疫细胞也可能会失调。传统上认为内毒素是通过CD14受体起作用的，但缺乏这种受体的细胞仍可对内毒素污染表现出强烈的反应。例如，一项研究报告指出，心肌细胞在暴露于内毒素时，会出现收缩功能障碍。其他研究也报告了CHO细胞内蛋白产生的改变以及输尿管上皮细胞中克隆效率的改变。


此外，不同的细胞系对内毒素污染的灵敏程度差异巨大。一些细胞系在内毒素低于1 ng/mL的情况下即表现失调，而其他细胞系则需要高达5000 ng/mL的浓度。也有理论认为，在培养中生长多年的细胞系（如HeLa和CHO细胞）可能随着时间的推移被自然选择为耐内毒素。基于这一点，很难确定一个广泛适用的内毒素污染安全阈值。


进行细胞培养时，购买低含量内毒素产品是至关重要的。然而，内毒素污染可能在打开试剂后产生，或在玻璃器皿/塑料器皿中转移污染，因此定期进行内毒素检测显得十分重要。


对于基因治疗和细胞治疗产品来说，鲎试剂（LAL）检测法为量化内毒素水平提供了一个兼具成本效益和高灵敏度的选择。本检测法依赖于从鲎血液中提取的蛋白，这些蛋白在内毒素存在的情况下发生凝结反应，可以对其定量以获取高度准确的内毒素水平读数。在维护我们的基因和细胞治疗的安全性方面，特别是应用于大规模生产以及重要的体外实验时，这种检测方法将会继续发挥关键作用。



◆相关产品

点击此处查看相关产品：内毒素检测系统Toxinometer® ET-7000

点击此处查看相关产品：PYROSTAR™ ES-F 系列鲎试剂

◆参考文献


1. 

‘How Does Gene Therapy Work?’ (2020 June). Genehome. Available at URL: https://www. thegenehome.com/how-does-gene-therapywork/vectors?gclid=Cj߿KCQjwkZiFBhD9ARIsA GxFX8C53pUEumd-W82HmYSL_5gBGNPtMMD rR_882PILGN_0n9vF8icjPboaAjA-EALw_wcB

 

2. 

‘Plasmid’. (2021 May 6). Wikipedia. Available at https://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid

 

3.

‘Vectors in Gene Therapy’. (2020 December 16). Wikipedia. Available at URL: https:// en.wikipedia.org/wiki/Vectors_in_gene_ therapy

4.

‘Cellular and Gene Therapy Products’. (2021 March 2). U.S. Food and Drug Administration. Available at URL:https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-genetherapy-products#:~:text=Cellular%20therapy%20products%20include%20cellular,adult%20and%20embryonic%20 stem%20cells 

5.

 Lundstrom, K. (2019). “Gene Therapy Today and Tomorrow”. National Center for Biotechnology Information, ‘Diseases’. Published online 2019 April 28. Available at URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC6631424/


6.

David, A., Professor. “How Cell Therapy differs from Gene Therapy”. Future Learn. Available at URL: https://www.futurelearn. com/info/courses/making-babies/0/ steps/23934#:~:text=Whereas%20gene%20 therapy%20involves%20the,appropriate%20 cells%20of%20the%20body.

 

7.

Easthope, E. (2020). “Five Easy Ways to Keep Your Cell Cultures Endotoxin-Free”. Biocompare, published online 2020 April 20. Available at URL: https://www.biocompare. com/Bench-Tips/563017-Five-Easy-Ways-toKeep-Your-Cell-Cultures-Endotoxin-Free/


8.

‘Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol’. (2019 December 13). Molecular TherapyMethods & Clinical Development, published online 2019 September 6. Available at URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC6804492/

Lisa Komski

Lisa Komski是FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation LAL部门的销售总经理。在化学和生命科学行业拥有近30年的职业生涯，是美国食品和药物管理局（FDA）要求和cGMP方面的业务发展专业人士。Lisa拥有生物学和医学技术学位。


  Email：lisa.komski@fujifilm.com

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。


医药生产中的肽聚糖污染

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医药生产中的肽聚糖污染

医药生产中的肽聚糖污染

肽聚糖（Peptidoglycan），又称胞壁质（Murein），是一种高分子杂聚物，由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替排列的碳骨架与肽链交联而成。肽聚糖是绝大多数细菌细胞壁的重要成分，其含量在革兰氏阳性菌中比在革兰氏阴性菌中更高。肽聚糖在革兰氏阳性菌中占据了细胞壁重量的40%，而在革兰氏阴性菌中只占1%到10%。

◆肽聚糖的生理及致病作用

肽聚糖在维持细菌的细胞完整性中起到关键作用。但肽聚糖是一种热原，如果进入血液中会引起发热。肽聚糖的发热效应可归因于它的促炎效应与免疫调节作用，以及其诱发免疫反应的能力。肽聚糖在发热效应上与细胞内毒素相似，但致热能力比内毒素要低上几个数量级。

 

◆医药生产中肽聚糖污染的风险

在肠胃外给药的药品生产中，热原（包括肽聚糖）的污染会导致严重的健康后果。虽然目前制药生产多采用无菌技术，但是依然有不少潜在污染源需要注意，如空气，水或排水系统，生产设备，产品容器以及人工操作都有机会存在污染。1

需要注意的是，部分灭菌操作无法完全消除热原。以肽聚糖来说，它在常规的灭菌操作后依然存在生物活性。而且，如果细菌发生了裂解，释出的肽聚糖可能会穿过灭菌级滤网。2

 

◆肽聚糖污染艾考糊精透析液导致无菌腹膜炎

在肽聚糖污染事件中，最为严重的是艾考糊精透析液污染事件。在2002年，有接近10倍增长的无菌腹膜炎病例报告。这一事件导致召回了数百批次，每批次数千袋艾考糊精透析液。后续调查发现，透析液中的肽聚糖污染是无菌腹膜炎风险增加的原因。3

 

◆决定肽聚糖污染检测的时机

肽聚糖在较高浓度时才显示出致热效应。由于高浓度肽聚糖对应着较高的灭菌前生物负载，因此生产商的GMP生物负载控制项目被认为能够探测肽聚糖污染。4所以，是否单独进行肽聚糖检测通常在各生产商进行风险评估后决定。

◆相关产品

SLP-HS Single Reagent Set II——肽聚糖高灵敏度检测试剂

针对肽聚糖的检测，FUJIFILM Wako可提供SLP-HS Single Reagent Set II试剂，

以高灵敏度（10 pg/mL）对肽聚糖进行检测。

医药生产中的肽聚糖污染

产品编号

产品名称

产品等级

产品规格

296-81001

SLP-HS Single Reagent Set II

高灵敏度SLP试剂盒Ⅱ（独立包装）

微生物检测用

20 tests

点击此处查看相关产品

◆参考文献

1. 

Vannefors C. Detection and removal of endotoxin in nanomaterial preparations. Umea University. 2022.

2. 

Sandle T, Robert L. Evaluating Pyrogen Contamination Risk and the Need for the MAT in Pharmaceutical Processing. Rapid Microbiology. 10 May, 2021.

3. 

Martis L, Patel M, Giertych J, Mongoven J, Taminne M, Perrier MA, Mendoza O, Goud N, Costigan A, Denjoy N, Verger C, Owen WF Jr. Aseptic peritonitis due to peptidoglycan contamination of pharmacopoeia standard dialysis solution. Lancet. 2005;365(9459):588–594.

4. 

Akers JA, Duguld J, Gross D, Hussong D, McCullough K, Mello R, Tidswell E, Tirumalai R. Functional Challenges for Alternative Bacterial Endotoxins Tests. Part 4: Beyond Recombinant Reagents Introduction. American Pharmaceutical Review. January 21, 2022.

本文译自FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation 于2023年3月发布的Peptidoglycan contamination in pharmaceutical manufacturing一文，有删改。

透析液或其原料污染引起的腹膜炎

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透析液或其原料污染引起的腹膜炎

透析液或其原料污染引起的腹膜炎

肠外药物已成为治疗多种疾病所不可或缺的药物，并极大地改善了患者的治疗效果。然而，它们的使用可能会带来污染风险，从而导致感染。假设患者在接受腹膜透析时，腹膜透析液或透析液原料受到污染，可能会引起腹膜炎感染1。

腹膜炎是腹壁和大部分腹腔器官组织的炎症。它的病因多种多样，包括感染、受伤或其他疾病。腹膜炎患者通常会出现剧烈疼痛、腹部肿胀、发烧和体重下降等症状1，2。

腹膜透析是一种治疗终末期肾病的方法，也是血液透析的替代疗法。但腹膜炎可能会影响腹膜透析的长期有效率。因此，保持溶液无菌和使用无菌操作来预防腹膜炎，并及时进行治疗，是提高腹膜透析效果的关键策略1。

 

◆透析相关性腹膜炎的微生物学原因

可能引起透析相关性腹膜炎的微生物种类繁多，包括凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、肠球菌属、棒状杆菌、肠道革兰阴性杆菌（包括大肠杆菌、肠杆菌、克雷伯氏菌、柠檬杆菌和变形杆菌属）、非发酵革兰氏阴性杆菌（如假单胞菌、链霉单胞菌和不动杆菌）、真菌和分枝杆菌。此外，透析相关性腹膜炎也可能是多菌型或培养阴性1。

 

◆内毒素在透析相关性革兰氏阴性细菌性腹膜炎中的作用

在革兰氏阴性菌引起的腹膜炎中，内毒素作为致病因子发挥着重要作用。革兰氏阴性细菌含有脂多糖（内毒素），并会在细菌裂解时释放。当内毒素进入人体时，会引起严重的热原反应，包括发烧和发炎。由于内毒素污染的严重后果，肠胃外给药和医疗器械都要经过严格的内毒素检测。其中使用鲎试剂的内毒素检测法已被确立为内毒素检测的黄金标准，其灵敏度和特异性都非常高，并且可进行定性和定量检测。

 

◆肽聚糖污染透析液引起的无菌性腹膜炎

肽聚糖污染可能是引起透析相关性腹膜炎的另一原因。肽聚糖也是一种热原，但其致热能力比内毒素要低上几个数量级。但值得注意的是，肽聚糖存在于大多数细菌细胞壁中，尤其是革兰氏阳性细菌。2002年，无菌性腹膜炎的发病率增长了十倍，其原因是艾考糊精透析液受到了肽聚糖的污染。这也提高了人们对透析液肽聚糖污染的潜在风险的认识3。

 

◆重点预防与透析相关的腹膜炎

为降低透析性相关腹膜炎的风险，无菌技术和严格的透析液污染检测是必不可少的。因此，透析液或透析液原料的生产商必须遵守药典的无菌标准。在透析液或透析液原材料的生产过程中，一般会对内毒素进行常规、严格的检测，但很可能会忽视肽聚糖污染的风险。

由FUJIFILM Wako开发的SLP试剂，可检测肠外药物（包括透析液和透析液原料）中的肽聚糖污染。

◆相关产品

SLP-HS Single Reagent Set II——肽聚糖高灵敏度检测试剂

针对肽聚糖的检测，FUJIFILM Wako可提供SLP-HS Single Reagent Set II试剂，

以高灵敏度（10 pg/mL）对肽聚糖进行检测。

透析液或其原料污染引起的腹膜炎

产品编号

产品名称

产品等级

产品规格

296-81001

SLP-HS Single Reagent Set II

高灵敏度SLP试剂盒Ⅱ（独立包装）

微生物检测用

20 tests

点击此处查看相关产品

◆参考文献

1. 

Salzer WL. Peritoneal dialysis-related peritonitis: challenges and solutions. Int J Nephrol Renovasc Dis. 2018;11:173-186.

2. 

NCI Dictionary. Peritonitis. Accessed May 18, 2023. Available at: https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/peritonitis

3. 

Martis L, Patel M, Giertych J, Mongoven J, Taminne M, Perrier MA, Mendoza O, Goud N, Costigan A, Denjoy N, Verger C, Owen WF Jr. Aseptic peritonitis due to peptidoglycan contamination of pharmacopoeia standard dialysis solution. Lancet. 2005;365(9459):588-94.

生物药残留及污染检测专题

发表于由

生物药残留及污染检测专题

◆生物制药残留DNA提取试剂盒（碘化钠法）


残留DNA提取试剂盒遵照中国药典记载的碘化钠法，适用于疫苗和治疗用生物制品所含宿主细胞残余DNA的提取。

残留DNA提取试剂盒可以提取样品中含有的极微量的DNA，回收率较高。DNA的提取操作时间为60-90 min。提取的DNA可以通过qPCR进行定量。

生物药残留及污染检测专题 生物药残留及污染检测专题

原理

1.　使样品中的蛋白质和脂质溶于碘化钠和N-月桂基肌氨酸钠；

2.　异丙醇与糖原选择性地共沉淀DNA。

产品列表

产品编号

产品名称

产品规格

292-81101

DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method 

(Sodium Iodide Method)

残留DNA提取试剂盒（碘化钠法）

50 tests

◆蛋白A ELISA试剂盒

蛋白A ELISA试剂盒采用高灵敏度和可重复性的夹心测定法，用于定量检测单克隆抗体制剂中的蛋白A残留。这种经过广泛验证的ELISA试剂盒可以高效检测天然和重组蛋白A构建体，回收率高达100％。

生物药残留及污染检测专题

A: Natural Protein A from S. aureus (Millipore), n=9;

B: Recombinant Protein A from E. coli (Repligen), n=9;

C: Recombinant Cys-Protein A from E. coli (GE), n=12;

D: Recombinant alkaline-resistant Protein A variant from E. coli (MabSelet SuRe from GE), n=12;

途中数据的统一标准差为+/-1。

特点


●　高灵敏度的检测，在纯化的人的单克隆抗体（mAb）的生物制剂中，能检测低至9.01 pg/mL的蛋白A残留物；

●　能识别多种蛋白A结构，保证了结果的准确性；

●　高通量检测，三小时内能得到最多37个样本检测结果，每个样本两次重复；

●　比起其他方法，性价比更高，每次检测的成本更低；

●　可对单克隆抗体的制剂中的蛋白A异构体进行污染分析与检测

产品列表

产品编号

产品名称

产品规格

ADI-900-057

Protein A ELISA kit

蛋白A酶联免疫试剂盒

96 wells

◆宿主细胞蛋白残留检测试剂盒

生物制药常以细胞培养表达系统来生产和纯化，会产生内源蛋白形式的污染，即宿主细胞蛋白（host cell proteins， HCP）。HCP杂质可引发免疫反应，因此必须尽量控制生物制品中的污染并在进行监测。Enzo提供高灵敏的ELISA试剂盒，用于检测以CHO，E. Coli和HEK293T表达系统生产的生物制品中的HCP。


生物药残留及污染检测专题

特点


●　适用于生物制品等样品

●　灵敏度高，检测下限低至10 ng/mL（CHO），30 ng/mL（E. Coli）或37 ng/mL（HEK293T）

●　3小时可以得到高通量检测的结果

产品列表

产品编号 产品名称 包装 检测范围
ENZ-KIT127-0001 E. Coli host cell protein ELISA kit
E. Coli 宿主细胞蛋白 ELISA试剂盒		 96 wells 3-810 ng/mL
ENZ-KIT128-0001 CHO host cell protein ELISA kit
CHO宿主细胞蛋白ELISA试剂盒		 96 wells 3-810 ng/mL
ENZ-KIT162-0001 HEK293T host cell protein ELISA kit
HEK293T宿主细胞蛋白ELISA试剂盒		 96 wells

37-27000 ng/mL

◆重组蛋白酶残留检测试剂盒


本系列的试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术，测定重组蛋白药物或融合表达工艺中使用蛋白酶酶切，以及对蛋白组学研究中使用的蛋白酶酶切样品中蛋白酶微量残留进行定量。

生物药残留及污染检测专题

产品列表


产品编号 产品名称 包装 检测范围
MDRK0101 RTrypsin ELISA Kit
重组胰蛋白酶检测试剂盒		 96 wells 1-1000 ng/mL
MDRK0201 RKex2 ELISA Kit
重组双碱性氨基酸内肽酶检测试剂盒		 96 wells 2-2500 ng/mL
MDRK0301 RCPB ELISA Kit
重组羧肽酶B检测试剂盒		 96 wells 0.2-250 ng/mL
MDRK0401 RLys-C ELISA Kit
重组赖氨酰胺内肽酶检测试剂盒		 96 wells 1-4000 ng/mL

如何高效解决植物组培污染问题的研究进展

发表于由

植物组织培养广泛应用于转基因研究、作物育种、观赏花卉进出口、中药材生产等领域，但组培过程中的种苗污染问题，尤其是真菌和内生菌的污染一直是广大科研工作者所关心和头疼的问题。上海金畔生物科技有限公司代理的美国Plant Cell Technology（简称PCT）专门为植物组织培养而研发的专利产品——PPMTM，可有效抑制由于空气、灭菌不彻底、交叉污染、外植体消毒等各种原因导致的细菌、真菌和农杆菌污染。PPMTM是一种热稳定的抗菌剂，在合理的使用剂量下，不会对植物生长产生任何影响。并能广泛适用于绝大多数被子植物和裸子植物。

l  PPMTM相对于传统抗生素具有以下优势：

  • PPMTM广泛抑制和清除细菌和真菌的污染，并防止真菌孢子的萌发。
  • PPMTM是通过抑制多种酶的活性而达到抑菌效果，从而能避免耐药突变体的发生。
  • PPMTM具有热稳定性，无需过滤灭菌，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果。
  • PPMTM用量低，性价比高。

如何高效解决植物组培污染问题的研究进展

PCT自1995年开始着力于PPMTM的研究，迄今为止累积50多篇已发表文献，除此之外更有来自全世界植物研究者使用心得反馈。下表汇总了部分客户的使用反馈，帮助广大科研人员更深入了解PPMTM ，以便有效解决植物污染问题。

PLANT NAME

C(mol/L)

TISSUE TYPE

RESULT / COMMENTS

Potato

1ml/L

Shoot/Callus

used 1ml/l in our culture media to avoid contaminants

Vitis (Grape)

15mL/L

Nodal Segments;

Helpful to control endophytic bacteria in Vitis shoots taken from potted plants and introduced to tissue culture for several weeks with minimal/no toxic effects

Petunia hybrida

5mL/L

Upper young axillary buds

1. HPLC revealed that axillary buds from upper young nodes absorbed significantly more PPM compared with those from the lower nodes. 2. Indexation indicated successful eradication of bacterial contaminants from upper young axillary buds after vacuum-infiltration with 5 ml l−1 PPM

T. modesta

1mL/L

The bulbs of T. modesta

The contamination was only by fungi because the bacterial contamination could be efficiently controlled with streptomycin and PPM as biocides.

orchid

1mL/L

leaf

Great, five star product!

Citrus

4mL/L

Shoot / Tip

eliminates fungus, does not seem to have effect on plant

Wheat

0.5ml/l

wheat embryo culture

we use in regeneration media and sometimes to kill the fungi in regenerated plants

请点击下面链接查看更多物种PPMTM使用建议：

https://www.plantcelltechnology.com/how-people-are-using-ppm/

l 关注公众号即可获取50多篇PPMTM已发表文献

扫描文末二维码关注PPM中国一级代理上海金畔微信公众号（微信号：www.jinpanbio.cn），发送关键词“PPM文献”，即可获得相关文献资料。

如果您还想了解更多植物学相关产品信息，欢迎随时拨打PPM中国一级代理上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录官网www.jinpanbio.cn查询订购。

如何应对植物组培过程中的污染问题？新型高效方法值得推荐

发表于由

植物组织培养是20世纪初发展起来的一门新兴技术，随着这项技术的日益完善，其应用也越来越广泛。但是在组织培养过程中，常常会遇到污染问题使实验无法进行下去，甚至导致整个实验失败，给科研和工厂化生产带来损失。

污染是指在植物组织培养过程中，培养基和培养材料滋生杂菌，最终导致培养失败的现象。常见的污染类型包括：由霉菌引起的真菌性污染、多由外植体带菌引起的细菌性污染、长期多次继代引起的内生菌污染以及农杆菌污染等。面对植物组培污染问题，我们通常采取在培养基中加入适量的抗生素（如青霉素、链霉素、氯霉素等）来抑菌。但是抗生素一般不稳定，遇酸、碱或加热都易分解而失去活性。而且单一抗生素抑菌容易产生抗药性，一旦停止使用，污染率就会显著上升。同时，高浓度的抗生素会影响植物的生长。

如何应对植物组培过程中的污染问题？新型高效方法值得推荐图片1

为解决上述问题，我们推荐专业植物组培高效广谱性抗菌剂PPM™，它可以有效预防和清除由于空气、灭菌不彻底、交叉污染、外植体消毒等各种原因导致的植物组培苗的真菌、细菌、内生菌和农杆菌污染。可以加入培养基高温灭菌；而且在合理使用剂量下，不会对植物的生长产生任何影响。

如何应对植物组培过程中的污染问题？新型高效方法值得推荐

      使用方法如下：

1、      常规污染预防用量：

一般推荐使用浓度为0.05%-0.2%（1L培养基中加入0.5-0.75ml PPM™）；愈伤增殖， 器官形成，胚性组织发育等使用浓度为0.05%-0.075%。

2、      植物内生菌污染处理：

      种子：PPM™不推荐用于直接处理含有大量的细菌或真菌孢子的种子灭菌；对于种子离体萌发，建议先采用传统方法消毒，然后置于含 2-3%PPM™的全培养基础盐溶液中，轻轻搅拌4-12小时，此过程千万不能添加Tween20和调节pH，处理完成以后直接插入含有 PPM™(草本植物0.05-0.1%，木本植物0.2%)的培养基里进行培养。

      外植体：：以 1cm 外植体为例，将外植体置于含 4-5%PPM™的全培养基础盐溶液中，轻轻搅拌4-12小时，此过程千万不能添加 Tween20和调节pH，处理完成以后直接插入含有PPM™(草本植物 0.05-0.1%，木本植物0.2%)的培养基里进行培养。

      块茎，球茎和鳞状物的观赏植物样本：将其整体放入消毒剂中搅拌消毒处理以后， 用水冲洗干净，将材料切成薄片，置于含 4-5%PPM™的全培养基础盐培养液中，轻轻搅拌4-12小时，此过程千万不能添加Tween20 和调节pH，处理完成以后无需冲洗直接插入含有 0.1-0.2%的PPM™的培养基里进行培养。

3、      如果厚的外植体、污染严重的植株、种子等样本经过以上处理仍得不到理想效果，可尝试以下操作：

      将材料浸泡在水中持续搅拌处理(松软组织搅拌1小时，硬实组织搅拌2小时)

      将材料在含50%的PPM™全培养基础盐溶液中搅拌处理5-10分钟，此过程千万不能添加 Tween20 和调节pH

      无需冲洗，将处理过的材料直接加入到培养基中即可。对于真菌污染，可在培养基中加入适当浓度的PPM™。对于真菌细菌混合性污染，建议在培养的第一个月的培养基中加入0.05%-0.2%的PPM™

4、      严重污染材料污染去除与抢救（重污染不超过一周）

      将污染的材料至于流水中用软刷刷洗，然后置于含50% PPM™的无菌水溶液中搅拌5-15分钟；对于细菌或者混合性污染，建议使用 100% PPM™与 0.6g/L 的柠檬酸无菌水溶液按 1：1 混合的低 pH(2.8-3.2)的酸性溶液处理

      处理后的材料无需清洗，直接插入含0.05%-0.25的PPM™的培养基中培养至少一个月以上，其中前10天需要弱光培养

5、      农杆菌的去除

共培养以后，将样本用无菌水清洗，然后将样本浸没在 100% PPM™（补充4X的培养基盐溶液）中处理2分钟，取出后用无菌纸吸干后并置于常用抗性培养基中培养，3 周后，更换到只含有0.05%-0.075% PPM™(无常用抗生素)的培养基中培养。

如何应对植物组培过程中的污染问题？新型高效方法值得推荐图片2

      注意事项：

      在所有 PPM™消毒处理外植体的过程中，尽量保证容器的体积足够大，并使外植体材料所有面积与含PPM的处理溶液充分接触，以保证消毒效果；

      如果外植体出现高度氧化现象，不要扔弃，大约50%的外植体在 4-6 周内即可恢复

      50% PPM™ 的处理溶液可以重复使用但是不推荐，因为使用次数和效果受外植体的体积与接种密度的影响。将50% PPM™的处理溶液保存在4ºC可适当延长其活性，一般可使用不超过10次。如果必要，建议配制2份50% PPM™溶液，一份用于外植体消毒内生菌污染，另一份用于消除“培养过程中”的轻度污染材料抢救，第二份溶液在每次处理过后需要用 0.2mm滤器过滤

      如果50%PPM™溶液处理效果不理想，可采用100%PPM™溶液进行处理，处理方法相同，但使用次数不得超过10次。

      产品信息：

如何应对植物组培过程中的污染问题？新型高效方法值得推荐图片3

产品已发表文献：

  1. Miyazaki J, Tan BH, Errington SG.  Eradication of endophytic bacteria via treatment for axillary buds of Petunia hybrida using Plant Preservative Mixture (PPMTM). PCTOC. 2010;102(3):365-372.
  2. Miyazaki J, Tan BH, Errington SG, Kuo JS. Bacterial endophyte in Macropidiafuliginosa: its localisation and eradication from in vitro cultured basal-stem callus. Aust J Bot. 2011;59(4):363-368.
  3. Lata H, Chandra S, Khan IA, ElSohly MA. Propagation through alginate encapsulation of axillary buds of Cannabis sativa L. — an important medicinal plant.  Phys and Mol Biol of Plants. 2009;15(1):79-86. 4. Greer SP, Rinehart TA.  Dormancy and Germination In Vitro Response of Hydrangea macrophylla and Hydrangea paniculata Seed to Light, Cold-Treatment and Gibberellic Acid. J. Environ. Hort. 2010;28(1):41–47.
  4. Greer SP, Rinehart TA.  Dormancy and Germination In Vitro Response of Hydrangea macrophylla and Hydrangea paniculata Seed to Light, Cold-Treatment and Gibberellic Acid. J. Environ. Hort. 2010;28(1):41–47.
  5. Moghaddam S, et al. Optimization of an Efficient Semi-Solid Culture Protocol for Sterilization and Plant Regeneration of Centellaasiatica (L.) as a Medicinal Herb. Molecules. 2011;16(11): 8981-8991
  6. Çolgecen H, Koca U, Toker G. Influence of diff erent sterilization methods on callus initiation and production of pigmented callus in ArnebiadensifloraLedeb. Turk J Biol. 2011; 35:513-520
  7. Pouvreau J, et al. A high-throughput seed germination assay for root parasitic plants. Plant Methods 2013;9:32
  8. Marecik R, Bialas W, Cyplik P, Lawniczak L, Chrzanowski L. Phytoremediation Potential of Three Wetland Plant Species Toward Atrazine in Environmentally Relevant Concentrations. Pol. J. Environ. Stud. 2012;21(3):697-702
  9. Pérez Flores J, Aguilar Vega ME, Roca Tripepi R. Assays for the in vitro establishment of Swietenia macrophylla and Cedrelaodorata. Rev. Colomb. Biotecnol. 2012;14(1)
  10. Nesterenko-Malkovskaya A, Kirzhner F, Zimmels Y, Armon R. Eichhorniacrassipes capability to remove naphthalene from wastewater in the absence of bacteria. Chemosphere. 2012;87(10):1186-1191.
  11. Kieffer M, Fuller MP. In Vitro Propagation of Cauliflower Using Curd Microexplants. Meth Mol Biol. 2013;994:329-339.
  12. Kodym A, Temsch E, Bunn E, Delpratt J. Ploidy stability of somatic embryo-derived plants in two ecological keystone sedge species (Lepidospermalaterale and L. concavum, Cyperaceae). Aust J Bot. 2012;60(5):396-404.
  13. Peña-Ramírez YJ, et al. Induction of somatic embryogenesis and plant regeneration in the tropical timber tree Spanish red cedar [Cedrelaodorata L. (Meliaceae)]. PCTOC. 2011;105(2):203-209.
  14. Haddadi F, Adb Aziz M, Saleh G. Abd Rashid A, Kamaladini H. Micropropagation of Strawberry cv. Camarosa: Prolific Shoot Regeneration from In Vitro Shoot Tips Using Thidiazuron with N6-benzylamino-purine. HortScience. 2010;45(3):453-456.
  15. Jimenez VM, Castillo J, Tavares E, Guevara E, Montiel M. In vitro propagation of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot proliferation. PCTOC. 2006;86:389–395.
  16. Compton ME, Koch JM. Influence of Plant Preservative Mixture (PPM) on adventitous organogenesis in Melon, Petunia, and Tobacco. In Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant. 2001;37:259-261

上海金畔生物科技有限公司是美国Plant CellTechnology中国代理，为用户提供完善的技术支持与售后服务。

RNase污染清除与预防

发表于由

在RNA的生物试验中，会涉及到RNase的污染及RNA降解的预防问题，例如在进行mRNA的反转录的RT-PCR及Real Time PCR过程；RNAi相关实验，例如用载体表达shRNA，可是涉及RNA合成，后续的RNA纯化，都需要求严格消除RNAse污染以避免RNA降解。少量的RNase就可以严重破坏实验结果。实验用到的试剂和耗材，指管和移液枪头都要求是无RNase污染的，或者DEPC处理过的。戴手套，不小心接触各种表面后，比如操作台面、桌面，冰箱把手等常用仪器，都要勤换手套，防止RNase污染所导致的RNA降解。
德国知名生化试剂公司AppliChem推出的RNase-ExitusPlus™ RNase（货号A7153）清除试剂有效地解决RNAse污染问题，预防RNA的降解。

RNase污染清除与预防

RNase-ExitusPlus™ 是一种非碱性、无腐蚀性且无致癌性的新型RNase清除液。它对RNase污染物具有很好的清除性能，任何物体表面，包括微量离心管中内部都可以应用。

RNase-ExitusPlus™ 特点

  1. 催化组份的协同作用，导致蛋白质和RNase分子非常快速的失活，对RNase非酶促降解。

  2. 所有组分， 均易生物降解，对人类无害无毒。

  3. 不使用任何刺激性的酸碱性物质，不会腐蚀设备和材料。

  4. 试剂中含有少量酒精，不产生有毒气体。

  5. 操作简单，充分的喷洒表面，在完全干之前（10 至 15 分钟）擦去，此后无需再用无菌水清洗。

  6. 反应温度升至50 ° C 以上，可提升反应效率与活性。

RNase-ExitusPlus™ 使用说明

  1. 移液器的清洁：按照移液器的说明书，将移液器的杆，垫片，以及旋钮等部件拆下来，浸泡到清洁剂中1分钟左右，然后取出，用水进行彻底冲洗，待干了之后重新进行组装；
  2. 清除实验室表面污染物：应用RNase-ExitusPlus™直接喷洒于实验室表面需要清洁的地方，用干纸进行擦拭或者用沾湿了的纸进行擦拭；
  3. 清除实验仪器的污染物：用RNase-ExitusPlus™喷洒在纸巾上，然后对仪器的表面进行擦拭或者直接用清洁剂将纸巾完全浸湿，对仪器微小的部件进行清洁或者直接把小部件浸泡于清洁液中，10分钟后用水清洗或者用干净的纸擦干；
  4. 清洁塑料或者玻璃的实验室用品：用足够量的清洁液将所需要清洁的塑料或者玻璃器皿浸泡在里面，一段时间后，倒掉废液，然后用蒸馏水对器皿彻底的冲洗至少2遍.

Applichem核酸污染清除试剂活性测定试纸

发表于由

核酸污染清除试剂活性测定试纸

货号 ：A9411.0025

品名 ：ExitusPlus Activity Test（核酸污染清除试剂活性测定试纸）

规格 ：25Tests（25条试纸）


背景介绍：

随着分子生物学的发展，PCR技术以其操作方便，灵敏度高，所以被广泛使用到分子遗传各种研究中，但是也正由于其高灵敏度，使得微量的核酸污染便可造成PCR假阳性结果。裸露的核酸片段、气溶胶中的核酸污染如果得不到有效抑制和清除，就会导致材料，时间，人力和财力的大量浪费和损失。为克服核酸污染这一急需解决的问题，德国AppliChem研发了具有特色的核酸污染清除试剂–DNA-ExitusPlus™ ，这是一种无腐蚀、无致癌性的高效核酸污染清除溶液，该产品可将裸露的核酸降解至无法作为扩增模板的小片段，并无法恢复，从而消除了PCR过程中由于非目的核酸模板而导致的假阳性扩增，收到了广大客户的一致好评，作为实验方法发表于《Nature》（产品货号A7089和A7409）。

Applichem核酸污染清除试剂活性测定试纸

在大量订购和使用核酸污染清除试剂–DNA-ExitusPlus过程中，客户经常会遇到以下问题：

1， 由于大量订购产品，部分情况下手中的核酸污染清除试剂（A7089和A7409）未在标定效期内用完， 是否还可以继续使用？（产品是否还具有核酸污染清除能力？）

2， 核酸污染清除试剂（A7089和A7409）用于浸泡耗材时是否可以重复利用？

为了保证客户购买的核酸污染清除试剂更好的利用，AppliChem出品了核酸污染清除试剂活性测定试纸（货号A9411） 以帮助客户解决上述问题。

Applichem核酸污染清除试剂活性测定试纸

使用方法：

取待测溶液少许，试纸浸入30秒，取出试纸比色：

 

  1. 比对结果显示在“sufficient efficacy”区间的即为有活性，可以继续使用。
  2. 对比结果显示在Frequently re-test区间为临近活性丧失，可以使用，但是要每2天测一次。
  3. 对比结果显示在insufficient efficacy区间为活性已丧失无法继续使用

Applichem核酸污染清除试剂活性测定试纸


植物组培抗菌保护剂Plant Preservative Mixture（PPM™）

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植物组培广泛应用于植物科研：如模式植物，作物育种等；工厂化生产：如观赏花卉植物，中药材生产，园林园艺等，但是组培过程中种苗的污染，尤其是真菌和内生菌的污染是广大工作者十分头疼的问题。美国Plant CellTechnology(简称PCT)专门为植物组织培养而研发的专利产品——Plant Preservative Mixture(简称PPM™,专利号5750402），可以有效抑制由于空气、灭菌不彻底、交叉污染、外植体消毒等各种原因导致的植物组培苗的细菌、真菌和农杆菌污染。

产品特点：

1. 无毒性——PPM是一种热稳定的抗菌剂，用于植物组织培养中植物的微生物污染防治与清除。在合理的使用剂量下，不会对植物的生长（如种子萌发，愈伤增殖、再生等）产生任何影响，可视为培养基标准配方成份；

2. 作用效果好——PPM 主要用于预防和消除来自空气、水源或者人体接触等外界因素导致的植物组培过程中的微生物污染，同时，对于植物内生菌也同样具有非常好的抑制效果；

3. 适用物种广泛——PPM广泛适用于绝大多数被子植物和裸子植物；

4. 使用方便——PPM具有热稳定性，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果，使用更加方便；

5. 性价比高——PPM相对于常规抗生素而言，用量低，性价比更高。

相对抗生素的优势：

1. PPM 能广泛抑制和清除细菌和真菌的污染，并防止真菌孢子的萌发；

2. PPM 是通过抑制多种酶的活性而达到抑菌效果，从而能避免耐药突变体的发生；

3. PPM 具有热稳定性，无需过滤灭菌，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果，使用更加方便；

4. PPM 性价比更高，可更加广泛的应用于更多的科学研究、作物育种、组培苗工厂化生产中。


使用方法：

以下使用指南是针对大多数情况下的常规使用说明，特殊情况可做适当调整。

植物组培抗菌保护剂Plant Preservative Mixture（PPM™）

*说明：MS 盐溶液是泛指，如样本的培养基盐溶液不是MS 盐，以具体适用的培养基盐溶液为准；

产品订购信息：

植物组培抗菌保护剂Plant Preservative Mixture（PPM™）

植物组培微生物污染控制新能手 PTC3

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植物组培微生物污染控制新能手 PTC3 植物组培广泛应用于植物科研：如模式植物，作物育种等；工厂化生产：如观赏花卉植物，中药材生产，园 林园艺等，但是组培过程中种苗的污染，尤其当规模扩大后，污染控制，尤其是真菌的污染清除和抑制是广大工 作者最头疼的问题。 作为全球著名且专业的植物组培产品供应商美国PhytoTechnology Laboratories (简称Phytotech或PTL)专门为 植物组织培养的污染和微生物抑制和清除而研发的专利产品——PTC3 TM(Plant Tissue Culture Contamination Control)，可以有效抑制由于空气、灭菌不彻底、交叉污染、外植体消毒等各种原因导致的植物组培苗的细菌、 真菌和农杆菌污染清除与预防。

相对传统抗生素，如头孢、羧苄等抑制微生物污染，PTC3具有非常明显的优势：

 广谱：能广泛抑制和清除细菌和真菌污染，并防止真菌孢子的萌发

 使用方便：热稳定，无需过滤灭菌，可以直接加入培养基一起高压灭菌，或者无需灭菌直接添加使用

 效果稳定：通过抑制微生物多种酶活而达到抑菌效果，从而避免耐药突变体产生

 用量小：按照 0.02-0.2%(v/v)添加，100ml 的 PTC3可用于 50-500L 体积培养基

培养过程中无添加抗菌剂（左侧）和添加 PTC3（右侧）的抑菌效果对比 www.jinpanbio.com 021-50837765 上海金畔生物科技有限公司 Email:customer@jinpanbio.com 北京：021-50837765 上海： 021-63599871 广州：020-38105753 成都： 028-64600404 全国客服热线：021-50837765 培养过程中无添加抗菌剂、市场同类产品和 PTC3 的对常见 3 种污染微生物的抑制效果（抑菌剂均按照 0.2 v/v%添加），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的生长率在含有 0.2% (v/v) PTC3 或同类 竞争产品的 MS 培养基均受到明显的抑制 PhytoTech 是美国著名的植物培养基供应商，公司发展至今已成为世界顶级植物研究领域的试剂与原料供应 商。 PhytoTech 是国际最早通过 ISO 9001:2000 质量体系认证的植物组织培养基公司，所有产品均按照 cGMP 标准生产和包装，所有产品的生产过程均受到严格的质量控制，每个产品的物理学、化学、生物学特性都经过了 严格检测，并经过组织培养测试。

除 PTC3以外，还有如下热销产品：

 预混培养基：MS，B5，N6，NB，WPM，LS 等百余种

 凝胶剂：琼脂，结冷胶，卡拉胶等

 抗生素与抗性筛选剂：特美汀，潮霉素 B，草铵膦，草甘膦，G418，头孢，羧苄等

 激素：玉米素，赤霉素，茉莉酸甲酯，IAA，IBA，NAA，2ip，6BA，独脚金内酯等

上海金畔生物科技有限公司自 2006 年开始将 Phytotech 引进中国，是目前 Phytotech 的中国区独家一级代理商， 10 多年优质的产品服务体验得到了国内广大用户的认可。目前在国内，我们备有大量现货，方便大家便捷订购和使用，专业优质的技术服务让您订购无忧。