海洋毒素研究的乐趣
东北大学名誉教授、一般财团法人日本食品分析中心顾问
安元健
受FUJIFILM Wako之邀，笔者获得了介绍自己研究的课题——海洋生物毒素的机会。海洋生物毒素拥有丰富多彩的面孔，阐明其化学结构和药理作用、针对其在食品卫生和公共卫生方面的措施、阐明其生态和生物学意义等研究都有着重要意义。虽然笔者最为关注的是“毒素的化学结构”，但是寻找 “毒素的产生者”的过程也十分有趣。就像微生物产生毒素，然后通过食物链扩散一样，研究对象的毒素也相互联系在一起。笔者将在本文中向大家科普介绍天然海洋毒物，也会介绍与笔者相关的个人经历。
◆雪卡毒素（Ciguatera）
在笔者高三最后的暑假期间，与渔民谈论的“醉鱼”现象是笔者“海洋毒素研究”的起点。
本着享受暑假的想法，在咨询了好友后，笔者来到了冲绳北边一个偏远的小岛——伊平屋岛。虽然每天都在海里游泳和钓鱼，但是不时会为了了解潮汐等的海况去拜访渔民。每次去拜访渔民所听到的关于鱼的种类和习性的话题都让笔者觉得十分的有趣。其中，关于“醉鱼”的话题让笔者产生了浓厚的兴趣。首先，一般中毒时会使用“中毒了”来表达而不会用“醉”的说法。而用“醉鱼“的“醉”表达了由于食用鱼后产生了身体疲乏、关节疼痛，类似于宿醉一样的症状，因而用“醉”来表达。更奇妙的是，如果这时候触碰水的话，会如触电一般地疼痛。中毒不仅限于特定的鱼类，食用许多种类都会“醉“且与鱼类新鲜度方面没有问题，不过由于该现象具有极地性，毒化区域会不时移动。后来，笔者了解到这种在加勒比海，印度洋和太平洋的珊瑚礁中多发的特异性中毒为“雪卡毒素”中毒。当许多前往新大陆的船只停泊在加勒比海地区时，就会出现多起船员食用鲜鱼引起的中毒事件。由于这种现象一直不清楚产生的原因，因此自哥伦布时期以来就一直被当做是神秘的中毒现象。在第二次世界大战期间，由于在太平洋的日美士兵大部分都中毒了，这件事才引起了多方的关注。
a.毒化原因
含有毒素的鱼没有像河豚一样的物种特异性，而且由于个体差异和地域差异较大，所以会被认为是食物来源中毒。但产生毒素的生物和毒素的化学性质却都是未知的。自1950年代后期以来，法属波利尼西亚为了建立旅游基地或军事基地不断地开发小岛，伴随小岛的开发，中毒事件呈爆发式增长。因此，在冲绳有调查“醉鱼”经验的笔者被聘任为WHO的顾问派遣至法属波利尼西亚。由于假设为食物来源的毒素，所以研究人员首先对鱼胃肠道的内容物进行了显微镜观察和毒性测试，发现出现在胃中的圆盘状单细胞生物与鱼的毒性呈现高度相关性。在毒性特别高的甘比尔群岛，由于建设跑道和开设航线进行了土木工程，工程中的沉积沙土杀死了大部分珊瑚，并被石灰藻覆盖。在这些石灰藻表面覆盖着生长了许多刚才所提到的圆盘状的生物（图1）。
这种生物是一种称为沟鞭藻的单细胞生物中的新属新种。根据采集地、圆盘状的形状及其毒性，我们将其命名为Gambierdiscus toxicus。从海底采集的G. toxicus 和从有毒鱼中提取和纯化的成分在NMR的比较下，可以判断它们具有相同的基本骨架，因此可以将其鉴定为雪卡毒素的来源（Ciguatoxin、CTX）。由于采集到的菌株在培养中没有产生CTX，因此为了获得有毒菌株，笔者再次回到了法属波利尼西亚。虽然最终获得了有毒菌株，但期间一共花费了8年。G. toxicus分布虽然广泛，但是目前世界上已知的CTX生产菌株仅有少数，这给培养生产毒素造成了障碍。
覆盖在石灰藻上的G. toxicus
图1. 在石灰藻上密集生长的G. toxicus
b.化学结构
虽然大部分的鱼类都出现有毒现象，但处在食物链顶端的是海鳝。它的内脏会储存高浓度的CTX，因此最适于做为提取毒素的对象。由于个体差异和地域差异较大，花费了10年才收集到4吨的有毒个体。最终从124 kg内脏中获得了0.4 mg的CTX。然后利用NMR对化学结构进行了表征，如图2所示。CTX具有不同的CTX1B型和CTX3C型，两者有着不同基本骨架，双方都是在食物链传递过程中进行代谢性修饰。作为LC-MS定量用的标准品，研究人员使用qNMR定量了5种组分，但无法确保有足够的数量可以推向市场，所以根据需求提供给相关组织。此外，研究人员还通过LC-MS进行定量，成功检测出鱼肉中毒素含量为0.01 ppb这一严格的基准值。
平间正博东北大学名誉教授的团队已实现了全合成CTX1B和CTX3C的壮举。另外，大阪府立大学円谷健教授的团队，使用毒素分子两端的部分结构的合成产物制作了双抗体夹心法ELISA试剂盒。
c.作用
CTX与电压依赖性Na+ 通道结合，并抑制从去极化返回到极化的状态。CTX1B的化学结构如图2所示。其小鼠腹膜内给药的最小致死量（0.4 μg/kg）是河豚毒素最小致死量的25倍以上。推算口服摄入的最小发病量为人成人的7 ng。因其如此强烈的毒性，在鱼肉中的基准浓度被设定为0.01 ppb这样的极低值，检测上十分困难。
图2. 从海鳝中获得的主要成分CTX1B和G. toxicus 生产的CTX4B
d.刺尾鱼毒素
栉齿刺尾鱼是一种在珊瑚礁中常见的小型鱼，由于容易捕获以及烘烤时皮下脂肪很香，在大溪地非常受欢迎。同时，它也曾占了大溪地雪卡毒素中毒原因的60%以上。另外，它与肉食鱼双棘石斑鱼和海鳝相比，中毒症状较轻，这也是人们喜欢吃它的原因。以栉齿刺尾鱼为代表的食藻类鱼与食物链上端的鱼发现的中毒症状不同，一般被认为是是否是由于原因毒素的来源不同。笔者研究发现栉齿刺尾鱼胃肠道内容物含有除CTX毒素以外的其他高极性的毒素，因栉齿刺尾鱼的大溪地名称为“maito”，因此将该种毒素命名为“Maitotoxin、 MTX（刺尾鱼毒素）“。之后，成功地培养了含刺尾鱼毒素的G. toxicus，并将该毒素从藻类中分离出来，并表征了它的化学结构（图3）。作为不具有肽和多糖等单位结构重复的天然物，它是最大且最复杂的化合物。虽然其口服的毒性很弱，但其有着极强的毒性（小鼠腹膜内给药毒性，溶血活性），其真正中毒机理还尚未得以阐明。
图3. 刺尾鱼毒素的化学结构
东北大学名誉教授大泉康积极开展了MTX药理活性相关的初期研究。使用大鼠肾上腺皮质细胞（PC12细胞）和其他细胞进行实验，发现MTX可诱导细胞外Ca2+ 流入，并且在不存在Ca2+ 的情况下不显示活性。MTX没有离子载体活性，使用维拉帕米等Ca2+ 阻滞剂无法完全阻滞。由于也没有Na+ 通道的活性，因此被指出可能是通过未知的Ca2+ 通道进行活化的。
美国国立卫生研究院的已故John Daly博士及研究人员使用MTX对多种细胞系进行了实验，发现包含没有Ca2+ 通道的细胞在内，所有细胞系中都会有Ca2+ 流入的现象，这对阐明由Ca2+ 诱导引起的细胞现象非常有用。但是，随后MTX的供应中断以及Daly博士的逝世导致这项研究一直没有进展。此外，笔者等人培养的MTX生产菌株也在笔者退休后也死亡了。虽然最近有硫酸酯脱附制备MTX的报告，但目前仍未有MTX生产菌株。期望对发现特异性通道有用的化合物可以得以持续供应。
◆雪卡毒素派生的海洋毒素研究
a.河豚毒素（Tetrodotoxin）的细菌起源
河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）不仅是日本，还是世界上最著名的海洋毒素。多年来，研究人员一直认为河豚毒素是由河豚生产的，但是笔者在研究雪卡毒素时发现河豚毒素是来源于外部的。在调查大部分的珊瑚礁鱼关于CTX 和MTX的分布时，在并不是鲀科的热带鱼蓝纹神仙鱼和隆头鹦嘴鱼的内脏中发现了水溶性的急性毒。笔者注意到该急性毒以与河豚毒相类似的症状杀死了小鼠。之后，笔者使用自己制作TTX荧光分析装置进行分析，确认了其与TTX相一致。在东北大学的故乡宫城县产的河豚中，TTX含量也显示出明显的地域差异。此外河豚经常与TTX不同的麻痹性贝毒的石房蛤毒素（Saxitoxin、STX）共存，两种毒素的比例根据地域不同会出现较大的差异（图4）。由此可以推断，TTX和雪卡毒素的CTX相同地是通过食物链积蓄而来的，由此开始了寻找TTX起源的研究。
后来我们了解到发生雪卡毒素中毒的西南群岛和菲律宾的扇蟹类会积蓄TTX。分析其胃中出现的石灰藻后，确认了TTX的存在。但是TTX含量根据地域差和季节差会出现很大的差异，所以，毒素有可能是来源于石灰藻的粘附生物或细菌。通过分离和培养细菌后，确认了2种产生TTX的细菌。如果毒素来源是细菌的话，就能解释它在多种生物中移动和积蓄的现象。近年来，欧盟各国在养殖的双壳贝的消化道中检测到了TTX，并且还分离出产生TTX的细菌。虽然浓度很低，但TTX的存在仍然是食品卫生上的问题。由于检测和定量需要使用LC-MS，所以期望可以出现定量用的标准品。因为TTX的吸湿性很强，所以想要正确称量是十分困难的。当使用qNMR时， 需注意TTX是半乳糖型和10,7-内酯型的混合物，会提供两组信号，比例还会随pH和温度变化。另外，制备与TTX同时出现的同源物的鉴定用和定量用的标准品也是有一定意义的，但是想要实现是一项很难的课题。
图4. 河豚出现的TTX和STX的地域变化
b.沙海葵毒素类似物的发现和起源
沙海葵毒素（Palytoxin、PLTx、 C129H223N3O54）的结构是夏威夷大学D. Moore教授和名古屋大学故平田羲正以及上村大辅教授团队在竞争中阐明的，作为当时已知的最复杂且剧毒的化合物而备受关注。此外，在结构确定后不久岸義人教授发表的全合成也令人惊叹和赞赏。PLTx是基于夏威夷的剧毒海藻民间传说（实际上并不是海藻），在纽扣珊瑚中被发现的。据说只有在海岸约30 m的非常狭窄的礁石缝隙中生长的纽扣珊瑚才具有剧毒，并且其局部毒性变化幅度大表明了PLTx为外部起源。真正的产生者至今还没有得到证实。之后，包含笔者在内的大部分研究员从各种生物中检测出了PLTx和其类似物。
我们在G. toxicus 中发现了PLTx和雪卡毒素的相关性。G. toxicus 与大部分浮游生物不同，它附着在海藻表面生长，是一种的罕见的生态现象。在调查G. toxicus 的分布情况时，可以观察到大量附着在各种海藻上的沟鞭藻类。其中之一有毒藻Ostreopsissiamensis 的大小和形状与G. toxicus 非常相似。经过培养，将其含有的毒素命名为Ostreocin后，调查该毒素化学结构时意外地发现它是沙海葵毒素的类似物。虽然笔者也有期待过PLTx起源于沟鞭藻类，但是部分化学结构的甲基和羟基是不同的。后来，另一种类似的有毒藻Ostreopsisovata 在地中海繁殖，导致进行海水浴的游客的健康受到了危害。当发现了其产生的毒素积蓄在双壳贝类后，就被认为是公共卫生和食品卫生中的严重问题（该毒素被命名为Ovatoxin）。从化学结构的角度来看，Ostreocins和Ovatoxins具有不同的甲基和羟基，所以不是PLTx直接的前驱体。由于纽扣珊瑚中有细菌，蓝藻和沟鞭藻等多种微生物共存，也许是共生蓝藻产生的PLTx，但是海产蓝藻的培育非常困难，因此当下想要完全解决毒素起源的问题还是十分困难的。然而，在生化和药理学测试中经常会使用到PLTx，但是由于大量采摘有毒纽扣珊瑚和纯化PLTx非常困难，因此笔者十分担忧将来该毒素的供应。
c.腹泻性贝毒和冈田酸
1976年，日本东北沿海地区经常发生由双壳贝引起的腹泻，我们将引起腹泻症状的该毒素命名为腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfish poisoning，DSP)。几乎同一时期，欧盟也发生多起相同的腹泻症状。在西班牙和法国成千上万的游客度假时在海岸边收到该毒素影响。现在，DSP是仅次于麻痹性贝毒的第二重要的贝毒。在纯化贝毒后，笔者初次看到其NMR光谱时，感到十分惊讶。它与冈田酸(Okadaic acid，OA)极为相似（图5），冈田酸是作为药理活性成分从海绵动物身上提取而出名的，是一种从大溪地的海底沟鞭藻类Prorocentrum lima 提取到的毒素。OA因可在缺少Ca2+的情况下引起平滑肌收缩而被关注。实际上，我们从贝壳分离出来的化合物是35-冈田酸甲酯（DTX1）。同时，我们还鉴定了一种名为Prorocentrolide的环状亚胺。有趣的是，在研究室惯例的暑假期间，笔者在三陆沿海的一家民宿住宿时，吃了水煮淡水贻贝作为啤酒的下酒菜时腹泻了。即使在怀疑有肠炎弧菌的污染下充分煮熟后还是腹泻了。因此我怀疑是化学物质的原因引起，将这次中毒命名为“腹泻性贝毒”（DSP），并将原因毒素命名为Dinophysistoxin，并对其进行了追踪。结果，鉴定出如图5所示的35-甲基冈田酸（DTX1）（图5）。将其命名为Dinophysistoxin-1（DTX1）的理由是由于确定了毒素的起源为沟鞭藻Dinophysis fortii（图6）。D. fortii 实际上不生产毒素，但会以微小的藻类为食，从而积蓄OA和DTX1。可培养的P. lima 会生产OA和DTX1两种成分，所以可以通过培养P. lima 生产 LC-MS定量用的标准品。总的来说，之前雪卡毒素研究与当下的三陆沿海的食物中毒事件相关性让笔者十分意外。
图5. 海底沟鞭藻生产的冈田酸
图6. 腹泻性贝毒的主要原因浮游生物D. fortii
◆结语
海洋毒素拥有很强的特异性，因此作为生化和药理学试剂或食品和公共卫生监测试剂非常重要。想要从毒鱼类和贝类提取原料十分困难，但最近随着各种分析手段的进步，如果可以像本文所描述的刺尾鱼毒素那样，即使是极少量的样品也能获得充分分析检测的话将是一件十分令人欣喜的事。
参考文献
1）Yasumoto, T. : Chemical Record, 1, 228 （2001）.
2）Yasumoto, T. : Proc. Japan Acad. Ser. B., 81, 43 （2005）.
3）Yasumoto, T., Nagai, H., Yasumura, T., Michishita, T., Endo, A. and Yotsu, M. : Ann. N.Y. Acad. Sci., 479, 44（1986）.
4）Takahashi, M., Ohizumi, Y. and Yasumoto, T. : J. Biol. Chem., 257, 7287 （1982）.
5）Gusovsky, F. and Daly, J. : Biochem. Pharmacol., 39, 1633 （1990）.
6）Yokoyama, A., Murata, M., Oshima, Y., Iwashita, T. and Yasumoto, T. : J. Biochem., 104, 184 （1988）.
7）上村大輔、平田義正：現代化学，145，14 （1983）.
8）Moore, R. E. : “Progress in the chemistry of Organic Natural Products .”, SpringerVerlag, Wien/New York, Vol. 48, p. 81 （1985）.
9）Usami, M., Ishibashi, S., Inoue, A., Kan, Y. and Yasumoto, T. : J. Am. Chem. Soc., 117, 5389 （1995）.
10）Yasumoto, T., Murata, M., Oshima, Y., Matsumoto, G. and Clardy, J. : “Seafood toxins, ACS Symposium eries.”, American Chemical Society, Washington, Vol. 262, p. 207 （1984）
◆海洋毒素相关产品
| 产品编号 |
产品名称 |
规格 |
包装 |
| 038-25801 |
CiguatoxinCTX 1B
雪卡毒素 1B |
生化学用 |
100 ng |
| 030-21581 |
CiguatoxinCTX 3C
雪卡毒素 |
生化学用 |
100 ng |
| 382-14341 |
CTX-ELISA 1B |
– |
1 kit |
| 042-33671 |
Dinophysistoxin-1
鳍藻毒素-1（DTX-1） |
生化学用 |
100 μg |
| 131-19011 |
Maitotoxin
刺尾鱼毒素 |
生化学用 |
10 μg |
| 156-03551 |
OA・DTX1 Mixture Standard Solution
(each 1 mg/L Methanol Solution)
冈田酸·鳍藻毒素-1混合标准溶液
（各1 mg/L，溶于甲醇）
|
食品分析用 |
2 mL |
| 152-03271 |
Okadaic Acid
冈田酸 |
生化学用 |
25 μg |
| 158-03273 |
100 μg |
| 165-26141 |
Palytoxin
沙海葵毒素 |
生化学用 |
100 μg |
| 206-11071 |
Tetrodotoxin
河豚毒素 |
生化学用 |
1 mg |
