无损监测具有致瘤性人ES/iPS细胞的技术
-人ES/iPS细胞监测试剂盒（Human ES/iPS Cell Monitoring Kit）-
国立研究开发公司 产业技术综合研究所 药物发现研究部门 舘野 浩章
前言
人ES细胞和iPS细胞有望作为再生医学的细胞来源，但其致瘤性难题仍未解决。目前，我们已发现rBC2LCN凝集素选择性结合人ES/iPS细胞，并由此开发了染色、去除ES/iPS细胞的技术。在本研究中，我们成功开发了世界首次通过培养液无损监测人ES/iPS细胞数量的技术，并投入实际应用。这有望改善和提高再生医学使用人ES/iPS细胞的安全性。本文主要介绍人ES/iPS细胞监测试剂盒的开发过程。
再生医学使用ES/iPS细胞的重要课题
人ES细胞和人iPS细胞具有无限的增殖能力（自我复制能力），并且可分化为多种细胞（多能性），如心肌细胞和神经细胞等。其作为再生医学的细胞源被寄予厚望。特别是人iPS细胞，由于仅通过引入基因就可以从各种体细胞转化而成，因此不仅是再生医学，它也有望用于疾病模型和新药的开发。2015年9月实施了世界首例移植患者自身人iPS细胞源视网膜色素上皮细胞治疗年龄相关性黄斑变性的临床研究。随着人ES/iPS细胞在临床应用上的不断发展，其安全性问题也越来越被重视。最令人担忧的是，从人ES/iPS细胞制备的移植用细胞，即使在诱导分化后仍然残留具有致瘤风险的未分化细胞。在确保人（自身）iPS（类）细胞加工药物质量和安全的指南（《药物饮食》0907第3期2012年9月7日）中也有记载："在人iPS（类）细胞加工药物中，最重要的要求是制定对策控制除靶细胞以外的未分化细胞的污染。希望尽可能在中间产物阶段控制除靶细胞以外的未分化细胞的污染。"由此可见，人iPS细胞加工药物用于治疗时，残留未分化细胞的致瘤性已成为重要的关注点。因此，迫切需要一种技术来评估从人ES/iPS细胞制备的移植细胞中残留多少未分化细胞。
发现人ES/iPS细胞特异性凝集素rBC2LCN
我们开发了一种凝集素微阵列技术，可以快速且灵敏地分析密集覆盖细胞表面的糖链。人ES/iPS细胞和其他细胞一样，表面覆盖着糖链，但目前并没有详细的资料介绍这些糖链结构。对此，我们使用凝集素阵列分析了共100多种类型的人ES/iPS细胞1），并使用质谱仪和液相色谱对糖链结构进行定量分析2）。实验结果揭示了人ES/iPS细胞中表达的糖链结构，同时还发现了一种凝集素（糖结合蛋白的通用名称）——rBC2LCN，特异性结合人ES/iPS细胞。之后，我们与和光纯药工业（Wako）进行了合作研究，开发了可利用rBC2LCN对培养状态下的人ES/iPS细胞进行染色的试剂（2013年6月：未标记的rBC2 LCN凝集素、2014年6月：rBC2LCN-FITC、2014年12月：rBC2LCN-635、2015年6月：rBC2LCN-547）3）。此外，通过将铜绿假单胞菌衍生的外毒素（PE23）与rBC2LCN凝集素的C末端部分融合，开发了一种重组蛋白（2015年7月：rBC2LCN-PE23）以及只需添加在培养液中即可选择性除去未分化细胞的试剂4）。
人ES/iPS细胞监测试剂盒的开发
分析rBC2LCN凝集素与人ES/iPS细胞的结合机制，结果发现rBC2LCN与1型膜蛋白（足糖萼蛋白，Podocalyxin）上的O型糖链，一种名为H型3（Fucα1-2Galβ1- 3GalNAc）的碳水化合物表位结合5）。有趣的是，我们发现这种rBC2LCN表现有交叉反应的足糖萼蛋白（以下称为rBC2LCN阳性足糖萼蛋白）从各种类型的人ES/iPS细胞分泌到培养液中6）。此外，足糖萼蛋白存在于肾脏等其他组织中，据研究人ES/iPS细胞特征性的rBC2LCN阳性足糖萼蛋白不是从正常的体细胞分泌的。也就是说，通过检测培养液中的rBC2LCN阳性足糖萼蛋白，就可检测人ES/iPS细胞而不使用细胞本身。首先，通过将rBC2LCN固定在ELISA板上，捕获培养液中的rBC2LCN阳性足糖萼蛋白，搜寻可检测它的探针6）。筛选各种抗体和凝集素，最后发现通过使用对O型糖链显示交叉反应的rABA凝集素作为检测探针可高灵敏度检测rBC2LCN阳性足糖萼蛋白。这种利用两种凝集素（rBC2LCN凝集素和rABA凝集素）的夹心测定法被命名为GlycoStem法。但针对足糖萼的蛋白骨架制备的各种抗体并未成功检测足糖萼蛋白。我们认为是由于足糖萼蛋白表面覆盖了大量的O型糖链，抗体不能很好地进入蛋白质骨架。对GlycoStem法的进一步验证表明，它对含有胎牛血清的培养液显示高背景7）。随后进一步搜寻在胎牛血清中未显示背景的检测抗体。结果显示，使用与在人ES/iPS细胞中表达的足糖萼蛋白上呈递的低硫酸化硫酸角质素反应的R-10G抗体，可不受胎牛血清的影响，特异性检测培养液中的rBC2LCN阳性足糖萼蛋白。使用rBC2LCN凝集素和R-10G抗体的夹心测定法被命名为高效GlycoStem法（GlycoStem-HP法）。图1是GlycoStem-HP法示意图。GlycoStem-HP法适用于检测在mTeSR1、TeSR-E8、StemSure® hPSC medium、mouse embryonic fibroblast-conditioned media（MEF-CM）等各种培养基中培养的人ES/iPS细胞，检测下限值为0.0006-0.03％（图2）。
图1. GlycoStem-HP法（人ES/iPS细胞监测试剂盒）
图2. 使用GlycoStem-HP法（人ES/iPS细胞监测试剂盒）分析在各种培养液中的人iPS细胞（201B7株）培养上清，绘制标准曲线。
在人iPS细胞源心肌细胞和神经干细胞中的应用
验证GlycoStem-HP法是否适用于应用在实际的人iPS细胞源移植用细胞。通过与以治疗严重的心力衰竭为目的，使用人iPS细胞源心肌细胞进行再生医学研究的大阪大学心血管外科合作研究，测定从人iPS细胞诱导分化心肌细胞过程中未分化细胞的数量（图3）。通过流式细胞仪分析发现诱导分化后第5天总细胞数量增加，此后细胞数没有显著变化。此外，用流式细胞仪测定Tra-1-60/rBC2LCN阳性细胞的数量，发现在诱导分化过程中数量逐渐减少。通过GlycoStem-HP法获得的表观细胞数（任意单位，AU）也随着细胞总数的增加而在诱导分化3天后增加，之后逐渐减少，与通过流式细胞仪计算的细胞数相似。
与通过移植人iPS细胞源神经干细胞进行脊柱损伤治疗研究的庆应义塾大学医学院和大阪医疗中心合作，挑战检测混在人神经干细胞中的人iPS细胞。结果发现使用GlycoStem-HP法可检测到0.05%的人iPS细胞。2016年3月， GlycoStem-HP法的"人ES/iPS细胞监测试剂盒"通过和光纯药工业投入实际使用。
图3. 使用GlycoStem-HP法（人ES/iPS细胞监测试剂盒）监测心肌分化过程中未分化细胞的数量
总结
致癌试验方法有使用免疫缺陷动物的体内致瘤性测试方法、使用未分化细胞特异性抗体的流式细胞术、以Lin28基因表达为指标的PCR法和Essential-8/LN 521培养扩增方法等。这些试验方法都需要使用一部分移植用细胞进行检测。而这次开发的GlycoStem-HP法最大的特点就是无需使用贵重的移植细胞进行检测，仅使用50µL培养液就可以非破坏性地检测未分化细胞的数量。由于可以用培养液测量，因此有望将其发展为自动检测装置。目前，世界上还没有通过使用培养液测定未分化细胞数量的技术。我们期待GlycoStem-HP法可作为无损检测残留在细胞加工产品中的未分化细胞的方法，应用于再生医学和细胞治疗。但有一点需要注意的是，人ES/iPS细胞的数量是通过测量rBC2LCN阳性足糖萼蛋白的数量来间接测量的。此外，分泌量根据细胞类型和培养液种类等而变化。GlycoStem-HP法是一种测量未分化细胞数量的新技术，还需要各种验证。
使用rBC2LCN凝集素染色、检测和去除人ES/iPS细胞的技术已投入实际使用（图4）。为了推动使用人ES/iPS细胞实现再生医学，我们将改进和验证这些技术，并阐明在人ES/iPS细胞中表达的糖链的功能。
图4. 使用rBC2LCN凝集素染色、检测和去除人ES/iPS细胞技术的开发
参考文献
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Onuma, Y., Tateno, H., Hirabayashi, J., Ito, Y. and Asashima, M. : Biochem. Biophys. Res. Commun., 431, 524-529 （2013）. |
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Tateno, H., Matsushima, A., Hiemori, K., Onuma, Y., Ito, Y., Hasehira, K., Nishimura, K., Ohtaka, M., Takayasu, S., Nakanishi, M., Ikehara, Y., Ohnuma, K., Chan, T., Toyoda, M., Akutsu, H., Umezawa, A., Asashima, M. and Hirabayashi, J. : Stem Cells Transl. Med., 2, 265-273 （2013）. |
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Tateno, H., Onuma, Y., Ito, Y., Hiemori, K., Aiki, Y., Shimizu, M., Higuchi, K., Fukuda, M., Warashina, M., Honda, S., Asashima, M. and Hirabayashi, J. : Sci. Rep., 4, 4069 （2014）. |
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Tateno, H., Hiemori, K., Hirayasu, K., Sougawa, N., Fukuda, M., Warashina, M., Amano, M., Funakoshi, T., Sadamura, Y., Miyagawa, S., Saito, A., Sawa, Y., Shofuda, T., Sumida, M., Kanemura, Y., Nakamura, M., Okano, H., Onuma, Y., Ito, Y., Asashima, M. and Hirabayashi, J. : Regenerative therapy, （2016）, in press. |
相关术语
凝集素
凝集素是一类与糖链结合的蛋白的总称，它存在于从人类到病毒的所有生物体中。1888年，通过俄罗斯Still Mark，人们首次发现蓖麻籽的提取物可以聚集各种动物的血细胞。由于它与特定的糖链结合，因此它不仅作为糖链分析的试剂长期应用，而且还通过介导细胞间的相互作用而具有深入参与各种生物现象的功能。
rBC2LCN
来自革兰氏阴性细菌伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）的凝集素BC2L-C的N-末端结构域的重组蛋白。使用凝集素阵列进行分析的结果，rBC2LCN被确定为与各种人ES/iPS细胞具有反应性的凝集素。由于仅添加在培养基中就可染色培养状态下的人ES/iPS细胞，作为人ES/iPS细胞染色用试剂，未标记以及各种荧光标记通过和光纯药工业投入实际应用。
◆产品列表
| 产品编号 | 产品名称 | 规格 | 包装 |
| 299-78301 | Human ES/iPS Cell Monitoring Kit 人ES/iPS细胞监测试剂盒 |
再生医疗研究用 | 96次用 |
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