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小分子

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　　●　增殖和自我更新

　　●　重编程

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蛋白质

　　●　生长因子

　　●　细胞因子/趋化因子

　　●　干细胞标记

◆相关产品

　　Y-27632 . 二盐酸盐

间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

外泌体再生医学的实现之路

富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所

丸谷祐树、山根昌之

◆前言

细胞外囊泡（Extracellular vesicle : EV）是由细胞释放的脂质双分子层包被的膜囊泡，作为细胞间的通讯工具发挥作用。外泌体属于EV的一种，被认为参与多种生物功能的控制，并有望用作疾病生物标记物或治疗制剂。在治疗制剂的应用方面，具有抗炎和抗纤维化作用的间充质干细胞（Mesenchymal stem cell：MSC）来源外泌体备受瞩目，其未来的实用性被寄予厚望。对MSC来源外泌体实际应用的期望不断提升，同时外泌体作为治疗制剂的生产技术研发也在积极进行。

本文将介绍由FUJIFILM Wako自主研发的无血清培养基，在生产用于治疗的MSC来源外泌体方面的实用性。

◆MSC来源外泌体

以CD9、CD63和CD81等作为标记蛋白的外泌体，由细胞释放的、直径在30-100 nm左右的脂质双分子层包被的膜囊泡，含有蛋白、核酸（DNA、mRNA、miRNA）、脂质等细胞来源成分^1，2）。另外，MSC来源于中胚层的成体干细胞，能够从骨髓、脂肪、脐带等组织中建立，具有分化为脂肪、骨骼和软骨的功能。除此之外，MSC还具有诱导抗炎、抗纤维化或免疫抑制等旁分泌效应，近年来有人提出这些作用是由外泌体引起的^3）。在此背景下，将MSC来源外泌体作为治疗制剂的关注度急剧攀升。

◆MSC来源外泌体产生用无血清培养基的研发背景

关于在产生MSC来源外泌体时所用的培养基，起初使用的是几种添加了不含牛来源外泌体的胎牛血清（EV-depleted FBS）的基础培养基^4，5）。然而，这些组分均以维持MSC存活为目的，能够优化外泌体分泌和生物活性效果的组分尚未研发成功。

为此我们研发了一款可为MSC产生外泌体提供适宜的环境的无血清、无动物培养基，即为可同时维持高性能和高生物活性的EV-Up™基础培养基及补充剂（下称EV-Up™培养基）。

◆使用EV-Up™培养基培养获得的外泌体产量及活性

EV-Up™培养基的推荐使用方法是，在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合，然后更换培养基并培养 3-5 天（图1）。从血清培养基更换为无血清培养基时，多数情况下都需要进行驯化操作，但在含FBS的血清培养基中增殖的细胞，也能够直接更换EV-Up™培养基培养。

图1. EV-Up™培养基的建议操作流程

           在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合后，更换至EV-Up™培养基。然后培养 3-5 天，回收培养上清。可以通过PS亲和法从回收的培养上清液中回收外泌体。

在血清培养基中使骨髓来源的MSC增殖，然后更换至含EV-depleted FBS的基础培养基或EV-Up™培养基中，检测培养5天后的细胞数和细胞生存率。结果显示，细胞数和细胞生存率均维持在较高的状态下（图2 – A、B）。

图2. 使用EV-Up™培养基培养MSC的细胞生存率

更换至EV-Up™培养基5天后，测得的细胞数（A）和细胞生存率（B）。

接着，利用纳米粒子追踪分析法（NTA)比较使用PS亲和法纯化的外泌体粒子数^6）。结果表明，使用EV-Up™培养基获得的外泌体，其粒子数约为使用含EV-depleted FBS的基础培养基的2.6倍（图3A）。进一步通过基于PS亲和法外泌体定量技术的PS ELISA比较外泌体产量，可确认和粒子数一样，外泌体标记蛋白CD9、CD63 和CD81都有所增加^6，7）（图3 B）。

图3. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体粒子数及外泌体标记蛋白

从各培养基中取培养上清1 mL，通过NTA比较获得的外泌体粒子数（A）以及通过PS ELISA分析外泌体标记的结果（B）。

最后，评估对人胎肺来源正常成纤维细胞（TIG3）的纤维化抑制效果，以比较在各培养基中培养的MSC来源外泌体的生物活性。结果表明，相比常规使用的基础培养基和含EV-depleted FBS的培养基，采用EV-Up™培养基培养的MSC来源外泌体具有更好的抗纤维化效果（图4）。

图4. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体生物活性（抗纤维化活性）

向TGFβ刺激的人胎儿肺源性成纤维细胞（TIG3细胞）中添加PS亲和法纯化的外泌体5×10⁸ particles/mL，

利用Real-Time PCR法定量纤维化标记（αSMA，Collagen Ⅲ）的基因表达，比较抗纤维化活性。           

以上结果显示，EV-Up™培养基可以高产量制备维持高生物活性的MSC来源外泌体，是一款创新性的培养基。

◆结语

此次我们研发的EV-Up ™培养基是针对MSC优化的无血清、无动物来源的外泌体生产用培养基，不仅能提升高活性外泌体的产量，因其无血清、非动物源，还可能有助于提高治疗制剂开发过程中的质量稳定性。今后使用外泌体作为治疗制剂的应用化将会在世界范围内不断发展，期待我们研发的培养基作为实用的生产技术工具得到广泛运用。

〔参考文献〕

1） Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255（2014）.

2） Mathieu, M. et al. : Nat. Cell Biol., 21（1）, 9（2019）.

3） Phinney, D. G. and Pittenger, M. F. : Stem Cells, 35（4）, 851（2017）.

4） Rajendran, R. L. et al. : Sci. Rep., 7（1）, 15560（2017）.

5） Lai, R. C. et al. : Stem Cell Res ., 4（3）, 214（2010）.

6） Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935（2016）.

7） Ma, Y. et al. : Sci. Rep., 11（1）, 13471（2021）.

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第二回 开发运用牙龈干细胞来源外泌体治疗牙周炎

干细胞来源EV ~治疗，诊断，化妆品的开发~

九州大学医院 牙周科 福田隆男

◆前言

牙周炎是由口腔内的牙周病细菌引起的一种慢性炎症，其特征为支持牙齿的牙槽发生骨吸收（bone absorption）。然而，一般的牙周炎治疗侧重于病因消除疗法，主要清除牙菌斑以及菌斑所在的牙结石。因此，现阶段只能采取抑制病症进展的疗法，而因牙周炎损失的牙槽骨却无法再生。

为了改变这一现状，现针对牙周组织再生的疗法开发已经在进行中。迄今为止，已经制定出多种方案，虽然取得了一定成果，但适用症状还存在一定局限。另一方面，近年来备受大家关注的以干细胞为中心、基于细胞移植的细胞治疗取得了显著疗效，但受设备要求和成本限制，其在临床口腔医学中的广泛应用仍存在许多障碍。在任何治疗中，建立统一观点的分子基础对进一步提高安全性与疗效非常重要。

在细胞治疗中间充质干细胞（MSCs）是主要的细胞来源代表。近年来，基于一直以来的细胞治疗概念，干细胞分泌因子的影响也受到越来越多的关注。换言之，从MSCs分泌的外泌体在MSCs对疾病的治疗效果中起着核心作用，并且还发现通过内含的miRNA调节基因表达对组织再生的重要性^1）。牙龈干细胞(GMSCs)与其他组织来源的MSCs相比更容易采集，且具有优越的免疫调节能力²⁾，以及高外泌体分泌量的特点³⁾。MSCs的来源外泌体由于可长期冻存，在临床应用方面颇具优势，并且由于不属于细胞治疗，在道德方面的阻碍也相对低。因此，我们目前正在进行GMSCs来源外泌体应用于治疗牙周病的基础研究^4）。

◆GMSCs来源外泌体对M2巨噬细胞的诱导

巨噬细胞在牙周炎的每个阶段都存在不同的表型^5）。巨噬细胞大致可分为两种表型，炎症诱导的M1巨噬细胞和抗炎的M2巨噬细胞。M1巨噬细胞被Th1细胞因子（如LPS或IFN-γ）激活，产生炎症诱导因子iNOS、ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6等。相反，M2巨噬细胞被Th2细胞因子（如IL-4、IL-13）诱导，并通过产生IL-10、TGFβ和VEGF等抗炎细胞因子，促进血管生成和清除，在炎症反应收敛和向组织修复转化的阶段发挥核心作用。

为验证GMSCs来源外泌体具有的抗炎作用，检测了它们对巨噬细胞表型的影响。结果显示，其与IL-4/13刺激作用相同，可诱导M2巨噬细胞。据报道，MSCs在应对疾病来源的刺激时，会提升其治疗效果^6）。因此，在对GMSCs施加各种炎症刺激后，从培养上清液中回收外泌体，并比较它们诱导M2巨噬细胞的能力。结果证实，TNF-α刺激诱导M2巨噬细胞的效果最佳^4）。为进一步进行in vivo验证，在小鼠背侧皮下制造了表皮缺损，并注射GMSCs来源外泌体，以比较随时间变化伤口愈合的效果。与对照组（PBS）相比，外泌体组观察到明显的伤口愈合，但在TNF-α刺激后，进一步显示出外泌体组促进伤口愈合的效果。在此时的组织切片中，也观察到在TNF-α刺激后，外泌体组中M2巨噬细胞的早期聚集，以及炎细胞浸润的早期减少和伤口上皮化的亢进^4）。

◆GMSCs来源的外泌体对牙周炎治疗的效果

为了验证GMSCs来源外泌体通过诱导M2巨噬细胞治疗牙周炎的可行性，制备丝线结扎诱发的小鼠牙周炎模型，并测试其抑制牙槽骨吸收的能力（图1）。结果显示，将外泌体注入牙龈可抑制牙槽的骨吸收，而在TNF-α刺激后，外泌体组对骨吸收的抑制作用得到进一步提高。组织成像也显示TRAP阳性破骨细胞数量的减少^4）。

图1. 抑制牙周炎小鼠模型中的牙槽骨吸收的效果（改编自参考文献4）。

M2巨噬细胞的IL-4/13刺激以外的诱导路径，近年有报告称其为腺苷（ADO）及其受体介导的分化路径^7）。ADO是抗炎分子的一种，由炎症反应诱导产生的三磷酸腺苷（ATP），通过细胞膜酶CD39/CD73的去磷酸化级联反应所产生。CD73作为代表性的MSC阳性标志物也在GMSCs中长期表达，但它在外泌体中的表达会在TNF-α的刺激下增强。另外，用CD73中和抗体处理外泌体可显著抑制M2巨噬细胞的诱导。这些结果表明，由TNF-α刺激GMSCs诱导的外泌体CD73对诱导M2巨噬细胞非常重要^4）。

◆GMSCs来源外泌体包裹的miR-1260b对骨吸收的抑制

为了研究GMSCs来源外泌体抑制骨吸收的机制，对外泌体包裹的miRNA进行了微阵列分析。以TNF-α诱导的miRNA为重点进行数据库分析显示，miR-1260b以大量骨吸收相关的基因为靶向。因此，使用牙周韧带细胞（PDLCs）研究miR-1260b导入对破骨细胞激活因子RANKL表达的影响。结果证实，LPS诱导的RANKL表达不仅被GMSCs来源的外泌体刺激，还被miR-1260b导入显著抑制。对这些分子机制进行验证后发现，TNF-α诱导的miR-1260b通过抑制Wnt5a和JNK信号，进而抑制PDLCs中RANKL的表达^4）。

图2. 用TNF-α刺激的GMSCs来源外泌体（Exo-TNF）治疗牙周炎的模型（改编自参考文献4）

◆结语

在牙周炎的治疗中，M2巨噬细胞在收敛炎症和诱导组织修复方面发挥核心作用。此外，最近有报道称，牙周韧带干细胞（PDLSCs）与M2巨噬细胞共同培养可促进其向成牙骨质细胞分化，后者对牙周组织的再生非常重要^8），同时还可建立M2巨噬细胞对牙周组织有再生作用的依据。因此，除了对治疗牙周炎时至关重要的收敛炎症外，GMSC来源外泌体还有可能诱导组织重塑和再生，这将为牙周组织的再生带来明显优势（图2）。

此外，对GMSCs来源外泌体中包裹的miRNAs进行Ingenuity Pathway Analysis证实，其在生活方式病和疑难杂症中具有潜在应用价值的众多途径的备选方案里位居前列。未来，通过阐明由GMSCs来源外泌体中的miRNA所介导的抗炎作用机制，为今后的人体研究建立分子基础，并从应用于牙周病的治疗出发， 以达到"从口腔到全身健康 "治疗策略的目标。

◆参考文献

1）Quesenberry, P. J .et al. : Stem Cell Res.Ther., 6, 153（2015）.

2）Zhang, Q. et al. : J. Immunol., 183, 7787（2009）.

3）Kou, X. et al. : Sci. Transl. Med., 10, eaai8524 （2018）.

4）Nakao, Y. et al. : Acta Biomater., 122, 306 （2021）.

5）Ebersole, J. L. et al. : Periodontol. 2000, 62, 163（2013）.

6）Katsuda, T. et al. : Proteomics , 13, 1637 （2013）.

7）Csóka, B. et al. : FASEB J., 26, 376（2012）.

8）Li, X. et al. : Stem Cells, 37, 1567（2019）.

◆产品列表

间充质干细胞增殖用培养基

外泌体生产用培养基

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。

【技术文章】作为化妆品原料的干细胞培养基 · 外泌体

Anti-Ageing Co.,ltd 材料业务部 藤田英人

您是否了解市售的化妆品中含有添加了干细胞培养基和外泌体的产品？调查显示，超过50%普通消费者对人干细胞培养基作为化妆品原料有一定认知。

作为一家原料供应商，本公司销售作为化妆品原料的人干细胞培养基。2012年，在日本首次注册人干细胞培养基为化妆品原料，并开始售卖。2019年，开始正式推广外泌体。2020年，开始供应外包装粘贴了外泌体标签的化妆品原料，2022年收到了大量的询盘，该年也正好是人干细胞培养基作为化妆品原料引入日本的10周年。

◆作为化妆品的起点

人干细胞培养基充当化妆品原料的起点是韩国。众所周知，直至21世纪初，韩国都是脂肪来源干细胞研究的先行者。除研究外，其商业化的发展也如火如荼，还建立了干细胞库等，此类项目的商业用途之一就是人干细胞培养基的化妆品。由于人干细胞培养基的功能性成分、EGF和FGF等的生长因子无法仅靠涂抹渗透皮肤，所以最初是使用微针滚轮这种含有细针的滚轮在皮肤上打开微孔，并涂抹人干细胞培养基。后来，通过将其脂质体化，并添加至美容液与面霜等普通化妆品中，并于这一时期引入日本。

人干细胞培养基化妆品市场，集中在韩国、日本和美国部分地区。包括干细胞的来源在内，市场中的各类差异化层出不穷。现在在日本国内，除了人脂肪来源干细胞以外，还有牙髓、骨髓、脐带、脐带血来源的干细胞培养基作为化妆品原料出售。其中，本公司使用供应稳定且来源正规的可商用脂肪来源干细胞生产原料。

图1. 人干细胞培养基RemyStem的生产工序

在这样的市场差异化下，目前最备受关注的产品是外泌体。本公司最初为实现差异化推广外泌体时，网络上向公众传播外泌体信息的网站只有NHK。为此，本公司的原料供应商韩国RemyBio公司快速开通了日语的外泌体专业网站（https://www.exosomes.jp），同时公开外泌体能够减少成纤维细胞的老化标记——SAβGAL等可使老化成纤维细胞再生的实验结果。因此，在化妆品行业中人干细胞培养基中存在的外泌体成分引起极大的关注。

◆外泌体化妆品的发展

最初，外泌体只是作为人干细胞培养基原料中的差异化因素之一。而现在，本公司还提供外泌体与干细胞培养基的脂质体混合制成的混合外泌体化妆品原料。外泌体也逐渐从人干细胞培养基成分之一，发展为外泌体化妆品品类。

本公司在推广外泌体的初期，曾以干细胞培养基中的外泌体含量比平均值更高作为卖点。而现在，可以将其毫无损失地用于化妆品也是重要的宣传内容。众所周知，外泌体会粘附于玻璃与塑料容器，导致产量降低。化妆品原料也相同，所以为了降低损耗，开发了抑制外泌体吸附于容器的技术EXO-SAVE。依靠该技术，本公司原料中的外泌体含量增加了约7倍（图2）。

图2. 使用EXO-SAVE时的外泌体CD63信号分析

◆外泌体化妆品的问题与未来

人干细胞培养基作为化妆品原料的标签名称（原料的正式名称）众多，本公司命名为“人干细胞驯化培养液”。该名称的定义为“本产品是人干细胞培养几天后，从培养物中提取的培养液。初始培养基使用Dulbecco's Modified Eagle Medium，无论是否含牛胚胎血清”。普通化妆品原料，其标签名称均根据结构式和分子量进行定义，但由于人干细胞培养基是在培养基中培养干细胞数天后，去除干细胞残留的培养液。因其成分模糊，所以即使是使用相同标签名称的化妆品原料，来自不同供应商的人干细胞培养基的成分也会有所差异。

因此，外泌体的标签名为“人脂肪来源间充质细胞外泌体”。其定义是“本产品为人脂肪来源间充质干细胞在驯化培养液中分泌的囊泡”。从定义来看，可能会误以为原料仅由外泌体组成，但实际上本品还包含初始培养基的成分和水分等，具体的外泌体尺寸、数量、浓度（%）并没有规定。不仅如此，外泌体内含的miRNA和功能也没有提及。异质性虽然是外泌体作为药物发展的争议问题之一，但该现状持续存在于化妆品市场的情况下，外泌体仍可作为化妆品原料进行供应。

与药物不同，这种宽松的政策让外泌体可作为化妆品原料开始供应。但是，作为提供人干细胞培养基的优质企业，我们并不能因此而松懈，要正确地检测外泌体，并尽可能验证其对皮肤的渗透性和功能性，提供正确信息的同时，也要提供优质的原料。

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