小鼠生殖工程学技术——6体外受精

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◆材料

1. 生理盐水生理盐水（大塚制药 日本药典 大塚生注食）

2. PMSG（asuka制药 注射血清促性腺激素 动物用性腺激素1000单位/管）

3. hCG（asuka制药 注射用胎盘促性腺激素，动物用性腺激素3000单位/管）

4. 1 mL注射器（泰尔茂株式会社SS-01T2613S）

5. FERTIUP^® 精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）

6. CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）

7. mTHF（Cosmo Bio Co., Ltd）

8. 电动移液器（法国吉尔森电动单道移液器P-200　P-20）

9. 黄色枪头  （BM医疗器 Cat.No.110-96R）

10. 受精用的枪头（Quality Scientific Plastics Pipet Tip Cat.No.114）

11. 流动石蜡（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）

12. 培养皿（Corning  35mm X 10mm　Cat.No.430588）

13. 解剖用大剪刀  （夏目制造所 反剪刀 Cat.No.B-2）

14. 解剖用小剪刀  （夏目制造所  小直剪刀Cat.No.B-12）

15. 解剖用大钳子（夏目制造所  无钩尖细的镊子    Cat.No.A-5）

16. 解剖用小钳子 （夏目制造所 尖镊子  Cat.No.A-45）

17. noesu剪刀（森田制造所  电话03-3811-9730 特别订制品）

18. 解剖针（夏目制造所 Broach holderCat.No.E-14）

19. 滤纸

20. 微管

22. 倒置显微镜

23. CO₂培养箱

◆方法

过量排卵处理

1. 把激素（PMSG 和hCG） 溶于37单位/mL的生理盐水中

1. * 激素溶液在4°C下，可保存2周

2. 成年雄性小鼠（8~12周龄）需腹腔注射2次，第一次注射PMSG0.2 mL（7.5単位）/只，48小时后，第二次注射hCG 0.2 mL（7.5单位）/只，然后进行过量排卵处理。（通常最好在下午5~6点期间注射激素）

滴液准备

1. 按以下步骤，制作滴液（a、b、c），并静置在二氧化碳培养箱里，令气流稳定。

a 在解冻精子前30分钟，制作个精子孵育用的培养皿（100 μL FERTIUP^® 精子预孵培养基液滴），准备静置在培养箱里；

b 取卵前10分钟，制作受精用培养皿（200 µLCARD MEDIUM滴液1个），静置在培养箱里体外受精时，根据所用精子的不同有不一样的调试方法，详情请参考产品说明书。

C 制作清洗卵子用的培养皿（80 µLmHTF滴液4个），在培养箱里静置30中以上

采集精子

用酒精消毒所有的解剖器具

1. 让1~2只成年雄性小鼠（3~6个月龄）安乐死，用大剪刀和大钳子取出附睾管、附睾及一部分脂肪，在滤纸上切除附睾尾及去除血液和脂肪；

2. 把切除的的附睾尾放入精子预孵用培养皿的流动石蜡中；

3. 用小镊子固定附睾尾，用noesu剪刀切开尾部中央的附睾管；

4. 用解剖针在附睾尾轻压，从附睾管的切开位挤压出精子块；

5. 迅速用解剖针挑出精子块，然后放进FERTIUP^® 的精子预孵培养基的滴液里；

   ＊在精子预孵培养皿的滴液里，如精子黏在解剖针的尖端，可用另一根解剖针轻柔地把精子剥离；

6. 把精子注射入FERTIUP^® 精子预孵培养基里，放进CO₂培养箱里（37°C 5% 二氧化碳 95% 空气）培养60分钟。

采集卵子

用酒精消毒所有的解剖器具

1. 让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG的15~17个小时后安乐死，取出小鼠的子宫、输卵管、卵巢、及一部

1. 分脂肪，然后在滤纸上切除输卵管的尾部及 去除血液和脂肪；

2. 把输卵管浸入受精用培养皿的流动石蜡中；

3. 用镊子把输卵管固定到培养皿底部，用解剖针撕破输卵管壁的胀大部分，把流出的卵子放入CARD MEDIUM 的滴液中。

取出的输卵管放置在室温下3分钟以上，卵子的受精能力及生殖能力就会显著下降，因此从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）。

 一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只进行，并迅速采集卵子。

 一滴CARD MEDIUM里，请引入一只雌性小鼠（两颗）的卵子。

4. 采集卵子后，把受精用培养皿静置在CO₂培养箱里进行30~60分钟的培养。

受精

1. 用受精用枪头（Quality Scientific Plastics Pipet Tip  Cat.No.114），吸取约6µL预孵的精子悬浊液，然后注射进含有卵子的受精用培养皿的CARD MEDIUM滴液里（进行受精）；

2. 将受精用培养皿放在CO₂培养箱里进行培养；

3. 受精3小时后，用玻璃微管吸取形态正常卵子，注射到新的清洗卵子用培养皿的mHTF滴液里，按照（a→b→c）顺序进行洗涤；

＊ 清洗时，要非常注意在清洗卵子培养皿的滴液上不能混有CARD MEDIUM^®

＊ 清洗前，卵子的透明带表面附着许多精子，使用装有黄色枪头的电动移液器（20μL），在受精用的培养皿的CARD MEDIUM^®滴液里移液20~30次后，再清洗卵子。

4. 受精6个小时后，仔细观察卵子，去取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。

正常受精卵可见第二极体和雌雄原核（见左图），单性生殖卵里只有一个原核（见右图），未受精卵无法看到原核（见右图）

5. 次日（受精24~28小时后），次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。

2细胞期胚胎直到囊胚期前都能在体外进行培养 ，在培养时要使用KSOM/AA。

参考文献

  【1】 Takeo T., Nakagata N. 2015 Superovulation Using the Combined Administration of Inhibin Antiserum 

            and Equine Chorionic Gonadotropin Increases the Number of Ovulated Oocytes in C57BL/6 Female Mice. PLoS One. 

           2015 May 29;10(5):e0128330. doi: 10.1371/journal.pone.0128330.

更新说明

更新 2015.06.01

本实验与使用PMS/hCG进行体外受精的相比，有以下两个不同点。

第一点是在受精用培养皿的CARD MEDIUM滴液中放进两颗未受精卵子；第二点是需要6µL受精用的精子悬浊液。

更新 2015.09.03

注射CARD过量排卵诱导剂的小鼠日龄从24~28日改成25~29日。

注射量由0.2mL改成0.1mL~0.2mL。

更新2015.11.18

把CARD过量排卵诱导剂改写成CARD HyperOva™

用C57BL/6J小鼠进行实验时，发现26~30日龄的小鼠实验效果良好，特此更改注射期。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

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◆材料

1、12周以上的雄性小鼠
2、noesu剪刀（森田制造所  电话03-3811-9730 特别订制品）

3、FERTIUP^® 精子冻存液（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、mHTF
5、培养皿（Corning 35mm X 10mm　Cat.No.430588）
6、黄色枪头（BM医疗器 Cat.No.110-96R）
7、填充精子用的吸管(My Science Cryo Bio System 0.25mL cotton-plugged Sperm StrawsReferences.010261 or My ScienceFrance Cassou type Straws (AAA201)　0.25mL Cat.No.005565）
8、配套吸管用的注射器
9、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-10 P-100）
10、加热板（37℃）
11、封口包装机（富士MPULSE 专业包装机器Cat.No.P-200）
12、冻结精子用的吸管
13、Triangle Cassette
14、液氮储存器和干式液态氮筒
15、剪刀

◆步骤

制作冻存精子悬浮装置

1、3厘米厚的泡沫切成圆柱状，塞进50mL的注射器外筒内（泰尔茂Cat. No.SS-50ESz）。

2、用火加热50mL注射器前端，来封堵前端口。

3、用铁丝把注射器固定在50cm的玻璃棒上。

※该装置也可从Cosmo Bio直接购买

准备吸管及制作配套吸管的注射器

1、 在填充精子用的吸管中部贴上标签，剪下棉塞处。
2、 把1mL注射器（泰尔茂Cat. No.SS-01T）、三方活塞（泰尔茂 Cat.No.TS-TR1K）、橡胶管・塑料管（DRUMMOND　Cat.No.2-040-000）以及硅帽组装成如下图
3、 精子填充用的吸管的棉塞一侧插进注射器的硅帽里使用。

制作精子悬浊液

1、在培养皿上制作冻存滴液（FERTIUP^®精子冻液：60μL），用流动石蜡覆盖滴液；

2、往被覆盖的滴液里再注射进冻存液（FERTIUP^®精子冻液：60μL）,得到一个更大的滴液。

※制作后的培养放置在37℃的加热板上至使用时才拿出。

3、让成年雄性小鼠安乐死，把收集的左右附睾尾放置过滤纸上，在实体显微镜下小心地取出血液和脂肪。

4、在培养皿上少量的FERTIUP^®精子冻存液的滴液里小心地清洗附睾尾。

5、FERTIUP®精子冻存液的滴液里放进2个附睾尾，用noesu剪刀在附睾尾处剪开5~6切痕。

※只有一个附睾尾时，只需60μL FERTIUP^® 精子冻存液的滴液。

6、培养皿在37℃加热板上静置3分钟，为了得到均匀的精子悬浊液，需每分钟搅拌一次。

精子悬浊液填充吸管

1、 把填充精子悬浊液的吸管插进吸管配套用的注射器内，往吸管注入约100μL的mHTF。
※一根吸管只能注入10μL的精子悬浊液，如果把吸管就这样浸泡在液氮中，吸管就会浮起来，所以mHTF充当砝码，让吸管沉浸在液氮底部。

2、注入mTHF后，吸管前端需留有15mm的空隙。
3、用黄色枪头吸取培养皿上10μL的精子悬浊液，然后注射进吸管里。

4、 接着再留15mm空隙，用封口机封住吸管端口。

※拉开注射器内筒，观察精子悬浊液和mHTF的状态来确认是否已完全密封。如果精子悬浊液和mHTF移动了，就需再次封口。
5、 从注射器内，移走吸管，用封口机把吸管的另一侧封住。
6、 重复1~5个步骤，制作10~11根填充了精子悬浊液的吸管。

冻存（使用液氮储存）

1、 吸管内精子悬浊液一侧朝下放进浮物里。
2、 浮物浮在液氮面上，大概静置10分钟后，让浮物浸泡在液氮里。

3、 捞起装满了液氮的浮物，把吸管移至预先在液氮内冷却的Triangle cassette，存放在液氮里

冻存（使用干式液态氮筒）

1、 吸管内精子悬浊液一侧朝下，放进Triangle cassette内。
2、 从干式液态氮筒里取出一个容器（金属制造的筒），然后把Triangle cassette翻入容器里，盖上干式液态氮筒的盖子。

※在使用干式液态氮筒的前一天，筒内装满液氮，让筒内的吸附剂充分吸收液氮，吸收不了的多余的液氮，使用前之前倒掉。

3、静置10分钟

※用干式液态氮筒冻存精子时，可以直接运输放进干式液态氮筒里的精子。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

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◆材料

1、  过量排卵处理后的雌性小鼠
2、  FERTIUP^®精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、  CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、  mHTF（Cosmo Bio Co., Ltd）
5、  枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）
6、  培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
7、  与吸管配用的注射器
8、  恒温水箱（37°C）
9、  精子复苏用的Float
10、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）
11、CO₂培养箱
12、剪刀
13、吸水纸

◆方法

制作复苏精子的漂浮装置

1、50mL的离心管与泡沫组合成漂浮装置如下图，用于精子复苏。

复苏精子前的准备

1、  准备恒温水箱（37°C）
2、  用37°C的温水装满装置里的离心管后，放进水箱里，漂浮装置就会浮起来，如下图

3、  在复苏精子前30分钟，制作精子预孵培养皿（滴入90μL FERTIUP^® 精子预孵培养基），准备静置在培养箱里。

4、  收集卵子的前10分钟，制作受精用的培养皿（滴入一个90μL CARD MEDIUM^® 滴液，静置在培养箱。

※根据体外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM^® 调试方法也不同。具体请参考操作说明书。

5、  制作清洗卵子用的培养皿（80µL mHTF滴液4个），在培养箱里静置30分钟以上。

采集卵子

1、 让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17个小时后安乐死，然后把卵子放进受精用的培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液里（一滴液里可放2~3只小鼠的卵子）

※ 从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM^® 滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）

※一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只地进行，并迅速提取卵子。
2、采集卵子后，把受精用培养皿放进 CO₂培养箱里预孵培养30~60分钟。

精子的复苏

1、用钳子取出液氮储存器里的吸管，在空气中逗留5秒，立刻放置37°C恒温水箱的装置里，进行加热。

要点：为确保在37°C下加热，将吸管里的冻存精子朝下方放进浮动物里。

要点：冻融的精子会因处在的周围环境的变化而变弱，在精子运动前，从高粘性精子保存液里移至低粘性培养基（FERTIUP^® 精子预孵培养基），复苏后的精子的运动能力不会完全恢复。为了能让复苏后的精子在37°C加热5分钟以上精子就能很好地运动，请让试管在37°C温水中静置10分钟后，将精子悬浊液移至预孵培养基中(FERTIUP^®精子预孵培养基)。
2、 加热后，从37°C恒温水箱里取出试管，用吸水纸把试管表面的水分吸干。

取出精子悬浊液进行预孵

1、 切断吸管内的mHTF与封口的中间处（要提前拉出注射器的内筒）

2、 把剪断后的吸管插入到注射器里。

3、 吸管插入注射器后，吸管内气压变高，为了释放气压，需要转动一次三路活塞的一个旋塞。

4、旋塞往上回正后，切断精子悬浊液与封口中间处。

5、慢慢按下注射器内筒，只把精子悬浊液注射进精子预孵培养皿的滴液中。

6、  往培养箱内放入5个精子预孵培养皿，培养30分钟。

要点：精子预孵培养皿需要静置在培养箱里直到精子已完全复苏。请注意不要在精子完全复苏前摇动培养皿，否则精子的运动性能就不能完全得到恢复。

受精

1、 用枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics），吸取预孵后的精子悬浊液10μl，注射进含有卵子的受精培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液里。（受精）
2、 受精后，把受精用的培养皿放进培养箱里进行3小时培养。

要点：受精用的精子悬浊液是从集合优良精子的预孵培养液滴液的边缘里收集。（请参阅下图

要点：一个滴液里可收集3~4次精子悬浊液。

要点：精子悬浊液要注射进受精用培养皿的滴液里，使卵子充分接触精子悬浊液。

3、 受精后3小时 ，在清洗卵子用培养皿的滴液清洗正常形态的卵子，培养至次日。

※清洗前，由于卵子的透明带上会附着许多精子，所以用装上枪头的自动移液器，把受精用培养皿的CARD MEDIUM^® 滴液移液20~30次后，才清洗卵子。

※清洗的时候，请注意，尽量不要把CARD MEDIUM^® 带入到清洗卵子用培养皿的滴液里。

4、 受精6个小时后，仔细观察卵子，摘取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。
5、 次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

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◆材料

1、用CARD冷藏运输试剂盒运输的小鼠附睾尾
2、FERTIUP^® 精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、mHTF
4、电动移液器（GILSON PIPETMAN P-200）
5、黄色枪头（BM机器 Cat.No.110-96R）
6、流动石蜡（nacalai Cat.No.26137-85）
7、培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
8、解剖用的剪刀（夏目制造所 小直剪刀 Cat.No.B-12）
9、解剖用的钳子（夏目制造所 尖钳子 Cat.No.A-45）
10、滤纸
11、CO₂ 培养箱

◆方法

1、 取出附睾尾的前30分钟，制作精子预孵用培养皿（一个100μL FERTIUP^® 精子预孵培养基滴液），静置在培养箱里。

2、 从泡沫箱里取出保温瓶，再从保温瓶内的纸盒里取出装有附睾尾的0.2mL EP管。
3、 打开0.2mL EP管的盖子，取出附睾尾放在滤纸上，擦干附睾尾表面的冻存液。

※用剪刀和钳子来除去附睾尾上留有多余的脂肪、组织、血液。

4、 在清洗用培养皿的mHTF滴液内清洗3次附睾尾，用滤纸擦干附睾尾上mHTF。
※清洗用培养皿（3个大约100μL 的mHTF滴液），取出的附睾尾直接在此清洗。

5、 把附睾尾浸泡在精子预孵用培养皿的流动石蜡里。

6、 在附睾尾部采集精子，供体外受精用，采集的精子进行体外受精的步骤与用新鲜精子受精的步骤相同。

要点：在附睾尾的切口处采集精子时，如果精子难以露出，就往切口处再切深点，尽量采集更多的精子。

注意：用冷藏精子的受精培养基（CARD MEDIUM^®)的调试方法与用新鲜精子受精的方法有差异，请详细阅读受精培养基的使用说明，准备受精用培养皿。

小鼠生殖工程学技术——3小鼠附睾尾部的低温运输

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◆材料

1、成年的雄性小鼠
2、解剖用的剪刀（夏目制造所  小直剪刀Cat.No.B-12）
3、解剖用的钳子（夏目制造所 尖钳子Cat.No.A-5）
4、自动施夹钳（日本Becton, Dickinson and Company Cat.No.427630）
5、自动缝合器（日本Becton, Dickinson and CompanyCat.No.427631）
6、麻醉剂
7、加热盘
8、纽扣式温度记录仪（KM  Laboratories 温度记录仪 Thermochron  G type）
9、0.2ml  Ep管(注入冻存液)
10、CARD冷藏运输试剂盒
（1）棉花
（2）纸盒
（3）保温瓶
（4）制冷剂（小）
（5）制冷剂（大）
（6）泡沫箱
※ 纽扣式温度记录仪，0.2mL  EP管（装入冻存液）和CARD 冷藏运输试剂盒，预先放进4～8℃的冰柜里，使用时直接从冰柜里取出，并迅速进行实验。

◆方法

单侧附睾尾采集

术前，用酒精消毒全部解剖工具。
1、麻醉一只12周龄以上的雄性小鼠，使其仰卧。
2、用酒精棉消毒阴囊附近的位置（消毒后，如阴囊没有胀大，可能是因为睾丸缩入腹腔，只要用手指轻按下腹部，睾丸就会移回阴囊内）。
3、切开阴囊单侧，露出附睾尾。
 

4、切断输精管与附睾体，取出附睾尾（即使不能完全去除尾部的血液与脂肪也不会影响运输）
 

【采集的附睾尾和脂肪块】

※附睾尾内部的细管（附睾管）构造盘旋曲折，注意仔细观察，不要与其他内脏混淆。

要点：取出附睾尾时，为了不伤尾部，可按压着脂肪一起取出。
                  睾丸移回体内时，为不伤睾丸，请按压着切开的肌层一起移回。

5、用自动缝合器，缝合切开的皮层（也可用缝合线）

※如要采集两个附睾尾时，也按照3~5步骤进行。
6、让小鼠仰卧在加热盘上，从麻醉到苏醒期间，保持小鼠的温度。

※取出单侧附睾尾的小鼠，在术后1周内可以与其他小鼠进行交配。

冷藏运输附睾尾

1、从冰柜里取出0.2mL EP管（装有冻存液），让附睾尾沉入冻存液里，用封口膜缠绕0.2mL EP管的盖子。

2、在纸盒内放入0.2mL EP管和纽扣式温度记录仪，用棉花覆盖后盖上盖子。

3、纸盒放进保温瓶内。

4、在保温瓶内放进两个制冷剂（小）。
 

5、盖上保温瓶盖。
 

6、确认盖子盖紧后，在泡沫箱里铺上制冷剂（大），把保温瓶放进里面（这时，注意不要颠倒保温瓶内的0.2mL EP管）。接着，在保温瓶的两侧及上方，都放上制冷剂（大），盖上泡沫箱盖子后，用包装胶带牢牢捆扎。
 
7、用快递运输前，把整个泡沫箱放进冰柜内保存。

8、快递（冷藏）运输（最长可保存72个小时）

小鼠生殖工程学技术——5冻存运输小鼠２细胞期胚胎

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◆材料

1.     2细胞期胚胎（新鲜或冻融复苏后的胚胎）

2.     培养皿（coring　35mm X 10mm　Cat.No.430588）

3.     电动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-200）

4.     M２ Medium (Sigma Cat.No.M7167)

5.     0.5 mL EP管（Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5 mL, Fisher Scientific Cat.No. FS-MCT-060-C）

6.     微管

7.     KSOM/AA

8.     流动石蜡（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）

9.     纽扣式温度记录仪（KN Laboratories temperature data logger Samokuron G type）

10.  CARD 冷藏运输试剂盒

o    纸盒（free-s1 Cat.No. 11-1585）

o    棉布

o    保温瓶（Thermos Co., Ltd.　Cat.No.JMK-501）

o    冰袋（小）（Kyoritsu Co., Ltd.　冰袋雾凇　Cat.No. H-120）

o    冰袋（大）（shiro产业　冰袋R 500g 140 mm×250 mm、Cat.No. M250R-50）

o    泡沫箱（KARUX　KC-3）

◆步骤

2細胞期胚胎的冻存

１.　用移液器（P-200）在培养皿上制作两个１００μL M２的滴液（不要被流动石蜡覆盖）。
２.　把冻存的胚胎从被流动石蜡覆盖着的培养液里移至到一个M2滴液里。

３.　更换新的微管，将胚胎从一个M2滴液移至另一个M2滴液里。

      ＊把从被流动石蜡覆盖的培养液滴液移至制作好的M2滴液里的胚胎移至到另一个M2的滴液时，尽量避开附着流动石蜡的滴液位置。

４.　往０.５mL EP管内加入０.６mL的M２。 
    

    ＊如果EP管顶部留有气泡时，需轻拍出气泡。

５.　从3个滴液里取出胚胎后放置在装满０.６mL的M２０.５mL EP管底部（一只EP管能放40个2细胞期胚胎）。

＊ 移动胚胎后，在3个滴液里移液，确认微管里是否残留胚胎。

６.　合上EP管盖子，并用封口膜包封。
７.　在纸盒里装入EP管、纽扣式温度记录仪和棉布后，盖上盒盖紙箱。
　　 M２、紙盒、EP管、纽扣式温度记录仪和棉布全在室温（20～25°C）下使用。

８.　纸盒保存在冷冻柜里（最长可保存72小时）。 

2細胞期胚胎的冷藏运输

与上述冻存步骤一样，把EP管放进纸盒（2细胞期胚胎的冻存1~7步）后，按以下操作包装纸盒。

样品是常温的情况只需用保温瓶和小冰袋，4~8°C冻存的样品，则需要使用泡沫箱及大冰袋，包装时动作要迅速。

１.　把纸盒放进保温瓶内。

２.　再放进两个小冰袋至保温瓶内。 

３.　紧紧盖上保温瓶盖。

４.　确认瓶盖盖紧后，在泡沫箱内铺上大冰袋，然后放入保温瓶（这时，请注意请勿倒放保温瓶里装有胚胎的EP管）。 接着，保温瓶两侧也放上大冰袋。最后用包装带固牢泡沫箱盖。 

５.　用快递运送，整个泡沫箱保存在（４～８°C）冷冻柜里。

６.　用快递冻存运输最长保存时间可达72小时。
    

  ＊冬季的室外气温会低至０°C以下，如果运输过程中泡沫箱长时间放置在室外，2细胞期胚胎就会死亡。寄方应首先联系附近的快递配送站，跟他们强调泡沫箱内放有活细胞，请注意切勿放置在室外。

更改 : 2013.03.06 放有2细胞期胚胎的纸盒与冰袋放进保温瓶的顺序互换，因为先放冰袋后放纸盒，使纸盒难以受到内外气温差的影响，原页面请点击此处。

从冷藏运输试剂盒里取出2期细胞胚胎

1. 　注入3滴100μL 的KSOM/AA在培养皿上，然后用流动石蜡覆盖。把培养皿放入培养箱里孵育至少30分钟。 

2. 　从保温瓶里取出放有样品的纸盒。

3.　 纸盒在室温下放置30分钟。

       注意: 胚胎将在30分钟内沉在EP管底部。

4.　 打开纸盒，轻轻地取出棉花，一旦取出棉花后，要拿起装有胚胎的EP管，并打开盖子。

5. 　用灌注凝胶枪头收集EP管中M2上清液200μL，然后转移到培养皿的边缘。

6. 　用灌注凝胶枪头小心地把全部M2包括在EP管底部的胚胎移至培养皿的中心。
      注意: 为了方便操作，在使用移液器时尽量避免吸入空气。

7.  　从M2里采集的胚胎，分别转移至3个100μL KSOM/AA 滴液中，进行清洗。

 注意:  如果不能移走所有的胚胎，可以用培养皿边缘上的200μL M2滴液来清洗EP管内部。

8.　 然后把胚胎移植到代孕小鼠的输卵管内。

　  注意:　理论上，在胚胎清洗完至移植到代孕小鼠体内的这一过程需在短时间内完成。 (请参考“胚胎移植入输卵管”)

小鼠生殖工程学技术——7冻存小鼠胚胎

便捷的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

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◆材料

1. 　1M DMSO (Cat. CSR-R-T072)

2. 　DAP213 (Cat.# CSR-R-T073)

3.　培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

4.　过滤装置(Millex-GV 0.22µm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)

5.　灌注凝胶枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)

6.　移液管

7.　冻存管(Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan is recommended. If you cannot get it, use 366656; NUNC.)

8.　微管

9.　冻存架

10.　Nalgene 冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)

11.　液氮

12.　显微镜.

13.　0.25 M 蔗糖

14.　KSOM/AA

15.　液体石蜡

◆步骤

冷却器和冻存管的准备

1. 　使用前一天，把冷却器放置-20°C 的冷藏库里。

2. 　在实践玻璃化步骤的前10分钟，从冷藏库里取出冷却器。

3. 　冻存管放入冷却器里 (5115-0012; NALGENE, USA)。
       一只冻存管能装大约40个胚胎，换而言之，当你想装120个胚胎时，你需要放3只冻存管在冷却器里。

4. 　开始实验之前，请检查冻存管内的温度是否为0°C 。

玻璃化

1. 　过滤1M DMSO后，在培养皿上滴入4个滴液（~100µL / 个）。其中一滴用于清洗从培养基里采集的胚胎，其余三个用于存放已清洗的胚胎。

2. 　把全部胚胎放入其中一个滴液里，清洗沾有培养基的胚胎。清洗后的胚胎平均放进其余的3个滴液里。这3个等份的胚胎最终将会转移至储存小瓶里。

例如，采集了120个胚胎，分成3个等份，每一等份40个，这些胚胎首先会一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放进3个滴液里。

3.　使用20µL移液管和灌注凝胶枪头 , 转移5µL 的1M DMSO溶液的胚胎至冻存管内。转移后，立即将冻存管放置0°C 冷却器内5分钟。

注意: 冻存管可以放在0°C 冷却器中超过5分钟 (<20分钟)。

       注意: 如果胚胎都集中在滴液的中央，就能把全部胚胎轻易地吸进5µL 的M DMSO 溶液中。

4.　在0°C 下，往冻存管里加入45µL 的冻存液(DAP213) ，并在在0°C冷却器里静置5分钟。 

注意: 加入 DAP213冻存液后，不要把低温管的塞子拧得太紧，否则胚胎复苏后很难快速转移。

5.　迅速将冻存管放到冻存架上，然后直接放进液氮里。

参考文献

【1】 Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fert. 87: 479-483.

【2】 Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 77-80.

【3】 Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp. Anim. 44: 1-8.

【4】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234. 118.

小鼠生殖工程学技术——8胚胎移植入输卵管

在实验中，我们通过输卵管壁将2细胞期胚胎移植入代孕小鼠体内。与传统胚胎移植的过程相比，更简易，而且适合没有经验的实验操作员。

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◆材料

1.　假孕第一天的雌性小鼠(这天观察小鼠阴栓)

2.　微型弹簧剪刀（5mm刀片）

3.　钳子（Pair of watchmaker's #5 forceps）

4.　动脉夹

5.　伤口缝合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

→clip applicator

6.　塑料培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

7.　用于胚胎的移植和操作的玻璃微管

◆步骤

准备小鼠

1.　麻醉一只雌性小鼠。

2.　常规方法是取出卵巢、输卵管及部分子宫。

3.　用动脉夹固定附着在卵巢囊上的脂肪

定位输卵管

如下图所示，通过切割输卵管，往切口处插入微管，然后朝输卵管的壶腹部注入胚胎。

但是，正如我们所看到的输卵管的图示(A)，小鼠的输卵管呈细微而复杂的折叠式结构。而且，微管是从上方插入的，胚胎难以到达输卵管的壶腹部。

为了简化此过程，在操作前，可以通过动脉夹来改变输卵管的定位，如图(B)。

1.   立体显微镜下观察输卵管，并使用钳子的尖端来确认输卵管伞部和壶腹部的位置，或者改变动脉夹的位置。

2. 　通过改变动脉夹和小鼠的位置来定位输卵管。

      注意：因为每只小鼠的输卵管折叠形状都不一样，需要仔细观察和定位输卵管才能更容易地进行实验。
      注意：如果你是左撇子，就能轻易地完成定位输卵管的步骤。

胚胎与玻璃微管的制备

１.   在培养皿上制作一个200μL的 KSOM/AA滴液 (无液体石蜡)，然后在滴液里放入20个胚胎。

2.   制作转移胚胎的玻璃微管，管内的空气和溶液交替间隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10个胚胎。

     注意：如上图所示，当玻璃微管首次插入滴液时，液体石蜡会残留在滴液的表面。玻璃微管应从另一边吸入胚胎，以免吸入液体石蜡。

有证据表明，如果输卵管沾上液体石蜡会对胚胎发育造成不利的影响。 

转移胚胎

１.   使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型弹簧剪刀，解剖伞部和壶腹部之间的输卵管壁。

2.　将含有胚胎的微管插入输卵管的切口处，朝壶腹部注入胚胎。

3. 　用钳子固定微管插入的输卵管的位置。

4. 　排出胚胎和2~3个气泡到壶腹部处。

注意： 如果实验进程顺利，你可以通过壶腹部的壁看到气泡。

　　注意：如果你无法将胚胎和气泡排进输卵管，稍微往后移动玻璃微管，再次尝试。 

5.　将切口处的微管移走。

注意：调整输卵管的位置和方向后才能转移胚胎。如果微管平行对齐输卵管，就能更容易地插入输卵管内。 

6.　把卵巢、输卵管和子宫放回小鼠的腹部，用伤口缝合器缝合伤口。 

7.　重复上述步骤，把剩余的10个胚胎移植到另一只小鼠的输卵管内。

8.　在37°C 加热板上保持小鼠的体温，直到小鼠苏醒。

参考文献

【1】  Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.

【2】  Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.

小鼠生殖工程学技术——10复苏玻璃化冷冻后的胚胎的步骤

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◆材料

１、　0.25 M 蔗糖
２、　KSOM/AA
３、　培养皿（Corning　35mm X 10mm　Cat.No.430588）
４、　蓝色枪头（BM器材　Cat.No.111-R100S）
５、　微管
６、　自动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-1000）
７、　解剖针（夏目制造所　Broach holder　Cat.No.E-14）
８、　酒精灯（或者台式微型煤气燃烧器　Cat.No.RK4102）
９、　CO₂培养箱（37°C　5% CO₂　95% air）

◆步骤

准备清洗胚胎用的培养皿和蔗糖溶液

１.　首先制作清洗复苏后胚胎的培养皿，静置在CO₂培养箱内30分钟以上，稳定内部气体。

２.　预先在CO₂培养箱内加热0.25 M 蔗糖溶液。

胚胎的复苏

1. 　从液氮储存器内取出冻存的EP管后，立刻打开盖子，倒掉EP管内的液氮，在室温下静置30秒。

2.　用自动移液器把0.9ml已预热到37°C的0.25 M 蔗糖溶液添加进EP管内，在蔗糖溶液完全溶进冻存液前要迅速移液（10次左右）。
　

　* 融解后的冻存液在常温下细胞毒性很强，因此需要迅速往EP管内添加0.25 M 蔗糖稀释冻存液。

移液

１.　如下图所示，首次移液需迅速把0.9mL 0.25 M 蔗糖溶液转移至EP管内加热（请注意如果枪头的尖端接触冻存液，枪头内的蔗糖溶液会冻结并阻塞在枪头的尖端）。

２.　第二次以后的移液，就按照下图蓝色箭头所示小幅度移液。

此外，第二次以后的移液，以免损坏胚胎，应小心且迅速有序地移液加热胚胎。（移液的速度请参考以下视频） 

３.   使用自动给移液器，将冻存液和蔗糖溶液的混合溶液移至培养皿上，接着用0.4~0.5mL的0.25 M 蔗糖溶液清洗EP管。

注意：移液时，尽量避免产生气泡。在混合溶液移至培养皿上时，如果溶液表面产生气泡，气泡会阻碍取回胚胎，此时可用酒精灯加热解剖针的尖端，然后刺破气泡。

胚胎复苏时移液要点：请注意，移液过程中如果枪头内有气泡，混合溶液移至在培养皿后，溶液表面产生的大量气泡会导致难以在显微镜下观察胚胎，无法取回胚胎。

４.   直接从混合溶液里取出胚胎，小心地导入预先制作好（清洗前30分钟以上开始准备）、清洗胚胎的培养皿上的KSOM/AA滴液里，静置在培养箱内10分钟。

静置10分钟后 

５.　用剩下的KSOM/AA滴液清洗胚胎两遍。

参考文献

【1】  Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos

    by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.PDF