小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

 

 回到小鼠生殖工程学技术指南目录

  回到小鼠生殖工程冻存及培养试剂

◆材料

1、用CARD冷藏运输试剂盒运输的小鼠附睾尾
2、FERTIUP^® 精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、mHTF
4、电动移液器（GILSON PIPETMAN P-200）
5、黄色枪头（BM机器 Cat.No.110-96R）
6、流动石蜡（nacalai Cat.No.26137-85）
7、培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
8、解剖用的剪刀（夏目制造所 小直剪刀 Cat.No.B-12）
9、解剖用的钳子（夏目制造所 尖钳子 Cat.No.A-45）
10、滤纸
11、CO₂ 培养箱

 

◆方法

1、 取出附睾尾的前30分钟，制作精子预孵用培养皿（一个100μL FERTIUP^® 精子预孵培养基滴液），静置在培养箱里。

2、 从泡沫箱里取出保温瓶，再从保温瓶内的纸盒里取出装有附睾尾的0.2mL EP管。
3、 打开0.2mL EP管的盖子，取出附睾尾放在滤纸上，擦干附睾尾表面的冻存液。

※用剪刀和钳子来除去附睾尾上留有多余的脂肪、组织、血液。

4、 在清洗用培养皿的mHTF滴液内清洗3次附睾尾，用滤纸擦干附睾尾上mHTF。
※清洗用培养皿（3个大约100μL 的mHTF滴液），取出的附睾尾直接在此清洗。

5、 把附睾尾浸泡在精子预孵用培养皿的流动石蜡里。

6、 在附睾尾部采集精子，供体外受精用，采集的精子进行体外受精的步骤与用新鲜精子受精的步骤相同。

要点：在附睾尾的切口处采集精子时，如果精子难以露出，就往切口处再切深点，尽量采集更多的精子。

注意：用冷藏精子的受精培养基（CARD MEDIUM^®)的调试方法与用新鲜精子受精的方法有差异，请详细阅读受精培养基的使用说明，准备受精用培养皿。

小鼠生殖工程学技术——3小鼠附睾尾部的低温运输

 回到小鼠生殖工程学技术指南目录

  回到小鼠生殖工程冻存及培养试剂

◆材料

1、成年的雄性小鼠
2、解剖用的剪刀（夏目制造所  小直剪刀Cat.No.B-12）
3、解剖用的钳子（夏目制造所 尖钳子Cat.No.A-5）
4、自动施夹钳（日本Becton, Dickinson and Company Cat.No.427630）
5、自动缝合器（日本Becton, Dickinson and CompanyCat.No.427631）
6、麻醉剂
7、加热盘
8、纽扣式温度记录仪（KM  Laboratories 温度记录仪 Thermochron  G type）
9、0.2ml  Ep管(注入冻存液)
10、CARD冷藏运输试剂盒
（1）棉花
（2）纸盒
（3）保温瓶
（4）制冷剂（小）
（5）制冷剂（大）
（6）泡沫箱
※ 纽扣式温度记录仪，0.2mL  EP管（装入冻存液）和CARD 冷藏运输试剂盒，预先放进4～8℃的冰柜里，使用时直接从冰柜里取出，并迅速进行实验。

◆方法

单侧附睾尾采集

术前，用酒精消毒全部解剖工具。
1、麻醉一只12周龄以上的雄性小鼠，使其仰卧。
2、用酒精棉消毒阴囊附近的位置（消毒后，如阴囊没有胀大，可能是因为睾丸缩入腹腔，只要用手指轻按下腹部，睾丸就会移回阴囊内）。
3、切开阴囊单侧，露出附睾尾。
 

4、切断输精管与附睾体，取出附睾尾（即使不能完全去除尾部的血液与脂肪也不会影响运输）
 

【采集的附睾尾和脂肪块】

※附睾尾内部的细管（附睾管）构造盘旋曲折，注意仔细观察，不要与其他内脏混淆。

要点：取出附睾尾时，为了不伤尾部，可按压着脂肪一起取出。
                  睾丸移回体内时，为不伤睾丸，请按压着切开的肌层一起移回。

5、用自动缝合器，缝合切开的皮层（也可用缝合线）

※如要采集两个附睾尾时，也按照3~5步骤进行。
6、让小鼠仰卧在加热盘上，从麻醉到苏醒期间，保持小鼠的温度。

※取出单侧附睾尾的小鼠，在术后1周内可以与其他小鼠进行交配。

冷藏运输附睾尾

1、从冰柜里取出0.2mL EP管（装有冻存液），让附睾尾沉入冻存液里，用封口膜缠绕0.2mL EP管的盖子。

2、在纸盒内放入0.2mL EP管和纽扣式温度记录仪，用棉花覆盖后盖上盖子。

3、纸盒放进保温瓶内。

 

4、在保温瓶内放进两个制冷剂（小）。
 

5、盖上保温瓶盖。
 

6、确认盖子盖紧后，在泡沫箱里铺上制冷剂（大），把保温瓶放进里面（这时，注意不要颠倒保温瓶内的0.2mL EP管）。接着，在保温瓶的两侧及上方，都放上制冷剂（大），盖上泡沫箱盖子后，用包装胶带牢牢捆扎。
 
7、用快递运输前，把整个泡沫箱放进冰柜内保存。

8、快递（冷藏）运输（最长可保存72个小时）