小鼠生殖工程学技术——7冻存小鼠胚胎

便捷的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

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◆材料

1. 　1M DMSO (Cat. CSR-R-T072)

2. 　DAP213 (Cat.# CSR-R-T073)

3.　培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

4.　过滤装置(Millex-GV 0.22µm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)

5.　灌注凝胶枪头 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)

6.　移液管

7.　冻存管(Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan is recommended. If you cannot get it, use 366656; NUNC.)

8.　微管

9.　冻存架

10.　Nalgene 冷却器 (5115-0012; NALGENE, USA)

11.　液氮

12.　显微镜.

13.　0.25 M 蔗糖

14.　KSOM/AA

15.　液体石蜡

◆步骤

冷却器和冻存管的准备

1. 　使用前一天，把冷却器放置-20°C 的冷藏库里。

2. 　在实践玻璃化步骤的前10分钟，从冷藏库里取出冷却器。

3. 　冻存管放入冷却器里 (5115-0012; NALGENE, USA)。
       一只冻存管能装大约40个胚胎，换而言之，当你想装120个胚胎时，你需要放3只冻存管在冷却器里。

4. 　开始实验之前，请检查冻存管内的温度是否为0°C 。

玻璃化

1. 　过滤1M DMSO后，在培养皿上滴入4个滴液（~100µL / 个）。其中一滴用于清洗从培养基里采集的胚胎，其余三个用于存放已清洗的胚胎。

2. 　把全部胚胎放入其中一个滴液里，清洗沾有培养基的胚胎。清洗后的胚胎平均放进其余的3个滴液里。这3个等份的胚胎最终将会转移至储存小瓶里。

例如，采集了120个胚胎，分成3个等份，每一等份40个，这些胚胎首先会一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放进3个滴液里。

3.　使用20µL移液管和灌注凝胶枪头 , 转移5µL 的1M DMSO溶液的胚胎至冻存管内。转移后，立即将冻存管放置0°C 冷却器内5分钟。

注意: 冻存管可以放在0°C 冷却器中超过5分钟 (<20分钟)。

       注意: 如果胚胎都集中在滴液的中央，就能把全部胚胎轻易地吸进5µL 的M DMSO 溶液中。

4.　在0°C 下，往冻存管里加入45µL 的冻存液(DAP213) ，并在在0°C冷却器里静置5分钟。 

注意: 加入 DAP213冻存液后，不要把低温管的塞子拧得太紧，否则胚胎复苏后很难快速转移。

5.　迅速将冻存管放到冻存架上，然后直接放进液氮里。

参考文献

【1】 Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fert. 87: 479-483.

【2】 Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 77-80.

【3】 Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp. Anim. 44: 1-8.

【4】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234. 118.

小鼠生殖工程学技术——8胚胎移植入输卵管

在实验中，我们通过输卵管壁将2细胞期胚胎移植入代孕小鼠体内。与传统胚胎移植的过程相比，更简易，而且适合没有经验的实验操作员。

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◆材料

1.　假孕第一天的雌性小鼠(这天观察小鼠阴栓)

2.　微型弹簧剪刀（5mm刀片）

3.　钳子（Pair of watchmaker's #5 forceps）

4.　动脉夹

5.　伤口缝合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

→clip applicator

6.　塑料培养皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

7.　用于胚胎的移植和操作的玻璃微管

◆步骤

准备小鼠

1.　麻醉一只雌性小鼠。

2.　常规方法是取出卵巢、输卵管及部分子宫。

3.　用动脉夹固定附着在卵巢囊上的脂肪

定位输卵管

如下图所示，通过切割输卵管，往切口处插入微管，然后朝输卵管的壶腹部注入胚胎。

但是，正如我们所看到的输卵管的图示(A)，小鼠的输卵管呈细微而复杂的折叠式结构。而且，微管是从上方插入的，胚胎难以到达输卵管的壶腹部。

为了简化此过程，在操作前，可以通过动脉夹来改变输卵管的定位，如图(B)。

1.   立体显微镜下观察输卵管，并使用钳子的尖端来确认输卵管伞部和壶腹部的位置，或者改变动脉夹的位置。

2. 　通过改变动脉夹和小鼠的位置来定位输卵管。

      注意：因为每只小鼠的输卵管折叠形状都不一样，需要仔细观察和定位输卵管才能更容易地进行实验。
      注意：如果你是左撇子，就能轻易地完成定位输卵管的步骤。

胚胎与玻璃微管的制备

１.   在培养皿上制作一个200μL的 KSOM/AA滴液 (无液体石蜡)，然后在滴液里放入20个胚胎。

2.   制作转移胚胎的玻璃微管，管内的空气和溶液交替间隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10个胚胎。

     注意：如上图所示，当玻璃微管首次插入滴液时，液体石蜡会残留在滴液的表面。玻璃微管应从另一边吸入胚胎，以免吸入液体石蜡。

有证据表明，如果输卵管沾上液体石蜡会对胚胎发育造成不利的影响。 

转移胚胎

１.   使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型弹簧剪刀，解剖伞部和壶腹部之间的输卵管壁。

2.　将含有胚胎的微管插入输卵管的切口处，朝壶腹部注入胚胎。

3. 　用钳子固定微管插入的输卵管的位置。

4. 　排出胚胎和2~3个气泡到壶腹部处。

注意： 如果实验进程顺利，你可以通过壶腹部的壁看到气泡。

　　注意：如果你无法将胚胎和气泡排进输卵管，稍微往后移动玻璃微管，再次尝试。 

5.　将切口处的微管移走。

注意：调整输卵管的位置和方向后才能转移胚胎。如果微管平行对齐输卵管，就能更容易地插入输卵管内。 

6.　把卵巢、输卵管和子宫放回小鼠的腹部，用伤口缝合器缝合伤口。 

7.　重复上述步骤，把剩余的10个胚胎移植到另一只小鼠的输卵管内。

8.　在37°C 加热板上保持小鼠的体温，直到小鼠苏醒。

参考文献

【1】  Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.

【2】  Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.

小鼠生殖工程学技术——10复苏玻璃化冷冻后的胚胎的步骤

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◆材料

１、　0.25 M 蔗糖
２、　KSOM/AA
３、　培养皿（Corning　35mm X 10mm　Cat.No.430588）
４、　蓝色枪头（BM器材　Cat.No.111-R100S）
５、　微管
６、　自动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-1000）
７、　解剖针（夏目制造所　Broach holder　Cat.No.E-14）
８、　酒精灯（或者台式微型煤气燃烧器　Cat.No.RK4102）
９、　CO₂培养箱（37°C　5% CO₂　95% air）

◆步骤

准备清洗胚胎用的培养皿和蔗糖溶液

１.　首先制作清洗复苏后胚胎的培养皿，静置在CO₂培养箱内30分钟以上，稳定内部气体。

２.　预先在CO₂培养箱内加热0.25 M 蔗糖溶液。

胚胎的复苏

1. 　从液氮储存器内取出冻存的EP管后，立刻打开盖子，倒掉EP管内的液氮，在室温下静置30秒。

2.　用自动移液器把0.9ml已预热到37°C的0.25 M 蔗糖溶液添加进EP管内，在蔗糖溶液完全溶进冻存液前要迅速移液（10次左右）。
　

　* 融解后的冻存液在常温下细胞毒性很强，因此需要迅速往EP管内添加0.25 M 蔗糖稀释冻存液。

移液

１.　如下图所示，首次移液需迅速把0.9mL 0.25 M 蔗糖溶液转移至EP管内加热（请注意如果枪头的尖端接触冻存液，枪头内的蔗糖溶液会冻结并阻塞在枪头的尖端）。

２.　第二次以后的移液，就按照下图蓝色箭头所示小幅度移液。

此外，第二次以后的移液，以免损坏胚胎，应小心且迅速有序地移液加热胚胎。（移液的速度请参考以下视频） 

３.   使用自动给移液器，将冻存液和蔗糖溶液的混合溶液移至培养皿上，接着用0.4~0.5mL的0.25 M 蔗糖溶液清洗EP管。

注意：移液时，尽量避免产生气泡。在混合溶液移至培养皿上时，如果溶液表面产生气泡，气泡会阻碍取回胚胎，此时可用酒精灯加热解剖针的尖端，然后刺破气泡。

胚胎复苏时移液要点：请注意，移液过程中如果枪头内有气泡，混合溶液移至在培养皿后，溶液表面产生的大量气泡会导致难以在显微镜下观察胚胎，无法取回胚胎。

４.   直接从混合溶液里取出胚胎，小心地导入预先制作好（清洗前30分钟以上开始准备）、清洗胚胎的培养皿上的KSOM/AA滴液里，静置在培养箱内10分钟。

静置10分钟后 

５.　用剩下的KSOM/AA滴液清洗胚胎两遍。

参考文献

【1】  Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos

    by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.PDF 

小鼠生殖工程学技术——11安瓿瓶存储培养液和冻存液的方法

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◆材料 

１.　过滤系统（corning　250mL 孔径0.22μm　Cat.No.430767）
２.  50mL注射器（泰尔茂　Cat.No.SS-50ESZ）
３.　注射針（泰尔茂　18G　Cat.No.NN-1838R）
４.　安瓿管（maruemu　褐色安瓿 1mL 2mL 5mL　Cat.No.AP-1 AP-2 AP-5）
５.   氮气（GL科学公司　标准氮气推罐　Cat.No.1020-11203）
６.　简易安瓿熔封灯装置（BM　Cat.No.AY-1）
７.　安瓿熔封灯装置送风机（BM　Cat.No.LP-30A）

◆步骤

所有的培养基请进行批次间检测

１.　培养基、冻存液密封入安瓿管前要用0.22μm孔径的过滤器进行过滤灭菌。
２.　拧开并点燃安瓿熔封灯装置里气体的旋塞，调节吹风机的风量，让火焰呈蓝白色。

３.　用注射器往安瓿管里注入培养液，然后注入氮气，接着用钳子捏着安瓿管顶端，用火焰加热。
４.　安瓿管充分加热后，钳子迅速往上拉，封闭安瓿管口。

小鼠生殖工程学技术——12冻存、复苏小鼠未受精卵

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◆材料

１.    过量排卵处理的雌性小鼠
２.    培养皿（corning　35mm X 10mm　Cat.No.430588）
３.    流动石蜡（NacalaiTesque　Cat.No.26137-85）
４.    自动移液器（GILSON　PIPETMAN　P-20）
５.    黄色枪头（BM器材　Cat.No.110-96R）
６.    mTHF
７.    1%透明质酸酶溶液
８.    胎牛血清（Gibco Fetal Bovine Serum(FBS) Cat.No.26140-087）
９.    一次性过滤装置（微孔孔径：0.22μm　Cat.No.SLGVJ13SL）
10.    2.5mL注射器（泰尔茂Cat. No.SS-02SZ）
11.    微管
12.    CO₂培养箱（37°C　5% CO₂　95% air）
13.    可使用便捷玻璃化方法冻存和复苏胚胎时使用的相同器材和培养基。

       （用mHTF清洗复苏后的未受精卵） 

◆步骤 

培养皿的准备

1.    制作采集卵子用的培养皿（1个200μL的mHTF滴液），静置在培养箱内30分钟。

２.   制作清洗卵子用的培养皿（4个80μL的mHTF滴液），静置在培养箱内30分钟。

３、　适量制作含2０％FBS的mHTF溶液并进行过滤灭菌，然后制作处理FBS用的培养皿（2个100μL含20%FBS的mHTF滴液），静置在培养箱里30分钟以上 。

 去除卵丘细胞

1. 　从过量排卵的雌性小鼠里取出的卵子块放进采集卵子用培养皿上200μL 的mHTF滴液里。（一个滴液可容纳

5只小鼠的卵子块）。

要点：从小鼠安乐死至采集输卵管并将采集的卵子块导入mHTF滴液的这一过程操作要在极短时间内完成（30秒内）

要点：1个人做实验时，不要一次性让多只小鼠安乐死，应该一只只地进行，并迅速采集卵子。

２.　用自动移液器（P-20）将20μL 的1%透明质酸酶溶液添加进含有卵子块的200μL滴液里，静置在37°C的培养箱里1分钟。

３.　把去除卵丘细胞的卵子按顺序转移至80μL的mHTF滴液里（清洗卵子用的培养皿）。

要点：在37°C下清洗一分钟后，即使不能完全去除卵丘细胞，清洗的过程中卵丘细胞也会渐渐剥离。

４.　在卵子清洗用培养皿的mHTF滴液里清洗去除卵丘细胞的卵子3次。

胎牛血清的处理（FBS）

１.　 将未受精卵移至含20%FBS的mHTF的滴液（处理FBS用的培养皿）里，清洗2次，并培养10分钟。
　  ＊FBS有利于冻存和复苏过程中引起的未受精卵的透明带硬化。

未受精卵的冻存 

１.    去除卵丘细胞的未受精卵在含FBS的培养基里培养后，冻存和复苏操作与胚胎的步骤相同。

（用mHTF清洗复苏后的冻存精子）

用冻存、复苏后的未受精卵子进行体外受精

1.    新鲜精子、冷藏运输附睾尾部精子及用冻存精子进行体外受精的方法各有不同，请分别依照具体方法操作。

要点：使用的精子不同，体外受精用的受精培养基（CARD MEDIUM）的制备方法也不同。请仔细阅读受精用培养基的操作说明书准备受精用培养皿。 

参考文献

【1】Nakagata N, Takeo T, Fukumoto K, Kondo T, Haruguchi Y, Takeshita Y, Nakamuta Y, Matsunaga H, Tsuchiyama S, Ishizuka Y, Araki K. 2013. Applications of cryopreserved unfertilized mouse oocytes for invitro fertilization.Cryobiology.Oct；67（2）：188-92.

小鼠生殖工程学技术——13试剂的组成

试剂的组成包括 1M DMSO，磷酸二铵213，0.25M蔗糖，mHTF和KSOM

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1M DMSO

参考文献
【1】   Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation 

           of mouse embryosby simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.

DAP213

2M DMSO，1M乙酰胺，含3M丙二醇的PB1

PB1

溶液A

溶液B

DAP213 : 首先准备A溶液和B溶液，并让各自完全溶解。将等量的A、B溶液混合一起形成DAP213.

注意：加入DMSO时，溶液可能变得混浊。

参考文献

【1】  Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of

    mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.

0.25M 蔗糖

PB1

0.25M Sucrose in PB1

参考文献
【1】   Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of

     mouse embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.

mHTF

* 含量： 70%

参考文献
【1】   Kito S., Hayao T., Noguchi-Kawasaki Y., Ohta Y., Hideki U., and Tateno S. 2004. Improved in vitro

    fertilization and development by use of modified human tubal fluid and applicability of pronucleate

    embryos for cryopreservation by rapid freezing in inbred mice. Comp. Med. 54(5): 564-570.

KSOM

参考文献

【1】   Lawitts J.A., and Biggers J.D. 1993. Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol. 225:153-164.

小鼠生殖工程学技术——指南目录

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1.　小鼠精子的冻存
　　(使用Using FERTIUP Cryoprotectant, HTF, Sperm Straws, Straw connector and和Freezing canister)
2.　使用复苏精子进行体外受精
　　(使用FERTIUP Preincubation medium, CARD MEDIUM, HTF 和 Straw connector)

3. 　低温采集和运输附睾尾

　　(使用Card Cold Transport Kit)

4. 　使用低温运输的附睾尾精子进行体外受精
　　(使用 FERTIUP Preincubation Medium: PM 和HTF) 

5.　低温运输2-细胞期胚胎
　　( 使用Card Cold Transport Kit, M2 和KSOM)
6.　体外受精
　　(使用FERTIUP Preincubation medium, CARD MEDIUM 和HTF)
7.　便捷的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎
　　(使用DAP213 和DMSO)
8.　胚胎移植入输卵管

9.　用传统法冻存的精子进行体外受精

        (使用 FERTIUP Preincubation medium: PM, CARD MEDIUM 和HTF)
10.　复苏玻璃化冷冻后的胚胎的步骤
　　 (使用Using 0.25M sucrose 和 KSOM)

11.　在安瓿瓶里存储试剂和相关处理方法

12.　玻璃化冷冻复苏未受精卵
　　 (使用mHTF)

13.　试剂的组成

（1M DMSO, DAP213, 0.25M Sucrose, mHTF 和 KSOM）

小鼠生殖工程冻存及培养试剂

FERTIUP & CARD MEDIUM

小鼠精子冻存及体外受精培养基

可以保证和促进实验小鼠精子的冷冻保存效果，并能提高体外受精率。        FERTIUP®（小鼠精子冻存液、小鼠精子预孵培养基）和CARD MEDIUM®（高效体外受精培养基）是一种冻存小鼠精子、精子预孵及体外受精高效的的试剂。

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HyperOva

小鼠过量排卵诱导剂

CARD HyperOva是一款新型的小鼠过量排卵诱导剂，与传统法相比能诱导更过卵子排出的优秀过量排卵诱导剂。

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Card Cold Transport Kit

冷藏运输试剂盒

冷藏运输试剂盒能够安全地运输小鼠的附睾尾和胚胎。

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Mouse General Freezing and Culture Medium

小鼠生殖技术工程中使用的其他冻存和培养试剂

>以下是小鼠生殖技术中使用的产品
  HTF，KSOM，MWM，0.2M蔗糖，1M DMSO，磷酸二铵213

>mHTF培养基– 由CARD（动物资源与开发中心）推荐的产品，能提高小鼠生殖工程学中小鼠的体外受精率及生殖率

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FERTIUP & CARD MEDIUM Peripheral Products

小鼠生殖技术工程中使用的其他配件

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相关资料

【生殖工程指南】

【宣传册】

ARK and KYD-宣传页	CARD&FERTIUP-宣传页	HyperOva-宣传页
小鼠冻存相关	FERTIUP® 和CARD MEDIUM®  系列	小鼠生殖工程