如何选择合适的荧光基团？
Arun Kumar
标签：研究小技巧
荧光检测是一项高度灵敏的技术，广泛应用于生物技术、流式细胞术、医疗诊断、DNA测序、法医和遗传分析。在过去的20年中，由于高度复杂的荧光探针化学、商品化探针和新型显微方法的发展，荧光在生物科学领域的应用出现了显着的增长。Enzo提供由优质荧光分子探针组成的独特试剂组合，包括CELLESTIAL® 染料，可用于活细胞、固定细胞和透化细胞的可视化。本产品组合涵盖了用于药物研发，靶标、信号通路和细胞信号等高时空分辨率的动态细胞内分析，活性氧和活性氮物质（ROS / RNS）检测，细胞凋亡和细胞活力以及细胞器功能动力学等方面的产品。
荧光探针，也称为荧光基团，仅在用相应波长的光照射时才发出荧光。当光被荧光分子吸收时，它将电子的能级提高到激发态。受激发电子在很短的时间内保持高能状态，并通过释放光子返回基态。发射的光子/光通常携带较少的能量，并且发射的光总是比激发光子具有更长的波长。荧光基团激发和发射波长通常缩写为希腊字母λ，其下标为为“ex”（ excitation，激发光）或“em”（ emission，发射光），即λEX或λEM。来自荧光基团的激发和光子发射是循环的，直到荧光基团遭受不可逆损伤，称为光漂白。斯托克斯位移（Stokes shift）是给定荧光基团的最大激发波长和发射波长之间的纳米差异。因此可以将发射的荧光与激发光区分开。
荧光基团分为有机、合成低聚物、蛋白质和多组分系统。为了能够为特定应用选择合适的标签，重要的是要知道荧光的特性。荧光基团的特征在于它们的吸收和荧光特性，包括光谱分布、最大吸收和发射的波长，以及发射光的荧光强度。用于表征吸收光谱的最有用定量参数之一，是用希腊符号ε表示的摩尔消光系数。这是分子光吸收能力的直接度量。荧光基团的亮度由两个参数定义：其消光系数和量子产率。消光系数是给定波长下吸收光量的量度。因此，高消光系数将造成更多的光被吸收。量子产率是相对于吸收光子数量的发射光子数。在显微技术中用作探针的荧光分子的量子产率通常在0.05至1之间。通常情况下，在大多数成像应用中需要高量子产率。给定荧光基团的量子产率随着环境因素（例如金属离子浓度，pH和溶剂极性）而变化，有时变为极端极端。具有高量子产率的荧光基团如罗丹明，显示出最明亮的光发射。
在选择标签之前，确定接下来的实验类型很重要。理想情况下，荧光标记应该小、明亮且稳定，不会对生物系统造成任何干扰。此外，标记应该是特异性的，没有寡聚化倾向，并且可能同时标记多种蛋白质。应用于共聚焦技术的荧光基团，必须具有足以使仪器获得数据的亮度水平和信号持久性。对于许多应用，优选使用尽可能长的激发波长。在较长的波长下，样品吸光度较低，自发荧光较少，光源较便宜。虽然荧光基团设计的技术稳步前进，但目前的荧光团面临诸如光漂白、有限的细胞渗透性和强背景自发荧光等挑战。然而，科学家正在开发近红外（NIR）吸收在可见光范围内发射的合成分子。红色和NIR发射探针对于许多荧光应用是理想的。然而，具有高消光系数和高量子产率的红色NIR探针寿命也短暂。
图1：EQ染料是一系列非荧光染料，设计用于FRET应用中的荧光猝灭剂。 EQ荧光猝灭剂适合作为荧光共振能量转移（FRET）反应中的受体，因为它们具有广泛的可见吸收光谱但没有可检测的荧光发射。
目前已建立了使用荧光染料来鉴定细胞结构组分并监测细胞毒性，或细胞对生长信号的反应的方法。除了广泛选择的金标准标记染料，如DAPI，Hoechst和JC-1，Enzo Life Sciences还提供广泛的应用型荧光探针，针对特定的细胞内细胞器，如线粒体、溶酶体、高尔基体和内质网。我们将荧光探针化学和细胞分析方面的专业知识，转化为我们的CELLESTIAL® 系列基于探针的分析和试剂的独特组合，以满足生命科学和药物开发市场的新兴需求。它们是用于监测活细胞中各种生物过程的极其有用的工具，例如缺氧、氧化应激、细胞凋亡、自噬等，可使用共聚焦显微镜、流式细胞术和微孔板分析。可以在溶液中以高灵敏度进行实时测定。其他探针可以定量测量钙和锌离子通量。使用光谱仪可确定荧光团的最大激发和发射波长。每种产品为提供灵敏度、特异性和便利性而精心研发制作。
图2：NUCLEAR-ID® 红/绿染料用以检测活细胞细胞核（红染）和死细胞细胞核（绿染）（插图，箭头）。 活细胞（红色）：激发光：568nm; 发射光：632nm; 死细胞（绿色）：激发光：503nm; 发射光：524nm（左）。 NUCLEAR-ID® 蓝/绿染料用以检测活细胞细胞核（蓝染）和死细胞细胞核（荧光绿）（箭头）。 活细胞（蓝色）：激发光：350nm; 发射光：461nm; 死细胞（绿色）：激发光：503nm; 发射光：524nm（右）。
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