细胞外囊泡的荧光标记及其问题

富士フイルム和光純薬株式会社 生命科学研究所 請川亮

◆前言

　　以外泌体为代表的细胞外囊泡是各个细胞释放出的膜囊泡，它作为细胞间信息传递的使者和疾病生物标志物，近年来受到了极高的关注^1）。虽然近几年有关外泌体的研究在各领域中不断增长，但实验技术尚在发展阶段，还存在很多需要改善的问题。FUJIFILM Wako开发了一种新的亲和分离法——"PS亲和法"，与传统方法相比，能从各种样品中提取出完整且高纯度的外泌体，而且，该技术还成功开发出用于外泌体检测的PS亲和ELISA 法^2,3）。

　　在研究外泌体时，为了评价分离和提取出的外泌体的生物活性，通常会对细胞或动物进行投喂实验。利用荧光素标记进行可视化来确认对象中含有外泌体并进行追踪，是一种常见的技术。但是，如上述所说，外泌体的实验技术仍在发展，荧光素标记还存在需要注意的问题。本文讲述的是使用了不同品牌的荧光标记色素进行外泌体标记的研究，以及需要注意的问题。

◆在外泌体荧光标记实验中，去除未标记色素时的吸附损失

　　各品牌都将脂质、核酸或细胞膜的荧光标记试剂加以改造，使之成为包括外泌体在内的细胞外囊泡的特异荧光标记试剂。该标记方法是让从各个样品中分离、提取出来的外泌体样品与荧光色素进行反应，通过凝胶过滤或超滤装置去除未反应的荧光色素。在该荧光标记的过程中，特别是去除未反应的荧光标记时，会因吸附而损失大量的外泌体样品，同时，通过向外泌体样品添加FUJIFILM Wako开发的EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent（下面简称EV-Save），能强烈抑制吸附损失（图1）。用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS从COLO201细胞培养上清中分离、提取外泌体样品，先用A公司的荧光标记试剂进行标记，然后用B公司的凝胶过滤柱去除未反应色素。将获得的荧光标记外泌体样品加入HeLa细胞培养上清中，经过24小时的细胞吸收后，用荧光显微镜及流式细胞仪检测。在荧光色素标记时预先向样品中加入EV-Save，结果显示，细胞内的荧光信号比未添加EV-Save时大幅增强（图1、A, B）。用PS Capture™ Exosome ELISA Kit后再比较凝胶过滤前后外泌体样品的吸附损失， 未添加EV-Save的样品在凝胶过滤后没被检测到外泌体表面标记物CD63的信号，而添加了EV-Save的样品则检测到了CD63的信号，所以，EV-Save能有效抑制凝胶过滤引起的吸附损失（图1、C）。

图1．荧光标记外泌体样品的吸收确认与EV-Save抑制吸附损失的效果

用A公司的荧光标记试剂对MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分离的COLO201来源外泌体样品（1 ×10¹⁰ particles）进行标记后，再用荧光显微镜（A）和流式细胞仪（B）确认HeLa细胞吸收外泌体样品的情况。

准备同上的外泌体样品（5 × 10⁹ particles），可以用PS Capture™ Exosome ELISA Kit比较CD63信号来检测凝胶过滤前后的损失（C）。

◆使用了各种荧光标记试剂的外泌体染色方法及其特异性的问题

　　下面将对使用不同荧光标记试剂的外泌体荧光标记以及细胞的吸收能力进行比较。这次使用的是A、B、C公司的荧光标记试剂。用各种荧光标记试剂荧光标记以MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS从COLO201细胞培养上清中提取的外泌体样品，再确认HeLa细胞对外泌体样品的吸收情况（图2、A, B）。荧光显微镜观察发现，细胞内吸收了用不同荧光标记的外泌体（图2、A），且根据流式细胞分析，比较无添加对照以及标记Elution buffer的阴性对照，峰值位移大幅改变，所以能确定受体细胞吸收了荧光标记的外泌体（图2、B）。但是，用荧光标记试剂来标记1% BSA 溶液作为阴性对照，与其他样品一样加入细胞后，和荧光标记的外泌体样品进行同样的处理，在流式细胞分析中也观察到了峰值的变化（图2、B）。对此，各种荧光色素标记试剂不仅对外泌体，同样的原理它对蛋白也能进行标记，故在用作外泌体标记试剂时，特异性是一个较严重的问题。从上述结果可见，用市面上销售的荧光标记试剂进行标记，或进行细胞吸收外泌体的确认实验时，受体细胞中的荧光信号是外泌体本身的信号，还是外泌体分离时受污染的蛋白等杂质来源的信号，解释结果时需要特别注意，故在进行细胞吸收外泌体的确认验证时，外泌体样品纯度非常重要。

图2．使用了各种荧光标记试剂的外泌体标记与外泌体被HeLa细胞吸收的确认

用各种荧光标记试剂对MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分离的COLO201 来源外泌体样品（1× 10¹⁰ particles）进行标记，再用荧光显微镜（A）和流式细胞仪（B）确认HeLa细胞对外泌体样品的吸收情况。另外，作为对照，还准备了同样进行过荧光标记处理的试剂盒附带的Elution buffer和1%BSA 溶液，然后添加到细胞中（B）。

　　因此，通过FUJIFILM Wako PS亲和法和超离法从相同量的培养上清样品中分离、提取出外泌体样品，再用A公司的荧光标记试剂标记外泌体样品，进行细胞吸收外泌体的确认实验（图3）。荧光显微镜的分析结果表明，受体细胞吸收的由超离法分离、提取出的外泌体样品比PS亲和提取的外泌体样品更多（图3、A）。但是，详细分析提取外泌体样品时，尽管蛋白浓度和粒子数分析显示出超离样品含有更多的外泌体量，但是如果用PS Capture™ Exosome ELISA Kit检测外泌体标记物CD63信号，PS亲和法分离、提取的样品比用超离法分离、提取的外泌体样品的一个粒子的CD63信号和纯度更高（图3、B）。使用杂质多、污染严重的超离法制备外泌体样品时，受体细胞吸收的信号实体不仅来源于外泌体，也可能来源于杂质蛋白。

图3．比较PS亲和提取与超离提取外泌体的吸收的效率

用A公司的荧光标记试剂对用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS和超离法分离的COLO201 来源的外泌体样品（8 × 10⁹ particles）进行标记，然后在荧光显微镜下比较HeLa细胞吸收外泌体的效率（A）。各提取法配制的外泌体样品，以BCA assay 检测蛋白浓度，使用NanoSight的NTA检测粒子数，同时，通过PS亲和ELISA法检测CD63的信号（B）。

◆结语

　　在进行外泌体的荧光标记法和细胞吸收外泌体的确认时应该注意的两点是，外泌体具有的吸附特性与收量低下密切相关，现在市面上销售的荧光标记试剂不是以外泌体染色为目的而开发的，对外泌体的特异性较低。对于如何配制高纯度的外泌体样品，本文提出了分离、提取方法的重要性。但是至今为止，如多数论文报告主要采用的那样，分离、提取含有外泌体的细胞外囊泡的方法的黄金标准仍然是超离法，但实际上，超离法配制出的外泌体样品会混入很多非细胞外囊泡来源的杂质蛋白，我们仍在继续彻底评估污染物对下游实验结果的影响。International Society for Extracellular Vesicles的杂志《Journalof Extracellular Vesicles》也提到过这个问题^4）。以FUJIFILM Wako开发的"PS亲和法"为基础的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS还有待改善，但它比超离法和各种分离、提取试剂盒能相比，能更简便地提取高浓度的外泌体。衷心希望在未来FUJIFILM Wako的产品能有助于以外泌体为代表的细胞外囊泡研究的进一步发展。

◆参考文献

1） Tkach, M. et al . : Cell , 164, 1226（2016）.

2） Nakai, W. et al . : Sci. Rep ., 6, 33935（2016）.

3） Saito, S. et al . : Sci. Rep ., 8, 3997（2018）.

4） Gardiner C. et al . : J. Extracell. Vesicles , 5, 32945（2016）

◆产品列表

再生医学之细胞外囊泡疗法的新型工具箱

使用PS亲和法分离的MSC来源细胞外囊泡具有较高的抗炎和抗纤维化作用

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的微小脂质双分子层颗粒。如今，细胞外囊泡由于可以传递生物活性脂质、蛋白质和核酸，被公认为是细胞间通讯的重要信使。间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡，正成为未来再生医学中颇具前景的治疗策略。本文将介绍一种细胞外囊泡分离技术——PS亲和法，以及目前为止在再生医学中发现的实用性。

◆细胞外囊泡（EVs）

细胞外囊泡，包括外泌体和微囊泡，是由细胞释放的小于1,000 nm的脂质双层颗粒，同时带有标记蛋白CD9、CD63和CD81^1）。细胞外囊泡包含蛋白质、DNA、RNA和脂质等细胞成分，被认为是通过转移这些成分来进行细胞间的交流。

◆MSC来源细胞外囊泡

MSC是来源于间充质的干细胞，可以分化为脂肪、骨骼和软骨。MSC可以从骨髓、脂肪组织或脐带建立，使其成为有前景的未来再生医学的来源。已知MSC具有某些旁分泌效应，包括免疫抑制、抗炎和抗纤维化。最近的报告显示，这些影响是由MSCs释放的细胞外囊泡（EVs）引起的^3），这也是MSC来源细胞外囊泡（EVs）疗法受到关注的原因。

◆新型细胞外囊泡（EVs）分离技术-PS亲和法-

分离细胞外囊泡包括以下几种方法：已经经过长期应用的超速离心、密度梯度离心及针对表面抗原的抗体亲和法^4）。但是以上方法存在诸如回收率低、纯度低、不能收集完整囊泡、再现性差等问题。 对此，富士胶片和光与金泽大学的华山教授合作共同开发了一种新的PS亲和法，该方法可捕获表达于细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸（PS）^5）。PS亲和法利用的是与PS钙依赖性结合的Tim4蛋白。Tim4蛋白虽能与PS牢固结合，但也可由Ca²⁺螯合剂（如EDTA）释放。利用该特性，可开发出比传统方法的回收效率、纯度、收集完整囊泡和可重复性更佳的细胞外囊泡分离方法（图1）。

图1

A）通过PS亲和法进行的细胞外囊泡步骤

B）通过PS亲和法或UC分离EVs的透射电子显微镜图。箭头表示EVs。

◆PS亲和法可分离具有高活性的MSC来源细胞外囊泡

接下来要介绍的是我们最近在分离MSC来源细胞外囊泡中发现到的PS亲和法的价值。首先，通过PS亲和法或超速离心法（UC）从骨髓来源的MSC条件培养基中分离出细胞外囊泡。然后，通过PS ELISA比较每种分离方法的回收效率，一种PS亲和技术的细胞外囊泡定量法（图2A）。通过检测CD9、CD63或CD81分析细胞外囊泡的定量。结果显示，UC回收率为40％，而PS亲和法回收率为80％以上（图2B）。

图2

A）PS ELISA的原理

这是一种对细胞外囊泡进行定量的原创性技术，通过固定化Tim4蛋白和检测抗体分别实现捕获细胞外囊泡和检测细胞外囊泡的表面抗原。

B）通过PS亲和法或UC法分离的MSC来源细胞外囊泡的定量检测

检测抗体是抗CD9抗体、抗CD63抗体或抗CD81抗体。该图显示的是相对值，其中培养基的细胞外囊泡数量为100％。

PS ELISA法：PS Capture^TM外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）（298-80601；包括抗CD63抗体），抗CD9抗体（019-27953），抗CD81抗体（011-28111）。

此外，我们比较了每种方法分离出来的MSC来源细胞外囊泡活性并进行实验，以评估外周血单个核细胞（PBMC）的抗炎作用和正常人胎儿肺二倍体成纤维细胞（TIG3细胞）的抗纤维化作用。结果表明，通过PS亲和法分离的MSC来源细胞外囊泡比通过UC分离的细胞外囊泡具有更高的活性（图3、4）。

图3. MSC来源的细胞外囊泡对LPS诱发的炎症的作用

用LPS刺激由PBMC分离出的单核细胞来诱导炎症，然后添加由各方法分离出的4.5×10⁸粒子/ mL细胞外囊泡。结果发现，MSC来源的细胞外囊泡抑制了TNFα和IL-6基因表达的增强以及TGFβ基因表达的降低。PS分离的细胞外囊泡比UC分离的细胞外囊泡更具抑制作用。

图4. MSC来源的细胞外囊泡对纤维化的影响

用TGFβ刺激TIG3细胞并诱导纤维化相关基因增强表达，随后添加由各方法分离的1×10⁹ 粒子/ mL的细胞外囊泡。MSC来源的细胞外囊泡抑制了胶原III、αSMA和胶原V基因的升高，PS分离的细胞外囊泡比UC分离的细胞外囊泡更具抑制作用。

这个结果显示，PS亲合法能够以高回收率分离MSC来源的细胞外囊泡，同时保持细胞外囊泡的高活性。换言之，它揭示了传统方法除回收率低外，还因超速离心的物理损伤引致细胞外囊泡的功能的损害。我们的PS亲和法有望成为未来细胞外囊泡疗法的创新技术。

◆结论

综上所述，尽管基于细胞外囊泡的疗法在再生医学领域正备受关注，但经典方法（例如超速离心）仍被广泛用于分离细胞外囊泡^6）。PS亲和法是一种理想的方法，可解决传统方法带来的问题，例如回收效率低及降低细胞外囊泡的活性等。该试剂盒具有出色的回收效率、纯度、收集完整细胞外囊泡的能力及可重复性。不难设想，未来的再生医学将需要优化的细胞外囊泡分离方法，希望本文的PS亲和法将是实现这一目标的强大工具。

◆产品列表

◆视频

2020年ISEV研讨会：如何使用 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS

点击此处观看视频

[用于分离和检测间充质干细胞来源的细胞外囊泡的PS亲和力的特性]。

点击此处观看视频

◆产品资料

点击此处下载产品彩页，或向当地代理商索要纸质版本。

◆参考文献

细胞外囊泡的临床蛋白质组学分析

-关于血液循环细胞外囊泡的多样品自动纯化技术的开发-

医药基础·健康·营养研究所　蛋白质组研究项目　村冈贤、足立淳

◆前言

近年来，在癌症、神经疾病、心血管疾病、传染病等各类医学研究领域中，都在不断展开细胞外囊泡的研究。细胞外囊泡中含有蛋白、核酸和脂质等，这些组成成分因细胞或疾病而异，并且因其具有多种功能，会对疾病的病理变化产生很大的影响。因此，从血液等样品中提取的细胞外囊泡中用于疾病早期发现、监测、药效分析等的生物标志物，备受人们期待。

在本文中，作者会介绍至今为止进行过的神经退行性疾病相关的细胞外囊泡的功能分析和对生物标志物的探索，以及面向大规模蛋白质组学分析的用于血液来源细胞外囊泡的多样品自动纯化技术。

◆细胞外囊泡

细胞外囊泡是由各种组织和细胞分泌的被脂质双层膜所包围的膜囊泡的总称。由于分泌路径、生物合成和尺寸的不同，细胞外囊泡分为由多囊泡和细胞膜融合分泌到细胞外的外泌体（40-200 nm）；直接从细胞膜出芽并分泌到细胞外的微泡（200-1000 nm）；从发生细胞凋亡的细胞中分泌的凋亡小体（1000-5000 nm）这三类。我们可以从血液、尿液、唾液和脑脊液等体液中观察-到细胞外囊泡，其中包含各种蛋白、核酸和脂质等，对于细胞间的信息传递尤为重要^1）。

近年来，众多研究表明细胞外囊泡与恶性肿瘤、炎症性疾病和神经疾病等疾病相关，因此在探索用于疾病诊断，预后预测的生物标志物和面向治疗的应用研究中，细胞外囊泡备受期待^2）。此外，由于使用血液中细胞外囊泡的诊断属于微创诊断，可减轻患者在长期观察中的负担，同时捕捉疾病的变化，所以急需开发此类诊断方法。

◆神经退行性疾病相关的细胞外囊泡

随着年龄增长，神经退行性疾病的患病风险也会升高，所以对于老龄化日渐加剧的日本来说已是不容忽视的一类疾病。关于细胞外囊泡在阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和帕金森病等神经退行性疾病中作用的研究，在近10年已取得显著进展。

2006年Rajendran等人报告阿尔茨海默病病因之一的β淀粉样蛋白存在于细胞外囊泡的内外，并且细胞外囊泡的特异性蛋白ALIX存在于阿尔茨海默病患者大脑内的淀粉样斑块^3）。2012年Saman等人发现在过度表达致病因子之一的Tau蛋白的细胞中，分泌的细胞外囊泡内存在Tau蛋白^4）。

笔者已确认阿尔茨海默病患者脑组织来源的细胞外囊泡中存在的Tau蛋白中对聚集体形成非常重要的Serine396发生了磷酸化（pS396 tau）。其与对照组比较有显著地上升（图1a，b）^5）。另外，还确认到其Tau蛋白是以寡聚体的状态存在于细胞外囊泡内，作为小鼠、细胞实验中用于传播，聚集Tau的种子，与细胞外囊泡共同具有着重要的功能^6）。

此外，通过蛋白质组学分析了阿尔茨海默病的脑组织来源（蔗糖密度梯度离心法），脑脊液来源（MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS；FUJIFILM Wako，293-77601）的细胞外囊泡，比较ANXA5、PTGFRN和对照组发现这些蛋白的表达有所上升（图1c，d，e）^5，7）。

图1. 神经退行性疾病中细胞外囊泡的功能和生物标记开发

（a）透射电子显微镜下的细胞外囊泡 （b）存在于细胞外囊泡内外的Tau和磷酸化Tau （c）基于蛋白质组学分析的蛋白质表达量比较 （d）阿尔茨海默病患者脑组织来源细胞外囊泡的ANXA5的表达上升 （e）脑脊液来源细胞外囊泡的生物标记候选蛋白

CTRL：健康　　MCI：轻度认知障碍　　AD：阿尔茨海默病性痴呆　　＊：p < 0.05

虽然使用脑脊液监测疾病是优选，但提取脑脊液对患者来说负担沉重，所以希望能有微创的血液检查。因此笔者等人考虑使用多个检测样品的血液样品细胞外囊泡分析和评估候选蛋白，为了同时处理多个样品，并且消除人工操作的误差，我们开发了可自动纯化体液来源细胞外囊泡的技术。

◆血清和血浆来源细胞外囊泡的自动纯化技术开发

体液中含有大量的细胞外囊泡，考虑到其还包含了来源细胞的变化，因此使用大规模的临床检测样品进行细胞外囊泡蛋白的全面蛋白质组学分析正在盛行。至今已报告许多从血液中浓缩细胞外囊泡的方法，例如组合式离心法、平衡密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法、利用亲和性的纯化法等^8）。

由于不同方法分分离的细胞外囊泡也各异，而且含有杂质的比例也不同，所以可高纯度纯化细胞外囊泡的方法，以及标准化纯化方法非常必要。其中，基于与细胞外囊泡的磷脂酰丝氨酸具有高亲和性的Tim4蛋白的纯化法，与其他方法相比，可大幅度地抑制减少杂质并进行高纯度浓缩^9，10）。

高纯度纯化和浓缩细胞外囊泡可以降低蛋白的动态范围，能够在蛋白质组学分析中定性和定量微量蛋白。此外，为了实现大规模临床样品的蛋白质组学分析，开发重复性高的纯化系统尤为重要。

笔者等人通过使用96孔正压萃取装置对 96 份血清和血浆样品进行过滤前处理，并在 KingFisher Flex系统上使用了 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS，成功开发了一次性纯化96份样品的自动纯化技术（图2）。

图2. 使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS开发细胞外囊泡的自动纯化技术

◆血清和血液细胞外囊泡的蛋白质组学分析

笔者等人在通过对自动纯化技术纯化的细胞外囊泡进行了全面蛋白质组学分析，发现与手动纯化相比，自动纯化技术可以降低样品间的差异，在提高细胞外囊泡标志物的离子强度的同时，还能大幅度降低血液蛋白中的载脂蛋白B的离子强度（图3a）。

使用临床样品的分析中，成功定性了细胞外囊泡标志物在内的4079种蛋白，发现血清和血浆来源的细胞外囊泡中有部分蛋白的定量值差异较大（图3b）^11）。需要根据研究目的选择血清或血浆中的评估用蛋白。

图3. 自动纯化的血清和血浆来源细胞外囊泡的蛋白质组学分析

（a）手动和自动纯化的细胞外囊泡标志物的比较 （b）血清和血浆来源细胞外囊泡的蛋白质组学分析的结果

目前，研究人员使用自动纯化技术进行大规模临床样品的蛋白质组学分析，成功定性了脑组织来源细胞外囊泡的候选特异性标志物蛋白^11）。

◆结语

液体活检可以从含有血液或尿液的体液中检测或监测癌症、退行性疾病和传染病等，是一种备受期待的检测、监测方法，因此将细胞外囊泡应用于液体活检也备受瞩目，期待今后可以得到进一步的研究和开发。血液细胞外囊泡的蛋白质组学分析，不仅在标志物的探索，在阐明病理的机制中也能发挥作用，对于大规模临床样品分析有着重要作用。

本次我们开发的自动纯化技术可同时处理多个样品，重复性优异，还可以抑制血液蛋白的污染。此外，我们还实现了蛋白质组学分析前处理的自动化（论文投稿中），有望为疾病生物标志物探索以及诊断试剂盒的开发提供新的技术。

◆谢辞

神经退行性疾病的细胞外囊泡的研究是在波士顿大学（现Mayo clinic）池津庸哉老师的带领下进行的，细胞外囊泡的自动化纯化是在富士胶片和光纯药株式会社的协助下在医药基础研究所进行的。在此，表示衷心地感谢。

◆参考文献

  1. Kowal, J. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 113, E968 (2016).

  2. Shiromizu, T. et al. : Sci. Rep., 7, 12782 (2017).

  3. Rajendran, L. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103, 11172 (2006).

  4. Saman, S. et al. : J. Biol. Chem., 287, 3842 (2012).

  5. Muraoka, S. et al. : Alzheimers Dement., 16, 896 (2020).

  6. Ruan, Z. et al. : Brain, 21, 72 (2020).

  7. Muraoka, S. et al. : Cells, 9, 1959 (2020).

  8. Li, P. et al. : Theranostics, 7, 789 (2017).

  9. Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 (2016).

10. Muraoka, S. et al. : Methods, 177, 35 (2020).

11. Muraoka, S. et al. : iScieuce, (2022) in press, DOI 10.1016/j.isci.2022.104012

◆相关产品

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。

第一回 运用间充质干细胞来源的细胞外囊泡（外泌体）开发针对肝硬化的治疗方法

干细胞EV~治疗、诊断、化妆品未来发展~

新潟大学大学院 医齿学综合研究科 消化器内科学领域 寺井崇二、土屋淳纪

◆再生细胞治疗的开发现况

2003年，山口大学开始了世界首个应用 "自体骨髓细胞给药疗法 "治疗肝硬化的临床研究（于2003年11月14日开始临床研究）^1-4）。通过基础和临床研究表明，自体骨髓细胞移植治疗可以改善肝硬化的肝纤维化，并诱导肝硬化的肝再生。自2017年以来，有企业使用异体脂肪组织来源间充质肝细胞移植疗法来治疗失代偿期肝硬化（企业临床试验），并且目前也在进行由医生主导的失代偿期肝硬化的临床测试（图1）。

图1.

◆改善肝纤维化，对再生诱导起作用的细胞

2015年，新潟大学展开了旨在阐明骨髓中的有效细胞、改善肝纤维化和再生诱导机制、和以运用异体间充质干细胞为目标的研究。研究的结果表明，作为肝硬化模型治疗效果的表现机制，从外周移植的间充质干细胞主要迁移至肺部，作为 "指挥细胞"发挥作用。通过使巨噬细胞进入抗炎状态，诱导它们进入肝硬化区，可以诱导抗炎性巨噬细胞作为 "工作细胞"改善肝硬化导致的纤维化和再生（图2）^5-8）。另外，我们还着眼于肺部存在的间充质干细胞与作为工作细胞的巨噬细胞的连接分子细胞外囊泡（exosomes），并进行分析。研究发现，间充质干细胞分泌的外泌体，特别是干扰素-γ刺激的间充质干细胞，可将巨噬细胞转变为抗炎性巨噬细胞，改善肝纤维化并诱导肝再生^9）。此外，仅将这些外泌体施用于肝硬化模型中，就能改善肝纤维化并诱导肝再生（图3）。

图2. 

笔者改自：npj Regenerative Medicine volume 6, Article number:19(2021)

图3. 

◆临床治疗面临的挑战

为使用细胞外囊泡（exosomes）进行治疗，作为日本再生医疗学会的“外泌体等调整，治疗相关的WG委员“，目前准备开发运用新一代外泌体的治疗法。虽然已公开发表各类指南，但过去所开发的间充质干细胞等的培养过程，都建立在安全性的基础上。另外，在建立临床概念验证Proof of Concept（POC）方面，如何规定细胞外囊泡的数量和质量（内部蛋白、miRNA）也非常重要。目前已在耳鼻科领域实施First in man疗法^10）。图4是将来细胞外囊泡（exosomes）的治疗蓝图。期望将来制备出能生产诱导细胞组织修复的外泌体的设计细胞，并从中获得大量外泌体，最终以细胞移植或外泌体给药于细胞的方式来进行细胞治疗。

图4. 

◆相关产品

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒

PS Capture™ 外泌体流式试剂盒

EV-Up™ 间充质干细胞专用外泌体生产用培养基

◆参考文献

第三回 富士胶片和光纯药助力利用细胞外囊泡的治疗方法的实现

干细胞来源EV ~治疗，诊断，化妆品的开发~

富士胶片和光纯药株式会社 生产工序开发部 西部隆宏

◆前言

细胞外囊泡（Extracellular vesicle/EV）是由细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的微小囊泡的总称，包括外泌体和微囊泡等^1）。近年来，部分细胞（如间充质干细胞 [Mesenchymal stem cell : MSC] 等）来源的EV已被证明在疾病治疗方面发挥作用^2），由此促进了使用EV的治疗用试剂、与EV制剂的应用相关的技术开发。

本文将介绍富士胶片和光纯药提供的，参与EV的生成、提纯、保存、质量管理等一系列生成工序的技术以及产品。

◆使用MSC来源EV生成的优化培养基

近年来，我们对各种细胞来源EV的治疗应用进行了尝试，其中MSC来源EV的研究开发尤其受瞩目。事实上截至2022年，在利用EV进行的临床试验中就有六成以上使用了MSC来源EV^3）。另一方面，为了获得MSC来源EV而使用的培养液大部分都是传统的基本培养基，优化的培养条件目前尚未确定。

MSC来源EV的生成中大多使用两步工序：在血清培养基（含有牛胎儿血清（FBS）的基本培养基）中增殖MSC后，更换成不含FBS的血清培养基或已去除EV但含有FBS的血清培养基，使EV在培养上清液中生成。敝司针对上述的各阶段工序分别开发了优化培养基。

在MSC的增殖环节，敝司开发了能够使MSC在高品质的状态下高效进行增殖的培养基：MSCulture™（产品编号：133-19331、132-19345）。本培养基是添加了FBS的基本培养基，但与αMEM等传统基本培养基相比细胞增殖效率更高。另外也确认到增殖后的MSC生成的EV的生物活性也得到了提高（图1）。

另外，敝司也开发了用于MSC增殖后生成EV这一阶段的EV生成专用无血清培养基：EV-Up™（产品编号：053-09451、298-84001）。本培养基不仅能提高EV的生成量，还能通过抗纤维化活性确认到生物活性大幅上升^4）（图2）。

通过组合使用MSCulture™培养基与EV-Up™培养基，可高效获得高品质的MSC来源EV。在以MSC来源EV的治疗应用为目的进行研究时，请务必考虑使用上述两款培养基。

图1.  MSCulture™培养基中MSC的增殖能力上升与获得的EV的生物活性之间的对比结果

A）αMEM及MSCulture™培养基中MSC增殖时的细胞数对比

A）αMEM及MSCulture™培养基中各添加了15%的FBS进行测试

B）在各培养基中增殖MSC，从其中获得EV并使用EV-Up™培养基比较它们的抗纤维化活性

图2.  评估EV-Up™培养基中MSC来源EV的生成量和生物活性的结果

A）MSC在血清培养基中扩大培养后，培养基更换为去除EV、含FBS的DMEM或EV-Up™培养基。

A）对获得的培养上清液中提取的外泌体粒子数进行纳米粒子追踪分析后的检测结果

B）在抗纤维化评估中比较从A的各条件中获得的EV的生物活性的结果

◆特有的EV纯化技术、使用PS亲和法的EV纯化技术

敝司与现金泽大学医学部的華山教授合作，研究可应用于从EV生成后的培养上清中纯化EV的工序的技术，开发出了特有的EV纯化方法——PS亲和法^5）。使用了本技术的研究用EV纯化试剂MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver. 2（产品编号：290-84103）现已上市。

PS亲和法是使用了与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine : PS）特异性结合的T 细胞免疫球蛋白结构域和含有粘蛋白结构域的蛋白4（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4, 简称Tim4）亲和纯化方法，同时作为一种优秀的纯化方法，它在MSC来源EV培养上清液中的回收率约有80%。已确认在in vitro的抗纤维化活性评估、抗炎症活性评估中，通过PS亲和法纯化的EV表现出优秀的生物活性^6）（图3）。为了能够将此PS亲和法应用于EV制剂的生成，我们目前正在开发一种使用固定化Tim4蛋白质亲和柱的大规模纯化技术，公升级规模的培养上清液中的EV的亲和柱纯化将指日可待。

◆提高纯化后EV的保存稳定性的技术

由于纯化后的EV会吸附在管壁上，因此在处理时一般倾向于添加能够抑制EV的非特异性吸附的成分。我们向来非常重视EV的非特异性吸附这一问题，在处理EV时我们也推荐使用吸附抑制试剂——EV-Save™细胞外囊泡保存稳定剂 （产品编号：058-09261） 。经确认，此EV-Save™细胞外囊泡保存稳定剂不仅能抑制EV的吸附，还能使EV在冷冻保存时的稳定性得到提高（图4）。敝司十分重视提高EV制剂在生成时的EV吸附抑制和冷冻保存时的稳定性，为此开发了仅由已被用作医疗药品添加剂的成分组成的EV保存液（in vivo用EV-Save™ 细胞外囊泡保存稳定剂，产品编号：050-09461；图4）。目前本产品作为用于in vivo实验的研究用试剂进行销售，而由于使用了旨在用于医疗领域的成分，所以也十分推荐将其利用于EV制剂的研究开发。

图3.  使用PS亲和法进行MSC来源EV的纯化

A）基于PS亲和法的EV纯化研究用试剂 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver. 2。

B）PS亲和法、超速离心分离法分别纯化MSC来源EV后，使用ELISA对其回收率进行定量的结果。分别使用抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体检

B）测。图表为与培养上清液中的EV标记量的相对值。

B）使用的ELISA为PS Capture™ Exosome ELISA Kit（Streptavidin HRP）（产品编号：298-80601）。

C）定量PCR分析MSC来源EV对抑制TGFβ刺激纤维芽细胞诱导的纤维化相关基因表达上升的结果。

D）定量PCR分析MSC来源EV对抑制LPS刺激PBMC来源单核细胞诱导的炎症相关基因表达上升的结果。

UC：超速离心分离法；PS：PS亲和法

图4.  评估保存在样品管中的EV吸附损失的结果

A）向使用PS亲和法纯化的COLO201细胞来源EV中添加EV-Save™和in vivo用EV-Save™，冷冻保存16小时后，使用PS Capture™ Exosome ELISA Kit

A）（Streptavidin HRP）检测样品管内的EV标记物量的结果。

B）将添加了EV-Save™和in vivo用EV-Save™的COLO201细胞来源EV融冻1或3次，之后使用PS Capture™Exosome ELISA Kit（Streptavidin HRP）检

B）测样品管内的EV标记物量的结果。

◆可应用于EV的生产过程管理和质量管理的ELISA技术

在EV的治疗应用中，重要的不仅是EV的生产技术，还有质量管理技术的确立。其中，能够定性定量地分析EV标记物的技术在评估EV的质和量上也同样举足轻重。敝司开发了能够定性·定量分析EV标记物的ELISA产品，并以试剂盒的形式上市。使用针对EV标记物（CD9、CD63、CD81等）抗体的CD-Capture系列三明治法ELISA试剂盒，或是使用固定了Tim4的平板捕获EV后用针对任意EV标记物的抗体进行检测的PS Capture ELISA，都能够以符合目标的模式进行检测。以上方法在敝司的技术开发中也是十分有用的工具（用于图3 B、图4中的实验），因此也十分推荐将上述试剂盒用于EV生产过程中的监测和纯化EV的质量管理等方面。

◆结语

以MSC来源EV为中心的EV的治疗应用正备受期待，因此EV的制造技术和评估技术的优化和标准化也成为了一大课题。敝司至今将有关EV生成的一系列工序的技术以研究用试剂的形式推出上市，而今后将促进产品适配EV制剂的实际生产与质量管理部分，为实现EV治疗这一全新的疗法做出贡献。

◆参考文献

1） Colombo, M. et al . : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255 （2014）.

2） Phinney, D. G. and Pittenger, M. F. : Stem Cells, 35 （4）, 851 （2017）.

3） Rezaie, J. et al. : Cell Commun. Signal., 20（1）, 145 （2022）.

4） 丸谷祐樹、山根昌之 : 和光純薬時報, 89 （4）, 8 （2021）.

5） Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 （2016）.

6） 山根昌之、石止貴将 : 和光純薬時報, 88 （4）, 10 （2020）.

点击此处查看更多外泌体系列产品技术和应用文章

点击此处查看更多外泌体系列产品

邂逅深秋｜相约第五届全国细胞外囊泡大会

由中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会（CSEV）主办的第五届全国细胞外囊泡大会定于2021年11月5日-7日在广东省广州市珠江宾馆召开。本次线下会议主要包含细胞外囊泡分离及检测新技术、细胞外囊泡标志物发现与临床应用、以及细胞外囊泡与疾病防治专题等多方面内容。会议将邀请国际细胞外囊泡学会（ISEV）以及国内杰出专家授课，同时设有产业转化论坛环节，将有来自全国各地的从事细胞外囊泡研究的学者、研究生以及医护人员等600余人出席会议。

富士胶片和光将携前沿研发成果精彩亮相本次会展。

期待您莅临富士胶片和光展位（展位号：B8），了解PS亲和法相关细胞外囊泡分离、分析新技术！

—————————————-展品预览—————————————-

◆会议安排

·　11月5日　·

·　11月6日上午　·

·　11月6日下午　·

·　11月7日上午　·

————————————————————————————————–

以上具体日程可能会随时变动，以主办方实际通知为准。

更多精彩内容，请点击查看完整的2021CSEV年会日程宣传版。

第六届全国细胞外囊泡大会邀请函

会议地点：广州市广东迎宾馆（广州市越秀区解放北路603号）白云楼二层

会议时间：2022年10月14-16日

展位号：B09（位于金山厅门外）

中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会（CSEV）主办的第六届全国细胞外囊泡大会于2022年10月14-16日在广东省广州市广东迎宾馆召开。本次会议主要包含细胞外囊泡分离及检测新技术、细胞外囊泡标志物发现与临床应用、以及细胞外囊泡与疾病防治专题等多方面内容。会议邀请国际细胞外囊泡学会（ISEV）以及国内杰出专家授课，同时设有产业转化论坛环节，将有来自全国各地的细胞外囊泡研究学者、研究生以及医护人员等600余人出席会议。

富士胶片和光应CSEV邀请携外泌体相关前沿产品参与本次会议，欢迎各位专家老师前往B09号展位交流垂询。

展位图

◆展品预览

第七届全国细胞外囊泡大会邀请函

会议名称：第七届全国细胞外囊泡大会CSEV 2023

主办单位：中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会(CSEV) | Interdisciplinary MEDICINE 期刊 |

                 南方医科大学南方医院 | 南方医科大学珠江医院

会议地点：上海市第一人民医院南院（松江区新松江路 650 号）科教中心

会议时间：2023年10月20日（周五）~22日（周日）

展 位 号 ：A3

技术讲座：2023年10月21日 11:45~12:05，分会场二

                 PS亲和法在高通量分离EVs和开发膀胱癌诊断生物标记物中的应用（分论坛：尿液EV研究与应用论坛）

中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会（CSEV）主办的第七届全国细胞外囊泡大会将于2023年10月20日~22日在上海市第一人民医院南院科教中心举办。

本次会议内容主要包含细胞外囊泡形成分泌机制、细胞外囊泡分离/检测/组学分析及工程化新技术研究与临床应用、细胞外囊泡在癌症/神经系统疾病/心血管疾病/免疫及感染性等重大疾病诊断与治疗中的研究与临床应用、微生物/尿液/中草药/干细胞等各类细胞外囊泡前沿研究与应用等多方面内容。同时设有ISEV走进中国及细胞外囊泡产业转化论坛等环节，将有来自全国各地的从事细胞外囊泡研究的学者、研究生以及医务人员等1000余人出席会议。

富士胶片和光应CSEV邀请，将携外泌体相关前沿产品参与本次会议，并且在尿液EV研究与应用论坛的技术讲座上发表汇报，欢迎各位专家老师莅临A3号展位、前往尿液EV研究与应用分论坛交流垂询。

展位图

注：上图仅为科教中心二层平面图示（包含主会场及展厅），分会场二请往科教中心三楼，具体位置请咨询现场工作人员

◆展品预览