PUREfrex ® 无细胞蛋白合成试剂盒
PUREfrex ® 是一款单独纯化蛋白合成所需的因子后，与氨基酸和NTP等混合重组的蛋白合成试剂盒。通过减少试剂盒中的大肠杆菌来源脂多糖，合成的蛋白无需纯化即可直接用于细胞实验和检测。对于首次想要尝试本产品的用户，本产品还可提供小包装规格 。
从减少塑料使用的环保观点出发，并为了满足需要更多反应液的客户需求，PUREfrex ® 试剂盒系列已停止生产5×250 µL反应用（1.25 mL反应用）规格的产品，并全新推出了“2 mL反应用”规格的产品。
新规格与旧规格产品相比，反应液的性价比更高。
◆ 关于PUREfrex ®
PUREfrex ® 是基于PURE system开发的重组无细胞蛋白合成试剂盒 。PURE system是东京大学的上田卓业教授团队开发的重组无细胞蛋白合成系统，是将转录、翻译和能量回收所需的蛋白和核糖体单独纯化，然后与氨基酸、NTP等混合的合成系统。通过添加编码目标蛋白的DNA或mRNA至反应液中进行反应来合成蛋白。由于使用了组分经纯化的混合反应液，因此具有可自由调整其组成，且几乎不含与翻译等无关的蛋白的优点。
PUREfrex ® 改良了反应液中蛋白、核糖体和tRNA的制备方法，是一款与传统产品相比，纯度更高的合成反应溶液。此外，大肠杆菌来源的污染性脂多糖含量降低至每µL反应液10-1 EU以下，并且 RNase和β-半乳糖苷酶等污染蛋白也有减少。此外， PURE frex ® 的所有蛋白（包括翻译因子等）中均不含纯化和检测用的标签。因此可合成添加了任何标签序列的蛋白，后续可利用该标签进行纯化和检测。
使用PURE系统进行蛋白合成的原理图
◆特点
● 由经纯化组分组成的反应液，非细胞提取液。
● 可以利用多种模板进行反应，还能合成Fab等多聚体。（多种模板混合下的Fab合成示例见下文）
● 可合成活细胞难以合成的强毒性蛋白。（蛋白毒性合成示例见下文）
● 模板DNA可直接添加至PCR反应液使用。
● 反应液量内合成的蛋白量几乎恒定（数 µL～数 10 mL）。
● 操作简便，仅需在单试管中37℃孵育数小时。
● 可合成带标签的蛋白，用于下游纯化和检测。
◆ 使用PUREfrex ® 进行蛋白合成的实验流程
◆ PUREfrex ® 使用方法
实验方案示例
使用PURE frex ® 1.0 时，可使用任意体积的反应液进行蛋白合成。例如，20 μL时反应液的制备方法如下所示。
1. 将SolutionⅠ在室温~37℃下加热1 min左右至完全融解，随后置于冰上。
2. 将Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。
3. 将融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ轻轻涡旋后，离心并收集试管底部的内容物。
4. 根据下述列表制备反应液。（DNA添加量为每kbp 0.5-3 ng/ μL）
Water
8-X µL
Solution Ⅰ
10 µL
Solution Ⅱ
1 µL
Solution Ⅲ
1 µL
模板DNA 注1
X µL
Total
20 µL
5. 在37°C的加热块或水浴中反应 2~4 h，合成蛋白。 注2
6. 合成的蛋白可用于多种用途。 注3
注意事项
注1）模板DNA请根据目标蛋白自行制备。
注2）如果在气相恒温器（如培养恒温器）中进行反应，反应溶液的温度上升需要花费更多的时间，合成量会有所降低。
注3）通过SDS-PAGE确认合成时，请用水稀释反应液后进行电泳。详情请点击 此处 查看。
注4）反复冻融会导致活性降低，因此，实验系统用量较少时，建议少量分装。少量分装后，请将Solution Ⅱ和Solution Ⅲ用液氮或干冰/乙醇快速冷冻，并在-20°C 或 -80°C 下储存。若不快速冷冻，而是直接放入注4 -80℃缓慢冷冻，会导致核糖体（Solution Ⅲ）等因子失去活性。此外，为避免核酸酶污染，建议佩戴手套和口罩。
◆ 模板DNA设计
蛋白合成时，向本试剂盒Solution Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 的混合反应液中添加模板DNA，同时进行转录和翻译反应。注意，制备适合PUREfrex ® 合成的模板DNA是蛋白合成的关键之一。详细的制备方法请参阅 模板DNA网页 。
使用PUREfrex ® 设计适合蛋白合成的模板DNA时的要点
● 对于ORF整体：
基于大肠杆菌密码子的使用频率使用密码子
将导致移码的序列（如 X/XXY/YYYZ）替换为其他的密码子
● 对于N端：
使用富含AT碱基的密码子
开始使用蛋氨酸后，应立即尽可能避免使用脯氨酸和甘氨酸。
● 对于5’UTR区：
含SD序列（核糖体结合序列）
SD 序列上游含15 个或以上的富含AT碱基的序列
PUREfrex ® 2.0mini —适合首次使用的用户
进行蛋白表达时，需要考虑宿主、表达载体、诱导、不溶性等多种因素。首次使用PUREfrex ® 或首次尝试无细胞系统的用户可能会产生是否真的可以合成蛋白，或者即使成功合成，蛋白合成量是否太少的疑问。
对于PUREfrex ® ， 因为任何生物来源蛋白的模板DNA组成均相同，所以无需考虑宿主或载体等因素 。PUREfrex® 2.0mini 附带通用引物和详细说明，因此，适合初次使用的用户尝试合成所需的蛋白。
组成成分
客户自备
PUREfrex ® 2.0 （蛋白合成试剂）
目标蛋白基因
T7PRO-SD primer
（包含5' UTR 序列的引物）
Fw 和 Rev 的引物
(使用PCR产物作为模板DNA 时）
DHRF DNA（阳性对照用模板 DNA）
◆ 蛋白合成反应液和添加剂的选择
请根据用途选择蛋白合成反应液和添加剂。
蛋白合成反应液
● PUREfrex ® 1.0
PURE frex ® 1.0 已公开反应液组成，适用于产品定制等需要组成成分信息的研究。此外，虽然使用 PURE frex ® 2.0 合成蛋白时的速度较快，但可能无法及时形成和折叠二硫键等导致不溶时，此时使用合成速度较慢的PURE frex ® 1.0 效果可能更好。
反应液组成点击 此处 查看
● PUREfrex ® 2.0
PUREfrex ® 2.0 改良了PUREfrex ® 1.0 的反应液组成，提高了蛋白合成效率，从而增加了反应液内的蛋白合成量。适用于需要合成大量蛋白及多种蛋白的研究。反应液组成保密。
● 合成量对比数据
● 添加剂效果对比
● PUREfrex ® 2.1
PUREfrex ® 2.1 适用于需严格控制氧化还原状态的含二硫键结合的蛋白合成。它在保留PUREfrex ® 2.0 反应液组成的基础上，单独添加了还原剂，因此可根据添加的还原剂（和氧化剂）种类和数量来调整合成过程中的氧化还原状态。并且，还可用于探讨适用于细胞中难以表达的含二硫键结合的蛋白合成条件。此外，作为添加剂的DsbC Set（原：DS supplement）和DnaK Mix也能加入反应液中使用。
● AppA合成示例和IgG合成示例
蛋白合成用添加剂
● DnaK Mix
DnaK Mix是经高度纯化的大肠杆菌来源的DnaK、DnaJ、GrpE蛋白以适当的浓度比例预混后的溶液。
● GroE Mix
GroE Mix是经高度纯化的大肠杆菌来源的GroEL、GroES蛋白以适当的浓度比例预混后的溶液。
此类分子伴侣混合物可有助活性蛋白的合成，而仅使用单个分子伴侣往往难以形成高阶结构。
目前还未明确哪种添加剂效果好，实际效果取决于需合成的蛋白。但如果是 首次尝试，推荐使用合成效果更广泛的DnaK Mix。
● DsbC Set （原：DS supplement)
含有作为氧化谷胱甘肽（GSSG）和二硫键异构酶的大肠杆菌 DsbC。
● PDI Set
含有氧化谷胱甘肽（GSSG）、人源二硫键异构酶（PDI）和PDI的氧化酶Ero1α。
可为形成二硫键创造优质环境。 二硫键的形成可能只需要氧化剂GSSG，也可能需要具有二硫键异构化活性的DsbC或PDI。氧化剂GSSG和Ero1α一样也会氧化PDI，但它还可以氧化反应液整体。另一方面，Ero1α 是一种特异性氧化PDI的酶，如果无需氧化整个反应溶液时，建议使用Ero1α（PDI 组）。
● EF-P
大肠杆菌的翻译因子之一，在合成含有连续脯氨酸残基的蛋白时添加，可以增加合成量。
◆产品数据
frex ® 1.0 和2.0 的合成量对比
合成原核生物和真核生物来源蛋白的结果显示，与PURE frex ® 1.0 相比，使用PURE frex ® 2.0 合成时各种蛋白的合成量增加。
添加剂效果
合成需要二硫键（SS键）的大肠杆菌酸性磷酸酶（AppA1）时，在PUREfrex ® 2.0 的基础上，添加了DS supplement。结果显示，在 氧化剂和二硫键异构酶存在的情况下，活性蛋白合成量增加。
对于需要分子伴侣才能形成正确高阶结构的蛋白，使用PUREfrex ®
2.0 合成时，在分子伴侣存在的情况下，可确认活性蛋白合成量增加。
在多模板混合条件下添加 DsbC Set（原 DS supplement）合成 Fab 的示例
在PUREfrex ® 2.0 的基础上添加DS supplement合成的结果显示，成功合成了由轻链（LC）和重链（HC）通过分子间二硫键相连而成de 活性Fab，且该活性Fab可以和抗原结合。另外，通过优化轻链（LC）和重链（HC）的模板DNA的添加比例，结果显示活性Fab的产量增加。（最高产量为0.5 mg/mL）
合成强毒性蛋白
蛋白毒素（Gelonin）的合成示例
a）使用PUREfrex ® 2.0 合成Gelonium multiflorum植物种子来源的蛋白毒素的实验中，结果显示成功合成了具有蛋白翻译抑制活性的毒素。
b） 在HeLa 细胞来源的无细胞表达系统中合成 GFP时， 通过比较添加合成了Gelonin蛋白的PUREfrex ® 反应液（未纯化）时的GFP活性，来确认翻译抑制的活性。(最高产量为0.5 mg/mL）
* Gelonin的分子量为30 kDa，通过灭活真核细胞的核糖体来抑制翻译。
起始密码子后的氨基酸密码子对合成量的影响
曲妥珠单抗重链（VH+CH1）的合成示例（替换起始密码子后的密码子）
使用PURE frex ® 2.0 ，通过用了起始密码子后的第2~6个氨基酸处不同密码子的56种模板 DNA 合成Trastuzumab 的重链（VH+CH1）。结果显示，最高合成量和最低合成量间相差约50倍。合成量最高的模板 DNA 是使用低GC含量密码子的模板 DNA（AT），合成量随着 GC含量的增加而减少。此外，与大肠杆菌中使用频率高的密码子相比，通过使用了频率低但GC含量少的密码子的模板 DNA 进行合成时，合成率更高。
通过 PUREfrex ® 2.1 合成含二硫键结构的蛋白
1. 酸性磷酸酶（AppA）活性测试
*1 ，并比较其合成量和活性，结果显示，虽然从还原凝胶的电泳分析中没有发现合成量的显著差异，但活性根据使用的还原剂类型和浓度各异。
（*1 AppA有5个二硫键，其中一个为不连续的半胱氨酸残基间的二硫键。）
2. IgG 的合成
通过添加 GSSG（氧化型谷胱甘肽）、大肠杆菌的二硫键异构酶 DsbC 和分子伴侣，并使用不同种类的还原剂，合成通过二硫键（SS 键）形成的两条L链（轻链）和两条H链（重链）的四聚体结构IgG。比较其合成量和活性的结果显示，虽然从还原凝胶的电泳分析中没有发现合成量的显著差异，但活性根据使用得还原剂类型和浓度各异。
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