第八回 利用外泌体进行诊断

公益财团法人癌症研究会 植田幸嗣

一直以来，我们都认为细胞间交流和维持细胞周边稳定性是由于被释放到细胞外的体液因子（细胞因子）在发挥作用。而近年研究表明，微小分泌囊泡在其中发挥着重要的作用，尤其是以内吞作用为起点的细胞内囊泡、通过运输途径生成的一种细胞外囊泡——外泌体。关于外泌体的研究并不止步于基础生物学的功能阐明，作为诊断、治疗和药物控释的工具，外泌体面向临床应用的研究与开发也非常活跃。本文将阐述最近利用外泌体内含分子开发疾病诊断新技术的全球趋势。

外泌体是直径约为数十至数百纳米、具有脂质双层膜结构、在特定蛋白群（四跨素家族，Rab家族，Tsg101，Alix等）与miRNA细胞内构成比例中比例较高的囊泡。除此以外，病原细胞来源的外泌体在其细胞中包含特异性表达的分子群，并且由于这些分子群可从血液或尿等任何体液中检测出来，因此外泌体有望作为无需活检而是通过无创体液诊断读取疾病分子病理的“液体活检”工具。

目前利用外泌体的诊断法开发中进展最快的疾病领域是癌症。实际上，从血清中外泌体检测肺癌特异性EML4-ALK融合基因转录物的检查项目（ExoDx™Lung(ALK), Exosome Diagnostics,Inc.），以及从尿液外泌体中检测前列腺癌特异性的两种mRNA（SPDEF, ERG）与一种ncRNA（PCA3）的检查项目（ExoDx^TMProstate(IntelliScore）,Exosome Diagnostics, Inc.）已在美国上市。而且该公司也在2019年4月提出，可以利用血液中外泌体所含的DNA、RNA（ExoNA）分别以灵敏度90%、83%、73%，特异度100%、100%、96%检测出肺癌细胞中发现的代表性EGFR基因突变L858R、T790M、exon 19 indels（n=110）^1）。作为从外泌体中检测癌症特异性基因变异的其他案例，在进行了淋巴结清扫术的恶性黑色素瘤患者中获得的淋巴渗出液（exudative seroma, ES）中分离出外泌体后进行分析，成功检测出BRAF^V600E 突变，并且其检测频率可能与复发风险相关^2）。

在笔者研究团队进行的肾癌特异性外泌体蛋白生物标记物开发的案例中，从培养手术切除的肾癌部位以及相邻的正常部位的无血清培养基中提取活体人组织来源外泌体，使用最先进的质谱技术进行详细分析。本次分析所使用的20个病例来源肾组织中定量检测出3,781种外泌体蛋白，其中106种蛋白与在肾正常部位来源外泌体中相比在肾癌部位来源外泌体中的表达明显增强（p < 0.05、Fold-change > 2.0），尤其是azurocidin （AZU1）蛋白表达增强最为明显（p = 2.85 × 10^-3、Foldchange = 31.6）。由于外泌体上的AZU1 （Exo-AZU1）也可以从肾癌患者血清中特异性检测出肾癌，并且使用与普通双抗体夹心法ELISA相同的检测系统亦可进行高通量测量，因此目前体外诊断用试剂盒的开发由民间企业主导进行^3） 。

另外，研究人员还在积极尝试运用超灵敏质谱分析的外泌体代谢组学分析，Falcón-Pérez等人成功从前列腺癌患者以及前列腺肥大症患者的尿液外泌体中定量检测出248种代谢物。特别是类固醇激素3β-Hydroxyandros-5-en-17-one3-sulphate （Dehydroepiandrosteronesulphate）在前列腺癌患者尿液外泌体中明显更高，并且呈现出与雄性激素水平密切相关等特征，因此该团队提出了将该激素作为利用非侵入性尿液外泌体的前列腺癌特异性存在诊断标记、治疗选择标记的可能方案^4） 。

除此以外，伴随以新一代测序仪和质谱仪为首的组学分析技术的飞跃发展，以癌细胞来源外泌体中所含的生物分子（mRNA、miRNA、ncRNA、蛋白、表面糖链、脂质、代谢物、微量元素等）的详细定量分析为基础的外泌体生物标记物开发案例层出不穷^5） 。

外泌体的液体活检诊断技术开发中最受期待的疾病领域之一，便是以阿尔茨海默病和帕金森氏病为代表的神经退行性疾病。这些疾病难以通过活检提取病变组织进行诊断，因此不得不通过图像诊断或血液、脑脊液生物标记物的信息和识别、行为测试的结果综合判断病情与发展程度，无法确立高精确度且统一的诊断法。于是，神经元和神经胶质细胞等中枢神经细胞分泌的外泌体开始受到关注。因为这些样品可从用于诊断的脑脊液中获取，并且一部分还可以从透过血脑屏障的外周血中检测。重要的是，从脑脊液和血液外泌体中可以检测出与神经退行性疾病发病相关的蛋白群，如淀粉样蛋白β、α突触核蛋白、Tau等^6）。虽然从脑脊液中检测淀粉样蛋白β和Tau、磷酸化Tau的检查手段已投入实际应用，但原则上这些蛋白可能是从伴随疾病发展而死亡的细胞中泄漏而出的，假如我们可以检测到存活状态的细胞分泌的外泌体内含有这些标记物分子群的话，则有望捕捉到更为早期的病理变化（轻度认知障碍（MCI）等）。另外，由于血液中所含脑神经细胞来源的外泌体极少，所以以实现开发更高深度且特异性更高的生物标记物为目的，能够特异性浓缩纯化相同外泌体的技术也在积极开发中。Goetzl等人通过靶向L1CAM分子的免疫捕获法，在血液中浓缩神经细胞来源外泌体，发现了相同外泌体中的cathepsin D、LAMP-1、泛素化蛋白水平在阿尔茨海默病患者中明显增强，HSP70蛋白浓度反而降低^7）。

另一方面，当今世界死因排行第一的心血管疾病领域中，外泌体参与病理的机制和利用其的诊断方法备受关注。例如，据报告因心肌梗塞受损的心肌细胞会释放出含有特定的miRNA（miR1, 208, 499）的外泌体，然后被骨髓单核细胞摄取后抑制CXCR4的表达，从而增加了循环祖细胞，诱导全身性心肌修复^8）。以此为特征的包含心血管系统细胞来源miRNA（myo-miRs）的外泌体可能可以成为心肌损伤敏锐的生物标记物，让我们可以在病危症状出现之前识别出病变。

疾病类别	疾病名称	检测样品	外泌体生物标记物	论文
神经退行性疾病	帕金森病	血浆	DJ-1, α-Synuclein	Front. Aging Neurosci.,   10, 438（2018）.
神经退行性疾病	阿尔茨海默病	血浆	Aβ42, T-tau,   and P-T181-tau	Alzheimers Dement., 15,   1071（2019）.
神经退行性疾病	阿尔茨海默病	血清	miR-135a, miR-193b,   miR-384	Biomed. Environ. Sci., 31,   87（2018）.
神经退行性疾病	免疫脱髓鞘疾病	脑脊液	hsa_circ_0087862,  hsa_circ_001207（环RNA）	Front. Genet., 10,   860（2019）.
心血管疾病	急性心肌梗塞	血清	miR-192, miR-194,   miR-34a	Circ. Res., 113,   322（2013）.
心血管疾病	冠状动脉硬化	血浆	miR-30e, miR-92a	Mol. Med. Rep., 19,   3298（2019）.
肾脏病	薄基底膜肾病	尿	CD13, VASN, A1AT, Cp	Proteomics, 11,   2459（2011）.
肾脏病	局灶性节段性肾小球硬化	尿	miR-193a	Biomed. Res. Int., 2017,   7298160（2017）.
肾脏病	原发性醛固酮增多症	尿	sodium-chloride   cotransporter（NCC）	Journal of the American   Societyof Nephrology, 28,   56（2017）.
肾脏病	肾间质纤维化	尿	miR-29c	Exp. Mol. Pathol., 105,   223（2018）.
口腔疾病	牙周炎	唾液	PD-L1 mRNA	Front. Genet., 10,   202（2019）.
癌症	食道癌	唾液	Chimeric GOLM1-NAA35  RNA	Clin. Cancer Res., 25,   3035（2019）.
癌症	胰腺癌	血清	LysoPC 22:0,   PC（P-14:0/22:2）  and PE（16:0/18:1）	Metabolomics, 15,  86（2019）.

除了上述案例以外，还有以多领域的疾病为对象，报告了各种体液样品中外泌体生物标记物的候选分子（表1），但众多独立研究中确认了重现性的仅占少数。然而，业界也在积极推进外泌体体外诊断药的开发，包括以前文提及的Exosome Diagnostics公司为首，使用ADAPT BiotargetingSystem^TM开发的乳腺癌液体活检的Caris LifeSciences公司与通过TauSome^TM生物标记物开发的慢性创伤性脑病监测标记的ExosomeSciences公司等。然而，Exosome Diagnostics公司在2018年8月以总价约620亿日元（其中包含约350亿日元的里程碑式协议）被Bio-Techne Corporation（NASDAQ）收购，而在2019年6月ExoDx^TMProstate检查受FDA突破性设备指定，进一步推动业务的发展。本文仅介绍了外泌体在诊断应用方面的一小部分，笔者期待今后会有更多的利用外泌体的新型治疗方法或药物控释系统等外泌体制剂应用于临床。而推动其发展，也可以说是进一步提高了累积能科学保证其安全性和质量性的严谨的外泌体相关的基础生物学数据的重要性。

◆参考文献

1）Castellanos-Rizaldos, E. et al. : Oncotarget,10, 2911 （2019）.  

2）Garcia-Silva, S. et al. : J. Exp. Med., 216, 1061（2019）.  

3）Jingushi, K. et al. : Int. J. Cancer , 142, 607（2018）.  

4）Clos-Garcia, M. et al. : J. Extracell Vesicles, 7,1470442 （2018）.  

5）Jalalian, S. H. et al. : Anal. Biochem., 571, 1（2019）.  

6）Gamez-Valero, A.et al. :Neurobiol. Aging,74, 15 （2019）.  

7）Goetzl, E. J. et al. : Neurology, 85, 40 （2015）.   

8）Cheng, M. et al . : Nat. commun ., 10, 959（2019）.   

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利用重组鲎试剂进行内毒素检测

富士胶片株式会社 生命科学＆工程研究所

福地 大树

◆前言

内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖（Lipopolysaccharide），进入血液后，只需极少量即可引发出发热症状，大量存在则表现出强毒性，可导致内毒素休克甚至死亡^1）。由于革兰氏阴性菌广泛分布于环境中，存在混入生产过程的风险，而混入的内毒素具有耐热性，不易灭活，因此要求注射剂和医疗器械接受严密的内毒素污染管理。近年备受关注的再生医疗、疫苗、抗体和核酸医药相关的产品，内毒素管理对这类产品而言非常重要。

目前检测主流是使用一种利用了马蹄蟹血细胞提取物成分凝血系统的试剂——鲎试剂，来检测内毒素，但为了保护鲎科、稳定供应鲎试剂、减少产品批间差异、提高检测稳定性，各鲎试剂厂家开始促进使用人工原料生产的重组蛋白来研发内毒素检测试剂。

 

◆内毒素检查法的检测原理

       内毒素检查法是使用从马蹄蟹血细胞成分制备得到的裂解试剂进行内毒素检测或定量的方法。马蹄蟹的血细胞提取物成分具有使内毒素凝固的反应体系，这种凝固反应以多个丝氨酸蛋白酶前体依次活化的级联反应为基础（图1）。

       内毒素激活马蹄蟹血细胞提取物中含有的C因子，随后活化C因子激活B因子。活化B因子再激活凝血酶原，激活的凝血酶将凝血蛋白原底物水解，并将其转化为凝固蛋白，生成不溶性凝胶。

       另外，在马蹄蟹血细胞提取物中，级联反应还会以G因子为起点，与β-葡聚糖发生反应，由β-葡聚糖引起凝血反应（图1）。若想要特异性检测内毒素，需要通过去除G因子或抑制以G因子为起点的级联反应来检测。

图1. 由内毒素、β-葡聚糖引起的凝血级联反应

◆内毒素的检测方法

内毒素检测大致可分为以下3种：凝胶法（以裂解物试剂的凝胶形成作为指标）、浊度法（检测伴随凝胶化变化的吸光度或透射率来测定浊度变化）、显色法（以合成底物水解产生的显色作为指标）。显色法比凝胶法、浊度法的灵敏度要高。利用重组蛋白的内毒素检测试剂中，除了使用显色合成底物的显色法之外，还有荧光合成底物的检测方法。

 

◆利用重组蛋白的内毒素检测试剂

       目前各公司销售的重组蛋白内毒素检测试剂可分为两种，使用C因子重组蛋白的单因子鲎试剂和使用C因子、B因子、凝血酶原重组蛋白的三因子鲎试剂（图2）。

       单因子试剂由于级联反应没有放大，产生的蛋白酶活性小，需要使用荧光底物进行荧光检测。三因子体系试剂与单因子体系试剂相比，酶活性较大，可产生显色反应，因此可以用普通的酶标仪来检测。

       另外，近年有报告称，B因子对内毒素的特异性具有重要作用^2，3），相比只含有C因子的单因子鲎试剂，含C因子、B因子和凝血酶原三因子鲎试剂更接近于天然鲎试剂。富士胶片和光一直致力于研发三因子重组鲎试剂，目前最新推出的使用重组蛋白的重组鲎试剂（PYROSTAR™ Neo），有着良好的检测性能。

图2. 利用重组蛋白的内毒素检测试剂种类

◆PYROSTAR™ Neo

本次富士胶片和光发售的重组鲎试剂PYROSTAR™ Neo，具有以下的特点：对空白值进行了控制，空白值更低，因此可检测到更低的内毒素浓度（表1）。另外，使用显色法进行检测是裂解试剂的常规分析方法之一，重组鲎试剂PYROSTAR™ Neo检测和分析时可使用能够进行动力学测定的恒温酶标仪和软件进行读数。PYROSTAR™ Neo可以定量0.001 EU/mL~50 EU/mL范围内的内毒素浓度，并能够获得线性良好的标准曲线（相关系数在0.980以上）。

 

表1. PYROSTAR™ Neo与其他公司产品的比较

	PYROSTAR™ Neo	其他公司产品1	其他公司产品2	其他公司产品3
因子	三因子系统		单因子系统
定量范围 （EU/mL）	0.001~50     （显色时间分析法）	0.005~50 （显色时间分析法） 0.002~0.1 （反应速度法）	0.005~5	0.005~50
检测方法	显色法	显色法	荧光法	荧光法

◆结语

目前内毒素检测试剂多为以鲎血为原料的裂解液鲎试剂，而使用人工重组蛋白的内毒素检测试剂，其历史较短，并未得到广泛应用。

在此背景下，为推进重组鲎试剂的应用，2021年欧洲药典收录了采用荧光法的重组C因子鲎试剂并作为常规检测方法。在日本药典第十八次修订的最新版本中，收录了《内毒素检测方法与使用重组鲎试剂的替代法》（「エンドトキシン試験法と測定試薬に遺伝子組換えタンパク質を用いる代替法」）作为补充参考信息，但重组鲎试剂并不属于内毒素检查法中规定的“马蹄蟹血细胞提取物成分制备的裂解试剂”。同样，美国药典也将重组鲎试剂视为替代法。据报告，使用替代法时，相比使用裂解试剂的内毒素检查法，需要对这两种方法进行对比研究，确保重组鲎试剂有相同或更高水平的真实性、准确度、灵敏度、特异性等 ^4）。

今后富士胶片和光将会继续推进重组鲎试剂应用于内毒素检测中的研究，但需满足真实性、准确度、灵敏度、特异性这几点才能满足考虑替代法的制药公司等用户的需求。我们将继续推进鲎试剂的研究，努力实现用户需求、环境和马蹄蟹保护之间的平衡。

◆参考文献

1）棚元憲一：エンドトキシンと医薬品の品質管理，国立医薬品食品衛生研究所報告，126，19（2008）.

2）Kobayashi, Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya, M. : Int. J. Dev. Res., 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，48，252（2017）.

◆相关产品

内毒素检测重组鲎试剂 PYROSTAR™ Neo