小鼠生殖工程学技术——12冻存、复苏小鼠未受精卵
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◆材料
１. 过量排卵处理的雌性小鼠
２. 培养皿（corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）
３. 流动石蜡（NacalaiTesque Cat.No.26137-85）
４. 自动移液器（GILSON PIPETMAN P-20）
５. 黄色枪头（BM器材 Cat.No.110-96R）
６. mTHF
７. 1%透明质酸酶溶液
８. 胎牛血清（Gibco Fetal Bovine Serum(FBS) Cat.No.26140-087）
９. 一次性过滤装置（微孔孔径：0.22μm Cat.No.SLGVJ13SL）
10. 2.5mL注射器（泰尔茂Cat. No.SS-02SZ）
11. 微管
12. CO2培养箱（37°C 5% CO2 95% air）
13. 可使用便捷玻璃化方法冻存和复苏胚胎时使用的相同器材和培养基。
（用mHTF清洗复苏后的未受精卵）
◆步骤
培养皿的准备
1. 制作采集卵子用的培养皿（1个200μL的mHTF滴液），静置在培养箱内30分钟。
２. 制作清洗卵子用的培养皿（4个80μL的mHTF滴液），静置在培养箱内30分钟。
３、 适量制作含2０％FBS的mHTF溶液并进行过滤灭菌，然后制作处理FBS用的培养皿（2个100μL含20%FBS的mHTF滴液），静置在培养箱里30分钟以上 。
去除卵丘细胞
1. 从过量排卵的雌性小鼠里取出的卵子块放进采集卵子用培养皿上200μL 的mHTF滴液里。（一个滴液可容纳
5只小鼠的卵子块）。
要点：从小鼠安乐死至采集输卵管并将采集的卵子块导入mHTF滴液的这一过程操作要在极短时间内完成（30秒内）
要点：1个人做实验时，不要一次性让多只小鼠安乐死，应该一只只地进行，并迅速采集卵子。
２. 用自动移液器（P-20）将20μL 的1%透明质酸酶溶液添加进含有卵子块的200μL滴液里，静置在37°C的培养箱里1分钟。
３. 把去除卵丘细胞的卵子按顺序转移至80μL的mHTF滴液里（清洗卵子用的培养皿）。
要点：在37°C下清洗一分钟后，即使不能完全去除卵丘细胞，清洗的过程中卵丘细胞也会渐渐剥离。
４. 在卵子清洗用培养皿的mHTF滴液里清洗去除卵丘细胞的卵子3次。
胎牛血清的处理（FBS）
１. 将未受精卵移至含20%FBS的mHTF的滴液（处理FBS用的培养皿）里，清洗2次，并培养10分钟。
＊FBS有利于冻存和复苏过程中引起的未受精卵的透明带硬化。
未受精卵的冻存
１. 去除卵丘细胞的未受精卵在含FBS的培养基里培养后，冻存和复苏操作与胚胎的步骤相同。
（用mHTF清洗复苏后的冻存精子）
用冻存、复苏后的未受精卵子进行体外受精
1. 新鲜精子、冷藏运输附睾尾部精子及用冻存精子进行体外受精的方法各有不同，请分别依照具体方法操作。
要点：使用的精子不同，体外受精用的受精培养基（CARD MEDIUM）的制备方法也不同。请仔细阅读受精用培养基的操作说明书准备受精用培养皿。
参考文献
【1】Nakagata N, Takeo T, Fukumoto K, Kondo T, Haruguchi Y, Takeshita Y, Nakamuta Y, Matsunaga H, Tsuchiyama S, Ishizuka Y, Araki K. 2013. Applications of cryopreserved unfertilized mouse oocytes for invitro fertilization.Cryobiology.Oct；67（2）：188-92.
