优化原位杂交（ISH）的10个小技巧
10 Tips for Optimizing In Situ Hybridization (ISH)
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Enzo Life Sciences在研究试剂盒，生物化学品和生物制品的制造和供应方面拥有40多年的经验。作为为科学家提供支援的科学家，我们很乐意提供简单但有用的技巧，以改善您日常任务以及研究的整体质量。从这一点出发，以下我们为您提供了在原位杂交中获得高质量数据的综合技巧。原位杂交是一种广泛使用的生物技术，它能为准确定位分裂中期滴片、细胞和组织中内源性的、细菌或病毒的核酸（如DNA，mRNA和microRNA）。
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1．合适的探针
由于杂交可以发生在互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之间，故DNA或RNA探针（又称为核糖探针）都可以用于定位给定样品中的DNA或RNA。然而，RNA-RNA杂交体比RNA-DNA杂交体更稳定，而RNA-DNA杂和体又比DNA-DNA杂合体更稳定。双链DNA探针易于在实验室中进行制备、标记和使用；而单链RNA探针的大小均一，可实现标记的高度插入，并形成高度稳定的RNA-RNA杂交体。而且，单链寡核苷酸探针（Oligonucleotides）如今可以通过化学方法简单地合成并且加上高比放射性。目前，也可以使用肽骨架或锁核酸（LNA）作为替代品，以提高杂交效率和稳定性。
2．合适的标签
用于组织微阵列的放射性标记探针应使用35S-NTP，以避免信号溢出。如果实验目的是使与周围细胞或组织结合的探针可视化（最常见的情况），那么您可以选择能够使探针能被直接检测的一系列荧光染料。又或者，您可以使用如生物素、地高辛或者色原体等间接标记，这类标记不易随着时间变化而发生信号猝灭，与免疫组织化学（IHC）类似。
3．正确的标记技术
缺口平移法或随机引物标记法是产生长的双链DNA探针的方法（推荐使用ENZ-GEN111-0050），而使用含RNA聚合酶启动子的载体则可用于体外转录以制备RNA探针。寡核苷酸可以在其合成期间直接标记，或者可以使用末端脱氧核苷酸转移酶或T4多聚核苷酸激酶将标记的核苷酸添加至其末端。
4．合适的检测方法
由于荧光标记可以在FISH探针合成期间引入并通过荧光显微镜检测，因此可以进行直接检测。这样，可以容易地进行多重检测，因为可以在任何时间观察两种或更多种不同荧光团标记的不同探针（推荐ENZO SEEBRIGHTTM系列）。生物素标记可以用来自蛋清的亲和素或来自细菌S. avidinii的链霉亲和素检测，而地高辛可以与地高辛抗体配对。两种间接标记方法最终可以用碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）来处理，与特定底物反应产生CISH的显色沉淀，从而达到可视化的目的。
5．优化蛋白酶K的消化
蛋白酶K的消化是ISH成功的关键步骤，因为消化不足将导致杂交信号减弱。另一方面，如果样品过度消化，组织的形态将会很差或完全被破坏，导致无法定位杂交信号。因此，蛋白酶K的最佳浓度会根据组织类型、固定长度和组织大小而变化。 通常，在室温下使用1-5 μg/ mL蛋白酶K处理 10min是开展ISH的一个不错的起始点。蛋白酶K消化最佳条件的确定应以系列不同浓度的蛋白酶K进行滴定，然后再与所选择的探针杂交。产生最高杂交信号且蛋白质组织或细胞形态被破坏最少时的蛋白酶K浓度即为您应该选择的浓度。
6．强化杂交条件
强化杂交条件的目的是仅在探针和其靶标之间获得杂交，从而实现可能的最高特异性。杂交特异性（严格度）主要由探针和靶核酸序列之间的同源性程度、探针浓度、温度和杂交时间，以及杂交溶液中存在的单价阳离子的浓度所决定。尤其应该仔细地优化杂交温度，通常在55和62°C之间，以获得高度特异性的结果。甲酰胺允许杂交在显著低于探针-靶-杂交体的实际解链温度的温度下进行，从而有助于保护样品的形态。为了更好地标记目的基因，通常会引入COT序列（ENZ-GEN116-0500）以减少与重复DNA序列的非特异性杂交。
7．优化杂交后处理条件
反应之后，接下来进行的是增加严格度的杂交后洗涤，以出去不完全的配对，使靶序列上仅留下特异性结合的探针。如果您在ISH分析中遇到高背景，您可以用核酸酶消化非特异性结合的探针来进一步降低背景。例如，在进行检测步骤之前，使用S1核酸酶处理DNA探针，使用RNase来处理RNA探针。
8．如果使用DNA探针，修改洗涤步骤
DNA探针有着与RNA探针相同的灵敏度，但DNA探针不能像RNA探针那样与样品中的靶分子结合得那么牢固。 因此，当使用DNA探针时，不应在杂交后使用甲醛洗涤。
9．优化检测
使用生物素标记的探针时，请注意生物素也是在细胞和组织中产生的内源性物质。因此，内源性的生物素可能导致非特异性染色，因为基于（链霉）亲和素的检测系统将与样品中所有可接触的生物素分子结合。在这些情况下，您需要通过在探针杂交之前向样品中添加过量（链霉）亲和素来阻断内源性生物素，或者您应该使用地高辛代替生物素来作为探针标记。地高辛是从洋地黄植物中分离的非放射性免疫标签，因此不太可能被除抗地高辛抗体之外的生物材料检测到。因此，地高辛标记的使探针检测有着高亲和力、高灵敏度以及最重要的特异性。
10．经常更换试剂
为了获得最具可重复性和有效的数据，应每2-3周补充一次三乙醇胺和乙酸酐，每3-4天更换10％中性甲醛溶液（NBF）。
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产品编号
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产品名称
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用途
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包装
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ENZ-GEN111-0050
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Nick translation DNA labeling system 2.0
缺口平移法DNA标记系统2.0
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ISH(in situ hybridization)
FISH
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50 tests
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ENZ-42853
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SEEBRIGHT™ Aqua 431 dUTP
水绿 431 dUTP
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FISH
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25 nmol
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ENZ-42831
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SEEBRIGHT™ Green 496 dUTP
绿色 496 dUTP
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FISH
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25 nmol
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ENZ-42843
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SEEBRIGHT™ Gold 525 dUTP
金色 525 dUTP
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FISH
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25 nmol
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ENZ-42842
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SEEBRIGHT™ Orange 552 dUTP
橙色 552 dUTP
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FISH
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25 nmol
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ENZ-42844
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SEEBRIGHT™ Red 580 dUTP
红色 580 dUTP
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FISH
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25 nmol
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ENZ-42505
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Cyanine 3-UTP (enhanced)
青色素 3-UTP （增强型）
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用于标记
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250 nmol
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ENZ-42506
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Cyanine 5-UTP (enhanced)
青色素 5-UTP （增强型）
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用于标记
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250 nmol
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ENZ-ACC102-0150
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SAVIEW® PLUS HRP reagent
即用型HRP溶液
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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150 tests
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ENZ-ACC111-0150
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SAVIEW® PLUS AP Reagent
SAVIEW® PLUS AP试剂
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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150 tests
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ENZ-NUC113-0025
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Digoxigenin-dUTP, alkali-stable
地高辛-dUTP，碱稳定
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用于标记
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25 nmol
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ENZ-NUC114-0250
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Digoxigenin-UTP, alkali-stable
地高辛-UTP,碱稳定
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用于标记
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250 nmol
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ENZ-GEN114-6000
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DIGX® HPV type 16/18/31/33/51 probe
DIGX™ HPV 16/18/31/33/51型探针
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-GEN114-1000
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1 mL
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ENZ-GEN112-6000
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DIGX® HPV type 6/11 probe
DIGX™ HPV 6/11型探针
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-GEN112-1000
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1 mL
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ENZ-GEN113-6000
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DIGX® HPV type 16/18 probe
DIGX™ HPV 16/18型探针
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-GEN113-1000
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1 mL
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ENZ-ABS304-6000
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DIGX® Mouse anti-digoxigenin linker (Ready-to-Use)
DIGX™ 小鼠抗地高辛配体
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-ABS303-6000
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DIGX® Rabbit anti-digoxigenin linker (Ready-to-Use)
DIGX™ 兔抗地高辛连接体
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-ACC114-0150
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POLYVIEW® PLUS AP (anti-mouse) reagent
POLYVIEW® PLUS AP（抗老鼠）试剂
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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150 tests
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ENZ-ACC104-0150
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POLYVIEW® PLUS HRP (anti-mouse) reagent
POLYVIEW® PLUS AP（抗老鼠）试剂
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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150 tests
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ENZ-ACC103-0150
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POLYVIEW® PLUS HRP (anti-rabbit) reagent
即用型HRP溶液（兔抗）
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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150 tests
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ADI-950-170-0030
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HIGHDEF® yellow IHC chromogen (HRP)
HighDef 黄色 免疫组化 色原体 （HRP）
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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30 mL
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ADI-950-150-0030
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HIGHDEF® blue IHC chromogen (AP)
HighDef 蓝色 免疫组化 色原体（AP）
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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30 mL
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ADI-950-171-0030
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HIGHDEF® black IHC chromogen (HRP)
HighDef 黑色 免疫组化 色原体 （HRP）
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IHC
ISH (in situ hybridization)
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30 mL
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ENZ-32885
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PATHO-GENE® HPV type 6/11 probe
PathoGene 人乳头瘤病毒 6/11型探针
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HPV探针
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1 mL
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ENZ-32885-6000
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6 mL
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ENZ-32886
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PATHO-GENE® HPV type 16/18 probe
PathoGene 人乳头瘤病毒 16/18型 探针
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HPV探针
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1 mL
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ENZ-32886-6000
|
6 mL
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ENZ-32887
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PATHO-GENE® HPV type 31/33/51 probe
PathoGene 人乳头瘤病毒 31/33/51型 探针
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HPV探针
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1 mL
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ENZ-32887-6000
|
6 mL
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ENZ-32882-6000
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PATHO-GENE® HPV type 16/18/31/33/51 probe
PathoGene 人乳头瘤病毒 type 16/18/31/33/51 探针
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HPV探针
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1 mL
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ENZ-32882-1000
|
6 mL
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ENZ-32884
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PATHO-GENE® HPV screening probe
PathoGene 人乳头瘤病毒 筛选探针
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HPV探针
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1 mL
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ENZ-32884-6000
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6 mL
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ENZ-32895
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PATHO-GENE® AP-NBT/BCIP HPV in situ typing assay
(types 6/11, 16/18 and 31/33/51)
PathoGene Alk phos-NBT/BCIP 人乳头瘤病毒类型原位检测（组织）
（ 6/11, 16/18 和 31/33/51型）
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Colorimetric detection
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10 assays
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ENZ-32879
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PATHO-GENE® AP-NBT/BCIP HPV in situ screening assay
PathoGene 人乳头瘤病毒检测
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Colorimetric detection
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20 assays
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ENZ-33905-0050
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In situ hybridization buffer
for HPV probes (Ready-to-Use)
HPV探针原位杂交缓冲液（即用型）
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HPV探针用缓冲液
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50 mL
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ENZ-33809
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In situ hybridization wash reagent
原位杂交洗涤试剂
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原位杂交洗涤试剂
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30 mL
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ENZ-32893-6000
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Mouse anti-biotin linker
(Ready-to-use)
小鼠 抗-生物素 linker （即用型）
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-32892-6000
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Rabbit anti-biotin linker
(Ready-to-use)
兔抗-生物素linker （即用型）
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ISH (in situ hybridization)
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6 mL
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ENZ-31877
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HPV 16 control slide
HPV16对照片子
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positive control for DNA in situ hybridization of HPV-16
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1 slide
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