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特点：
· 酶标仪检测，操作简单
· 稳定性好，保存时间长
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产品概述
Caspase是 与细胞凋亡密切相关的重要的一组蛋白酶。其中 Caspase-3是 细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，因此 Caspase-3经常被作为细胞凋亡的标志物来进行检测。同仁化学研发的 Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-是 一套操作简单的 比色法胞内 Caspase-3活性 检测试剂盒。与其他市面上的检测试剂盒相比，由于具有更高的灵敏度，因此可以在更短的培养时间内快速检测。 通过比较凋亡组细胞和正常组细胞的 pNA吸光度，即可确定 Caspase-3活性 的增加倍率。
凋亡相关检测方法
试剂概要
操作步骤
Lysis Buffer的 配制
向Lysis Buffer瓶 中 加入 10 ml Reconstitution Buffer后 超声波震荡 2 min。 （建议使用注射器添加 Reconstitution Buffer。如不使用注射器，请注意瓶内为真空状态，剥除铝制封口 和 打开橡胶瓶盖时请小心操作。）
Lysis Buffer配制好后需 -20 保存。
配制好的 Lysis Buffer 在 -20 可稳定保存 1 个月 。
经 测试 Lysis Buffer 反复冻融 8次以内 可正常使用 。
Assay Buffer的 配制
向Assay Buffer瓶 中 加入 3 ml Reconstitution Buffer后 超声波震荡 2 min。（建议使用注射器添加 Reconstitution Buffer。如不使用注射器，请注意瓶内为真空状态，剥除铝制封口 和 打开橡胶瓶盖时请小心操作。）
Assay Buffer配制好后需 -20 保存。
配制好的 Assay Buffer 在 -20 可稳定保存 1 个月 。
经测试， Assay Buffer 反复冻融 8次以内 可正常使用 。
实验例
1. 将 Jurkat细胞（ 3.38×106 Cells/ ml）接种到两个 100 mm培养皿中 （两个培养皿中 分别 含
有 0 μmol/ l和 5 μmol/ l Staurosporine的 RPMI培养基 并在 5 CO2培养箱中 37 培
养 5小时。
2. 将细胞收集到两个不同的锥形管中并离心（ 300×g 3 min 。
3. 去除 上清液后 ，用 1 ml PBS重悬细胞 。
4. 离心（ 300×g 3 min）后 去除 上清液。
5. 将 Lysis Buffer 200 μl）加入 至 每个管中。
6. 将两个样品在冰上孵育 15 min。
7. 将两个样品离心（ 10,000×g 1 min）。
8. 将每个样品的上清液转移到新的微管中 。
9. 通过 Bradford法定量每个上清液中的蛋白质浓度。
10. 使用 Lysis Buffer将每个样品的蛋白质浓度调节至 1.0mg / ml。
11. 将 Substrate 10 μl Assay Buffer 40 μl）和样品 50 μl）加入 至 96孔板 中。
12. 37 培养 2 h。
13. 用酶标仪测定 405nm处的吸光度 。
常见问题Q&A
| Q1:实验结果吸光度低怎么办？ |
| 本试剂盒，完全显色时，405 nm检测OD值约为0.5左右。如诱导凋亡后样品的吸光度低于0.1，请确认是否为以下原因。
<原因1> 孵育时间不足。 请延长孵育时间后测定，可过夜培养。 <原因2> 蛋白质量不足。 由于缓冲液中含有DTT，请使用Bradford的方法检测蛋白质含量，并通过增加细胞数量的方法，准备蛋白质浓度为1-3 mg/ml的细胞裂解液，。 <原因3> Caspase-3活化不足。 Caspase-3激活可能不足。 请考虑优化诱导细胞凋亡的条件（药物浓度和治疗时间）。 （阳性对照，可参考使用说明书中的Staurosporine进行诱导。） |
| Q2:本试剂盒可以检测几个样品？ |
| 该试剂盒可检测50 tests。
当复孔以n = 3进行测量时，可以测量15个样品，不包括空白。 |
| Q3:误差很大的原因是什么？ |
| 如测量的孔中有气泡，则会增加测量误差。在测量前请确保已去除气泡。 |
| Q4：如何作成标准曲线？ |
| 该试剂盒中不包括标准品（p-Nitroaniline）。 需要您自行准备，并可按照以下步骤作成校准曲线。
（1）将p-Nitroaniline溶于DMSO中，制备浓度为20 mmol / l的DMSO储存溶液。 （2）用396 µl Lysis Buffer 稀释4 µl p-Nitroaniline DMSO储备液，以制备200 µmol / l的标准品溶液。 并将该标准品溶液依次稀释2倍，制备出浓度分别为200、100、50、25、0 µmol / l的标准品溶液。 （3）向每孔中加入10 µl Substrate，40 µl Assay Buffer和50 µl标准溶液。 （4）37°C下孵育2小时。 （5）用酶标仪测量405 nm处的吸光度。 （6）通过试剂中Caspase-3的显色作成p-Nitroaniline含量的标准曲线。 |
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参考文献
1) S. Zhang, J. Zhou, Q. Fan, X. Lv, T. Wang, F. Wang, Y. Chen, S. Hong, X. Liu, B. Xu, L. Hu, C. Zhang, Y. Zhang, “Discovery of hydroxytyrosol as thioredoxin reductase 1 inhibitor to induce apoptosis and G1/S cell cycle arrest in human colorectal cancer cells via ROS generation”,Exp. Ther. Med., 2021, doi:10.3892/etm.2021.10261.
2) B. Wang, Q. Sun, W. Ye, L. Li and P. Jin, “Long non‑coding RNA CDKN2B‑AS1 enhances LPS‑induced apoptotic and inflammatory damages in human lung epithelial cells via regulating the miR‑140‑5p/TGFBR2/Smad3 signal network”,BMC Pulm. Med., 2021, doi:10.1186/s12890-021-01561-z.
3) Z. Lin, S. Yang, Y. Zhou, Z. Hou, L. Li, M. Meng, C. Ge, B. Zeng, J. Lai, H. Gao, Y. Zhao, Y. Xie, S. He, W. Tang, R. Li, J. Tan, W. Wang., “OLFM4 depletion sensitizes gallbladder cancer cells to cisplatin through the ARL6IP1/caspase-3 axis”,Translational Oncology, 2022, doi:10.1016/j.tranon.2021.101331.
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