小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

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◆材料

1、12周以上的雄性小鼠
2、noesu剪刀（森田制造所  电话03-3811-9730 特别订制品）

3、FERTIUP^® 精子冻存液（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、mHTF
5、培养皿（Corning 35mm X 10mm　Cat.No.430588）
6、黄色枪头（BM医疗器 Cat.No.110-96R）
7、填充精子用的吸管(My Science Cryo Bio System 0.25mL cotton-plugged Sperm StrawsReferences.010261 or My ScienceFrance Cassou type Straws (AAA201)　0.25mL Cat.No.005565）
8、配套吸管用的注射器
9、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-10 P-100）
10、加热板（37℃）
11、封口包装机（富士MPULSE 专业包装机器Cat.No.P-200）
12、冻结精子用的吸管
13、Triangle Cassette
14、液氮储存器和干式液态氮筒
15、剪刀

◆步骤

制作冻存精子悬浮装置

1、3厘米厚的泡沫切成圆柱状，塞进50mL的注射器外筒内（泰尔茂Cat. No.SS-50ESz）。

2、用火加热50mL注射器前端，来封堵前端口。

3、用铁丝把注射器固定在50cm的玻璃棒上。

※该装置也可从Cosmo Bio直接购买

准备吸管及制作配套吸管的注射器

1、 在填充精子用的吸管中部贴上标签，剪下棉塞处。
2、 把1mL注射器（泰尔茂Cat. No.SS-01T）、三方活塞（泰尔茂 Cat.No.TS-TR1K）、橡胶管・塑料管（DRUMMOND　Cat.No.2-040-000）以及硅帽组装成如下图
3、 精子填充用的吸管的棉塞一侧插进注射器的硅帽里使用。

制作精子悬浊液

1、在培养皿上制作冻存滴液（FERTIUP^®精子冻液：60μL），用流动石蜡覆盖滴液；

2、往被覆盖的滴液里再注射进冻存液（FERTIUP^®精子冻液：60μL）,得到一个更大的滴液。

※制作后的培养放置在37℃的加热板上至使用时才拿出。

3、让成年雄性小鼠安乐死，把收集的左右附睾尾放置过滤纸上，在实体显微镜下小心地取出血液和脂肪。

4、在培养皿上少量的FERTIUP^®精子冻存液的滴液里小心地清洗附睾尾。

5、FERTIUP®精子冻存液的滴液里放进2个附睾尾，用noesu剪刀在附睾尾处剪开5~6切痕。

※只有一个附睾尾时，只需60μL FERTIUP^® 精子冻存液的滴液。

6、培养皿在37℃加热板上静置3分钟，为了得到均匀的精子悬浊液，需每分钟搅拌一次。

精子悬浊液填充吸管

1、 把填充精子悬浊液的吸管插进吸管配套用的注射器内，往吸管注入约100μL的mHTF。
※一根吸管只能注入10μL的精子悬浊液，如果把吸管就这样浸泡在液氮中，吸管就会浮起来，所以mHTF充当砝码，让吸管沉浸在液氮底部。

2、注入mTHF后，吸管前端需留有15mm的空隙。
3、用黄色枪头吸取培养皿上10μL的精子悬浊液，然后注射进吸管里。

4、 接着再留15mm空隙，用封口机封住吸管端口。

※拉开注射器内筒，观察精子悬浊液和mHTF的状态来确认是否已完全密封。如果精子悬浊液和mHTF移动了，就需再次封口。
5、 从注射器内，移走吸管，用封口机把吸管的另一侧封住。
6、 重复1~5个步骤，制作10~11根填充了精子悬浊液的吸管。

冻存（使用液氮储存）

1、 吸管内精子悬浊液一侧朝下放进浮物里。
2、 浮物浮在液氮面上，大概静置10分钟后，让浮物浸泡在液氮里。

3、 捞起装满了液氮的浮物，把吸管移至预先在液氮内冷却的Triangle cassette，存放在液氮里

冻存（使用干式液态氮筒）

1、 吸管内精子悬浊液一侧朝下，放进Triangle cassette内。
2、 从干式液态氮筒里取出一个容器（金属制造的筒），然后把Triangle cassette翻入容器里，盖上干式液态氮筒的盖子。

※在使用干式液态氮筒的前一天，筒内装满液氮，让筒内的吸附剂充分吸收液氮，吸收不了的多余的液氮，使用前之前倒掉。

3、静置10分钟

※用干式液态氮筒冻存精子时，可以直接运输放进干式液态氮筒里的精子。