皮肤致敏试验替代法ADRA应用实例：
使用Wakopak® Core C18 ADRA色谱柱对"ADRA"中常见化合物进行分析
富士胶片和光纯药 机能性材料研究所 须藤勇纪
◆前言
现今，从保护动物与动物实验学相关的3R原则（Reduction：减少、Refinement：减轻痛苦、Replacement：替代）出发，关于动物实验的法规不断推进。尤其是欧盟，其从1993年起开始阶段性禁止化妆品的动物实验，2003年发布2013年以后在欧盟区域内禁止贩卖含有经动物实验检测的原料的化妆品的指令1），并于2009年正式化2）。
在此背景下，全球掀起了开发动物实验替代法的热潮。日本也在2005年设立日本替代方法验证中心（JaCVAM），多种日本研发的动物实验替代法被收录到了经济合作与发展组织（OECD）的测试指南中3）。
本次上市的Wakopak® Core C18 ADRA专用色谱柱（产品编号：233-63991），由富士胶片集团开发，符合2019年6月18日收录于OECD测试指南中的皮肤致敏试验替代法，氨基酸衍生物法反应法（Amino acid Derivative Reactivity Assay， ADRA）4）的试验要求。在ADRA中氨基酸衍生物N（-2（-1-Naphthyl）acetyl）-L-cysteine（NAC）和α-N（-2（-1-Naphthyl）acetyl-L-lysine（NAL）（图1）分别与待测化合物反应，通过检测其减少率，来判断待测化合物的致敏性。本文将会介绍ADRA技术学习中常见的10个化合物的分析案例。
ADRA相关细则以及其与现有方法直接多肽反应试验（Direct Peptide Reactivity Assay，DPRA）的区别，请参考参考文献5-9）。
图1. NAC和NAL的结构式
◆实验方法
本文将使用ADRA试剂盒（产品编号：296-80901）及其研究方法进行实验。但是，本次实验与原本的ADAR不同，不使用96孔板，而是使用PP制微管进行反应。表1为液相色谱条件。请注意， 13.5分钟后的平衡时间根据仪器的配制及混合器的容量不同会有所不同。
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分析仪器 |
Agilent UHPLC 1290 infinity Ⅱ（Agilent 公司） |
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色谱柱 |
Wakopak® Core C18 ADRA 3.0 × 150mm（D） |
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流动相A |
0.1%三氟乙酸-水溶液 |
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流动相B |
0.1%三氟乙酸-乙腈溶液 |
|
NAC的梯度条件 |
0 min.（A：B=70：30）→ 9.5 min.（45：55）→ 10.0 min（0：100）→ 13.0 min.（0：100）→ 13.5 min.（70：30）→ 25.0 min.（70：30） |
|
NAL的梯度条件 |
0 min.（A：B=80：20）→ 9.5 min.（55：45）→ 10.0 min（0：100）→ 13.0 min.（0：100）→ 13.5 min.（80：20）→ 25.0 min.（80：20） |
|
流速 |
0.3 mL/min |
|
混合器容量 |
35 μL |
|
柱温 |
40°C |
|
检测波长 |
UV 281 nm |
|
进样量 |
10 µL |
表1.液相色谱条件
◆分析结果
表2为常见化合物的评估结果，图2为色谱图示例。本次，通过使用Wakopak® Core C18 ADRA色谱柱，获得了在ADRA测试指南中常见化合物的反应减少率，从而对其致敏性进行评估。
图2. 常见化合物的色谱图
绿色：待测化合物，红色：NAC或NAL，蓝色：待测化合物+ NAC或NAL
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编号 |
待测化合物 |
CAS RN® |
性状 |
分子量 |
溶解溶剂 |
ADRA致敏性评估结果 |
已知减少率（%） |
减少率结果（%） |
||
|
NAC |
NAL |
NAC |
NAL |
|||||||
|
1 |
对苯醌 |
106-51-4 |
固体 |
108.09 |
水 |
阳性 |
90-100 |
40-70 |
100 |
61 |
|
2 |
对-钌砜氯酰胺三水合物（氯胺T） |
7080-50-4 |
固体 |
281.69 |
水 |
阳性 |
90-100 |
90-100 |
100 |
97 |
|
3 |
肉桂醛 |
14371-10-9 |
液体 |
132.16 |
乙腈 |
阳性 |
40-100 |
≦ 20 |
43 |
1 |
|
4 |
棕榈酰氯 |
112-67-4 |
液体 |
274.84 |
乙腈 |
阳性 |
≦ 10 |
50-100 |
2 |
93 |
|
5 |
双咪唑烷基脲 |
39236-46-9 |
固体 |
388.29 |
水 |
阳性 |
10-45 |
≦ 10 |
35 |
1 |
|
6 |
合金欢醛 |
19317-11-4 |
液体 |
220.35 |
乙腈 |
阳性 |
10-40* |
≦ 15 |
15 |
2 |
|
7 |
甘油 |
56-81-5 |
液体 |
92.09 |
水 |
阴性 |
≦ 7 |
≦ 7 |
0 |
0 |
|
8 |
苄醇 |
100-51-6 |
液体 |
108.14 |
乙腈 |
阴性 |
≦ 7 |
≦ 7 |
0 |
0 |
|
9 |
间苯二甲酸二甲酯 |
1459-93-4 |
固体 |
194.19 |
乙腈 |
阴性 |
≦ 7 |
≦ 7 |
0 |
0 |
|
10 |
对羟基苯甲酸丙酯 |
94-13-3 |
固体 |
180.2 |
乙腈 |
阴性 |
≦ 7 |
≦ 7 |
0 |
0 |
表2. 熟悉化合物列表以及评估结果
◆参考文献
1）European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 27 February 2003, amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products, Official J. European Union, L66/26(2003).
2）European Commission : "REGULATION(EC) No 1223/2009 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 30 November 2009 oncosmetic products", Official J. European Union, L 342/59(2009).
3）宮崎博之，吉山友二：日薬理誌，151，48(2018).
4）OECD："In Chemico Skin Sensitisation : Amino acid Derivative Reactivity Assay(ADRA)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442C(2019).
5）山本裕介 他：和光純薬時報，87(1)，12(2019).
6）Fujita, M. et al. :J. Pharmacol. Toxicol.Methods, 70, 94(2014).
7）Yamamoto, Y. et al. :J. Appl. Toxicol., 35, 1348(2015).
8) Fujita, M. et al. :J. Appl. Toxicol., 39, 191(2019).
9）Fujita, M. et al. :Toxicol. in Vitro, 59, 161(2019).
◆相关产品
|
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
|
296-80901 |
ADRA Kit |
1 kit |
|
233-63991 |
Wakopak® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm |
1 EA |
相关产品信息请点击：
ADRA试剂盒
ADRA专用色谱柱