使用DNA Extractor® Kit检测残留DNA
富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所 福地大树
◆前言
包含疫苗在内的大部分生物药都是使用培养细胞或大肠杆菌生产的,有研究者指出,通过这种方式生产的原料药、制剂可能会残留着宿主细胞来源的DNA。不可否认,宿主细胞或病毒来源的致癌基因很可能会通过这些残留DNA转运过来,或引起病毒DNA感染事件。因此,残留DNA的定量检测是生物制药和其工艺验证中不可或缺的一部分。
有报告建议生物药中每剂量残留DNA的含量不超过100 pg[1] ,不仅是欧美地区,其他国家也愈发认为必须将定量检测宿主细胞来源的残留DNA作为质量检测项目之一。而检测这种痕量残留DNA,则需要从样品中以高回收率提取痕量残留DNA。
本文将介绍本公司销售的DNA Extractor® Kit —— 一款可用于此类痕量残留DNA检测的DNA提取试剂盒。
◆关于DNA Extractor® Kit
若要检测、定量生物药中所含的DNA总量,必须先将其所含的DNA从蛋白质等其他活性成分中分离、纯化出来。传统上分离DNA时通常会采用蛋白酶消化样品,然后利用苯酚、氯仿将DNA提取出来的方法。然而,这种方法却有着这些缺点:在获得相对高纯度的DNA的同时,需要使用苯酚、氯仿等有害物质;并且需要花费工夫和时间进行提取操作。而使用二氧化硅等物质作为载体的固相提取方法会因为DNA被吸附到载体上而导致其损耗,因此并不适合用于回收痕量DNA。同样的,使用有机溶剂的方法的痕量DNA回收率也很低,这也是DNA提取试剂的问题之一。
本公司1992年起推出的DNA Extractor® Kit(中国药典版本产品编号:292-81101),通过使用碘化钠法解决了以上问题,只需简易的操作,便可以高回收率提取高纯度的DNA。
◆DNA Extractor® Kit的原理
本试剂盒※ 中包含碘化钠和表面活性剂,碘化钠作为蛋白质增溶剂(离液离子),与表面活性剂一同将样品中以蛋白质为主的成分转变为可溶状态,然后通过加入异丙醇,能够选择性地令核酸(主要是DNA)和糖原产生沉淀(即共沉淀)[2]。如上所述,该试剂盒实现了在不使用固相载体或有机溶剂的情况下,通过简化的提纯步骤获得了沉淀物,以高回收率提取痕量DNA。
※ 本试剂盒组分:碘化钠溶液、N-月桂酰肌氨酸钠溶液、洗净液(A)、洗净液(B)、糖原溶液
◆使用DNA Extractor® Kit提取DNA与定量DNA总量案例
笔者将在下文中重新介绍一次曾刊载于本公司和光纯药时报Vol.60 No.3 p.28(1992)中的案例,该案例报道了关于本试剂盒在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率。在该实验中,分别将通常用作赋形剂或添加剂的物质(精氨酸、尿素等)和蛋白质(BSA(牛血清白蛋白)和人γ球蛋白)以常量或过量溶解于磷酸盐缓冲液中,然后添加pg级的小牛胸腺DNA从而得到模型溶液。接下来,按照DNA Extractor® Kit的实验步骤,对400 µL的每种模型溶液进行DNA提取处理。将所得沉淀物溶解于500 μL的磷酸盐缓冲液中进行阈值法总DNA定量※[3][4],测定其DNA的加标回收率。测定结果如表1所示。
赋形剂及其含量 |
DNA添加量(pg) |
DNA回收率(%) |
|
山梨糖醇 |
200 mg/mL |
50 |
95 |
50 mg/mL |
50 |
94 |
|
麦芽糖 |
400 mg/mL |
50 |
89 |
200 mg/mL |
50 |
102 |
|
50 mg/mL |
50 |
98 |
|
甘露醇 |
200 mg/mL |
50 |
84 |
葡萄糖 |
200 mg/mL |
50 |
81 |
蔗糖 |
200 mg/mL |
50 |
92 |
尿素 |
1 mol/L |
50 |
106 |
精氨酸 |
200 mg/mL |
50 |
110 |
γ球蛋白 |
60 mg/mL |
10 |
102 |
60 mg/mL |
5 |
84 |
|
60 mg/mL |
2.5 |
88 |
|
BSA |
200 mg/mL |
10 |
95 |
表1. 在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率
我们对5种糖类的不同浓度下的DNA回收率进行了测定,所有DNA加标回收率都在80%~110%范围内。另外,在精氨酸和尿素中也能够以高回收率提取DNA。在蛋白质方面,我们测定了BSA(牛血清白蛋白)和人γ球蛋白,发现两者的DNA回收率都很高。根据样品不同(如蛋白质种类),可能会发生蛋白质沉淀的情况,这种情况下只需稀释或使用蛋白酶处理即可[5]。从以上结果来看,本试剂盒可对广泛样品以高重复性和高回收率提取残留DNA。
※“阈值法总DNA定量”是指利用Molecular Devices公司的“Threshold® Total DNA assay system”进行的DNA总量定量的
※ 测定方法,是一种不依赖于序列的DNA定量测定方法。
该方法的总DNA检测灵敏度为2 pg/assay。
◆使用DNA Extractor® Kit提取痕量残留DNA与通过qPCR法进行定量的案例
如上所述,“Threshold® Total DNA assay system”是一种总DNA定量法,并不针对特定序列进行检测。如果希望检测出宿主细胞来源的残留DNA,可以利用qPCR法将特定序列作为检测对象。相对于阈值法的DNA定量,qPCR法有着能更高灵敏度检测残留DNA的这一优点,接下来我们将围绕其能否提取假定宿主细胞来源的痕量DNA进行探讨。
在本实验案例中,我们将常用于蛋白和抗体生产的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞系细胞)以及大肠杆菌的基因组DNA作为残留DNA模型,通过提取痕量残留DNA以及以qPCR对其进行定量。实验步骤如图1所示。
图1. 实验步骤
首先,在100 μL的水(注射用蒸馏水)中添加了0.1 pg~100 pg各基因组DNA的样品,使用本公司的DNA提取试剂盒对上述样品提取DNA,然后将提取的DNA溶解于100 μL的水中。之后采用qPCR,并根据同时值得的校准曲线计算出添加DNA的回收量。结果,大肠杆菌基因组和CHO细胞基因组在0.1 pg~100 pg之间的加标回收率为85~120%(虽未在文中展示数据,但两种基因组在1000 pg以内回收率几乎为100%)。
接下来,进行模拟细胞培养上清液中含有残留DNA的实验。细胞培养上清液样品通过将0.1 pg CHO细胞基因组DNA添加到500 μL在10%FBS DMEM中培养3天的人胰腺癌细胞系Panc-1的培养上清液中配制而成。结果,根据生成的校准曲线所得的回收量为0.093 pg。通过上述实验证明,使用本试剂盒,即使是500 μL中所含残留DNA仅为0.1 pg(100 fg)的fg级别的痕量DNA也以高回收率进行提取。另外,由于DNA Extractor® Kit可以以90%以上的高回收率回收存在于水、磷酸盐缓冲液或是细胞培养上清液等样品中的痕量残留DNA(表1表2),因此可以证明本试剂盒的高回收率在不同样品中具有广泛性。
样品 |
DNA量 |
根据标准曲线所得回收DNA量(pg) |
加标回收率(%) |
注射用蒸馏水 |
0.1 pg |
ND(低于检测下限) |
- |
1 pg |
1.031 |
103 |
|
10 pg |
11.09 |
111 |
|
100 pg |
85.1 |
85 |
|
注射用蒸馏水 |
0.1 pg |
0.933 |
93 |
0.1 pg |
1.187 |
119 |
|
10 pg |
11.57 |
116 |
|
100 pg |
87.1 |
87 |
|
人类细胞培养上清液 |
0.1 pg |
0.0928 |
93 |
表2. 基因组DNA加标回收率
◆结语
使用DNA Extractor® Kit,能够以高回收率回收样品中所含残留DNA。在定量残留DNA时,从样品中提取DNA是十分重要的一个步骤,即便是痕量残留DNA也可以通过本试剂盒进行高回收率提取。另外,由于本试剂盒能够用于广泛的样品,因此我们认为它不仅能用于CHO细胞,还能用于大肠杆菌和酵母等其他宿主细胞来源的残留DNA,有望在生物制药的质控中发挥作用。
◆参考文献
1. Knezevic et al. : Biologicals, 36:203-211(2008).
2. Ishizawa, M et al. : Nucleic Acids Res., 19, 5792(1991).
3. Kung. V. T et al. : Anal. Biochem., 187, 220-227(1990).
4. 水沢左衛子, 本間玲子. : Pharm Tech. Japan, 7, 309-314, 426-431(1991).
5. 和光純薬時報 Vol.61 No.1 p.27(1993)
◆产品列表
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
292-81101 |
DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method |
50 tests |
更多产品详情请点击:生物制药残留DNA提取试剂盒(碘化钠法) DNA Extractor® Kit
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