使用DNA Extractor® Kit检测残留DNA


使用DNA Extractor® Kit检测残留DNA

使用DNA Extractor® Kit检测残留DNA



富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所 福地大树

◆前言


包含疫苗在内的大部分生物药都是使用培养细胞或大肠杆菌生产的,有研究者指出,通过这种方式生产的原料药、制剂可能会残留着宿主细胞来源的DNA。不可否认,宿主细胞或病毒来源的致癌基因很可能会通过这些残留DNA转运过来,或引起病毒DNA感染事件。因此,残留DNA的定量检测是生物制药和其工艺验证中不可或缺的一部分。

有报告建议生物药中每剂量残留DNA的含量不超过100 pg[1] ,不仅是欧美地区,其他国家也愈发认为必须将定量检测宿主细胞来源的残留DNA作为质量检测项目之一。而检测这种痕量残留DNA,则需要从样品中以高回收率提取痕量残留DNA。

本文将介绍本公司销售的DNA Extractor® Kit —— 一款可用于此类痕量残留DNA检测的DNA提取试剂盒。

 


◆关于DNA Extractor® Kit


若要检测、定量生物药中所含的DNA总量,必须先将其所含的DNA从蛋白质等其他活性成分中分离、纯化出来。传统上分离DNA时通常会采用蛋白酶消化样品,然后利用苯酚、氯仿将DNA提取出来的方法。然而,这种方法却有着这些缺点:在获得相对高纯度的DNA的同时,需要使用苯酚、氯仿等有害物质;并且需要花费工夫和时间进行提取操作。而使用二氧化硅等物质作为载体的固相提取方法会因为DNA被吸附到载体上而导致其损耗,因此并不适合用于回收痕量DNA。同样的,使用有机溶剂的方法的痕量DNA回收率也很低,这也是DNA提取试剂的问题之一。

本公司1992年起推出的DNA Extractor® Kit(中国药典版本产品编号:292-81101),通过使用碘化钠法解决了以上问题,只需简易的操作,便可以高回收率提取高纯度的DNA。

 


◆DNA Extractor® Kit的原理


本试剂盒 中包含碘化钠和表面活性剂,碘化钠作为蛋白质增溶剂(离液离子),与表面活性剂一同将样品中以蛋白质为主的成分转变为可溶状态,然后通过加入异丙醇,能够选择性地令核酸(主要是DNA)和糖原产生沉淀(即共沉淀)[2]。如上所述,该试剂盒实现了在不使用固相载体或有机溶剂的情况下,通过简化的提纯步骤获得了沉淀物,以高回收率提取痕量DNA。

※ 本试剂盒组分:碘化钠溶液、N-月桂酰肌氨酸钠溶液、洗净液(A)、洗净液(B)、糖原溶液

 


◆使用DNA Extractor® Kit提取DNA与定量DNA总量案例


笔者将在下文中重新介绍一次曾刊载于本公司和光纯药时报Vol.60 No.3 p.28(1992)中的案例,该案例报道了关于本试剂盒在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率。在该实验中,分别将通常用作赋形剂或添加剂的物质(精氨酸、尿素等)和蛋白质(BSA(牛血清白蛋白)和人γ球蛋白)以常量或过量溶解于磷酸盐缓冲液中,然后添加pg级的小牛胸腺DNA从而得到模型溶液。接下来,按照DNA Extractor® Kit的实验步骤,对400 µL的每种模型溶液进行DNA提取处理。将所得沉淀物溶解于500 μL的磷酸盐缓冲液中进行阈值法总DNA定量[3][4],测定其DNA的加标回收率。测定结果如表1所示。

 

赋形剂及其含量

DNA添加量(pg)

DNA回收率(%)

山梨糖醇

200 mg/mL

50

95

50 mg/mL

50

94

麦芽糖

400 mg/mL

50

89

200 mg/mL

50

102

50 mg/mL

50

98

甘露醇

200 mg/mL

50

84

葡萄糖

200 mg/mL

50

81

蔗糖

200 mg/mL

50

92

尿素

1 mol/L

50

106

精氨酸

200 mg/mL

50

110

γ球蛋白

60 mg/mL

10

102

60 mg/mL

5

84

60 mg/mL

2.5

88

BSA

200 mg/mL

10

95


表1. 在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率

我们对5种糖类的不同浓度下的DNA回收率进行了测定,所有DNA加标回收率都在80%~110%范围内。另外,在精氨酸和尿素中也能够以高回收率提取DNA。在蛋白质方面,我们测定了BSA(牛血清白蛋白)和人γ球蛋白,发现两者的DNA回收率都很高。根据样品不同(如蛋白质种类),可能会发生蛋白质沉淀的情况,这种情况下只需稀释或使用蛋白酶处理即可[5]。从以上结果来看,本试剂盒可对广泛样品以高重复性和高回收率提取残留DNA。

※“阈值法总DNA定量”是指利用Molecular Devices公司的“Threshold® Total DNA assay system”进行的DNA总量定量的

※ 测定方法,是一种不依赖于序列的DNA定量测定方法。

   该方法的总DNA检测灵敏度为2 pg/assay。


◆使用DNA Extractor® Kit提取痕量残留DNA与通过qPCR法进行定量的案例


如上所述,“Threshold® Total DNA assay system”是一种总DNA定量法,并不针对特定序列进行检测。如果希望检测出宿主细胞来源的残留DNA,可以利用qPCR法将特定序列作为检测对象。相对于阈值法的DNA定量,qPCR法有着能更高灵敏度检测残留DNA的这一优点,接下来我们将围绕其能否提取假定宿主细胞来源的痕量DNA进行探讨。

在本实验案例中,我们将常用于蛋白和抗体生产的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞系细胞)以及大肠杆菌的基因组DNA作为残留DNA模型,通过提取痕量残留DNA以及以qPCR对其进行定量。实验步骤如图1所示。

使用DNA Extractor® Kit检测残留DNA

图1. 实验步骤



首先,在100 μL的水(注射用蒸馏水)中添加了0.1 pg~100 pg各基因组DNA的样品,使用本公司的DNA提取试剂盒对上述样品提取DNA,然后将提取的DNA溶解于100 μL的水中。之后采用qPCR,并根据同时值得的校准曲线计算出添加DNA的回收量。结果,大肠杆菌基因组和CHO细胞基因组在0.1 pg~100 pg之间的加标回收率为85~120%(虽未在文中展示数据,但两种基因组在1000 pg以内回收率几乎为100%)。

接下来,进行模拟细胞培养上清液中含有残留DNA的实验。细胞培养上清液样品通过将0.1 pg CHO细胞基因组DNA添加到500 μL在10%FBS DMEM中培养3天的人胰腺癌细胞系Panc-1的培养上清液中配制而成。结果,根据生成的校准曲线所得的回收量为0.093 pg。通过上述实验证明,使用本试剂盒,即使是500 μL中所含残留DNA仅为0.1 pg(100 fg)的fg级别的痕量DNA也以高回收率进行提取。另外,由于DNA Extractor® Kit可以以90%以上的高回收率回收存在于水、磷酸盐缓冲液或是细胞培养上清液等样品中的痕量残留DNA(表1表2),因此可以证明本试剂盒的高回收率在不同样品中具有广泛性。

样品
(括号为所添加基因组DNA来源 )

DNA量

根据标准曲线所得回收DNA量(pg)

加标回收率(%)

注射用蒸馏水
(大肠杆菌)

0.1 pg

ND(低于检测下限)

1 pg

1.031

103

10 pg

11.09

111

100 pg

85.1

85

注射用蒸馏水
(CHO细胞)

0.1 pg

0.933

93

0.1 pg

1.187

119

10 pg

11.57

116

100 pg

87.1

87

人类细胞培养上清液
(CHO细胞)

0.1 pg

0.0928

93

表2. 基因组DNA加标回收率


◆结语


使用DNA Extractor® Kit,能够以高回收率回收样品中所含残留DNA。在定量残留DNA时,从样品中提取DNA是十分重要的一个步骤,即便是痕量残留DNA也可以通过本试剂盒进行高回收率提取。另外,由于本试剂盒能够用于广泛的样品,因此我们认为它不仅能用于CHO细胞,还能用于大肠杆菌和酵母等其他宿主细胞来源的残留DNA,有望在生物制药的质控中发挥作用。

 


◆参考文献


1. Knezevic et al. : Biologicals, 36:203-211(2008).

2. Ishizawa, M et al. : Nucleic Acids Res., 19, 5792(1991).

3. Kung. V. T et al. : Anal. Biochem., 187, 220-227(1990).

4. 水沢左衛子, 本間玲子. : Pharm Tech. Japan, 7, 309-314, 426-431(1991).

5. 和光純薬時報 Vol.61 No.1 p.27(1993)

 


◆产品列表

产品编号

产品名称

规格

292-81101

DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method
 (Sodium Iodide Method)
残留DNA提取试剂盒(碘化钠法)

50 tests

更多产品详情请点击:生物制药残留DNA提取试剂盒(碘化钠法) DNA Extractor® Kit

更多产品信息请点击下载产品宣传页:生物制药残留DNA提取试剂盒DNA Extractor® Kit