PUREfrex ^® 2.1

PUREfrex^® 无细胞蛋白合成试剂盒

PUREfrex ^® 2.1 保留PUREfrex ^® 2.0 反应液组分的同时，对Solution Ⅰ进行细分，并提供还原剂，可根据需求选择更合适的蛋白合成条件。

特别推荐用于需严格控制氧化还原条件的含二硫键蛋白的合成。

可搭配添加剂DsbC Set (#PF005-0.5) 或 PDI Set（#PF006-0.5）使用。

PUREfrex ^® 2.1不含分子伴侣，因此根据合成蛋白不同，可能无法形成正确的高阶结构，也可能无法溶解。这时，只需在蛋白合成时添加分子伴侣即可解决。GeneFrontier也推出了适用于本试剂盒的分子伴侣DnaK mix（#PF003-0.5）和GroE mix（#PF004-0.5）。

◆使用示例

需要二硫键结合的蛋白合成

使用不同种类的还原剂合成两种蛋白，并比较其合成量和活性。

结果显示，虽然合成量无差异，但二硫键的形成效率不同。

1. IgG的合成

IgG是通过二硫键（SS键）形成2条L链（轻链）和2条H链（重链）的四聚体结构。向含GSSG（氧化型谷胱甘肽）、大肠杆菌的二硫键异构酶 DsbC 和加入了分子伴侣的PUREfrex ^® 反应液中添加不同种类的还原剂合成IgG，并比较其合成量。结果显示，虽然从SDS-PAGE的电泳分析中没有发现L链和H链合成量的显著差异，但四聚体结构的IgG形成效率根据使用的还原剂种类各异。

使用试剂盒

● PUREfrex ^® 2.1（#PF213-0.25）
● DTT、GSH

● DsbC Set（#PF005-0.5）
● GSSG、DsbC

● DnaK Mix（#PF003-0.5）
● DnaK、DnaJ、GrpE

比较PUREfrex ^® 合成的IgG和市售产品的抗原结合及内化的结果，请点击“使用重组无细胞蛋白合成系统PUREfrex开发全长IgG抗体的合成方法（2017年）”查看。

关于scFv和Fab合成相关的数据，请点击"根据蛋白合成能力提高的PUREfrex ® 2.0 进行Fab、Toxin及Immunotoxin的体外合成（2015年）"查看。

使用PUREfrex ^® 试剂盒合成IgG, Fab, scFv的研究成果，可查看以下论文。

“Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system.”
Scientific reports 9, 671. (2019)

2. 酸性磷酸酶（AppA）活性

使用两种还原剂DTT和GSH（还原型谷胱甘肽），并添加改变浓度的GSSG（氧化型谷胱甘肽）和大肠杆菌的二硫键异构酶DsbC合成需要二硫键（SS键）的大肠杆菌 AppA^*1，并比较其合成量和活性。结果显示，虽然从还原凝胶的电泳分析中没有发现AppA的合成量有显著差异，但根据使用的还原剂类型和浓度，合成的AppA的活性会有所不同。

使用试剂盒

● PUREfrex ^® 2.1（#PF213-0.25）
● DTT、GSH

● DsbC Set（#PF005-0.5）
● GSSG、DsbC

*1） AppA有5个二硫键，其中一个为半胱氨酸残基间的二硫键。

◆产品组成

关于PUREfrex ^® 2.1 中各Solution成分保密。

250 µL反应用

	产品规格	产品成分	开封后的储存温度*1
SolutionⅠ*2	100 μL	氨基酸、NTP、tRNA、酶底物等	-20℃
Solution Ⅱ	12.5 μL	蛋白（30% 甘油溶液）	-20℃或-80℃*3
Solution Ⅲ	25 μL	核糖体（20 µM）	-80℃*3
Cysteine	20 μL	半胱氨酸（10 mM）	-20℃
DTT	20 μL	二硫苏糖醇（40 mM）	-20℃
GSH	20 μL	还原型谷胱甘肽（80 mM）	-20℃
DHFR DNA*4 碱基序列	10 μL	含大肠杆菌DHFR基因的PCR产物 (20 ng/μL)	-20℃

2 mL 反应用

	产品规格	产品成分	开封后的储存温度*1
SolutionⅠ*2	800 μL	氨基酸、NTP、tRNA、酶底物等	-20℃
Solution Ⅱ	100 μL	蛋白（30% 甘油溶液）	-20℃或-80℃*3
Solution Ⅲ	200 μL	核糖体（20 µM）	-80℃*3
Cysteine	160 μL	半胱氨酸（10 mM）	-20℃
DTT	160 μL	二硫苏糖醇（40 mM）	-20℃
GSH	160 μL	还原型谷胱甘肽（80 mM）	-20℃
DHFR DNA*4 碱基序列	10 μL	含大肠杆菌DHFR 基因的PCR产物 (20 ng/μL)	-20℃

*1）试剂盒开封前，请在-80℃条件下储存。

*2）SolutionⅠ中不含半胱氨酸和还原剂。蛋白合成时，请根据需要添加试剂盒附带的半胱氨酸和还原剂。

*3）在-80°C条件下储存使用后的剩余反应溶液时，应在储存前使用液氮或干冰/乙醇等进行速冻。请根据需求进行分装，避免反复冻融。

*4）当用作蛋白合成的阳性对照时，请在20 µL合成反应溶液中添加1 µL DHFR DNA。

◆使用方法

使用PUREfrex ^® 2.1 时，可在任意体积的反应液下进行蛋白合成。例如，在20 μL反应液中添加0.5 mM 半胱氨酸和4 mM GSH进行合成时，反应液的制备方法如下所示。添加形成二硫键（SS键）所需的添加剂 DsbC Set（#PF005-0.5）或 PDI Set（#PF006-0.5）进行合成时，请查看各产品的详情页。

1. 将SolutionⅠ、Cysteine、GSH在室温~37℃下加热1 min左右至完全融解，随后置于冰上。

2. 将Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。

3. 将融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ、Cysteine、GSH轻轻涡旋后，离心并收集试管底部的内容物。

4. 根据下述配比制备反应液。（DNA 添加量为每kbp 0.5-3 ng/μL）

Water	7-X μL
Solution Ⅰ	8 μL注1
Cysteine	1 μL
GSH	1 μL
Solution Ⅱ	1 μL
Solution Ⅲ	2 μL
模板DNA 注2	X μL
Total	20 μL

5．在37°C的加热块或水浴中反应 2~6 h，合成蛋白^注3。

6．合成的蛋白可用于多种用途^注4。

注意事项

注1）请注意，使用量与PUREfrex ^® 2.0 不同。

注2）模板DNA请根据目标蛋白自行制备。关于制备方法，请参阅“关于模板DNA”。

注3）如果在气相恒温槽（如培养用恒温器）中进行反应，反应液的温度上升需花费更多的时间，合成量会有所降低。

注4）通过SDS-PAGE确认合成时，请用水稀释反应液后进行电泳。详情请点击“PUREfrex反应液的SDS-PAGE”查看。

◆使用注意事项

PUREfrex ^® 为研究用试剂，不可用于包含人在内的动物给药、临床和诊断等其他用途。此外，请勿用于食品或家庭用途。

使用 PUREfrex ^® 时，请使用不含RNase的水、试剂和设备。 此外，建议佩戴手套和口罩。

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