上海金畔生物科技有限公司代理UELANDY荧光染料全系系列产品
YF®594 TUNEL 细胞凋亡试剂盒（红色荧光）
产品货号: T6014S/T6014L
产品规格: 20T/50T
目录价（元）:1105/2211
推荐仪器：荧光显微镜（主推）、流式细胞仪
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产品概述：
产品内容
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组分 规格 |
20T | 50T |
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A. TUNEL Equilibration Buffer |
2×1 mL |
5 mL |
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B. YF®488/555/594/640/Cy3 TUNEL Reaction Buffer |
1 mL |
2 × 1.25 mL |
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C. TdT Enzyme |
20 μL |
50 μL |
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D. Proteinase K (2 mg/mL) |
40 μL |
100 μL |
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E. DNase I (2 U/μL) |
5 μL |
13 μL |
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F. 10 × DNase I Buffer |
100 μL |
260 μL |
储存条件
本产品应置于-20℃储存，组分 B 需避光，避免反复冻融。有效期见外包装。
注：组分 A 和 B 使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
产品介绍
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱，本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺 YF®594-dUTP。YF®594-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中，TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的 3´-OH 末端。抗原标记的 dUTP（如地高辛-dUTP、生物素 -dUTP），因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。
注意事项
1. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
说明书：
UE-T6014S/T6014L
MSDS：
MSDS T6014 YF®594 TUNEL Apoptosis Kit（Red fluorescence）
常见问题解答：
◆为什么出现了一些非特异标记？
1. 有些细胞或组织，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高，使得DNA全部被切断，易导致假阳性。建议：取出细胞或组织后要立即固定并充分固定，以阻止这些酶的活性，同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响，建议：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低，导致组织中心部分固定效果不佳，而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂，产生假阳性。建议：推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合，所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
◆为什么没有染上荧光？
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛，现用现配。不建议使用乙醇，乙醇固定液对组织的渗透力较弱，影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蜡切片推荐使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同，时间太长容易脱片，适当调整。
3. 延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应是否正确进行。
◆如何对细胞核进行复染？
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。
◆为什么荧光背景高？
1. 支原体污染：可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长，可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作，稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议：在非高增殖期取样检测；
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光，选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长，减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合，在TdT 酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。
◆标记率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上购买的甲醛大多含有甲醇）固定的样品标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失），采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长，导致交联程度过高，减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡，会细胞皱缩，贴壁黏附力降低，导致凋亡细胞容易脱落。建议：在凋亡诱导结束后，可以对多孔板进行1000g离心5min，然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机，请注意操作轻缓，防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。
◆在蛋白酶K中消化组织样品多久？
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。
◆实验的组织切片应该多厚？
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。
使用本产品的文献：
1.OGG1-initiated base excision repair exacerbates oxidative stress-induced parthanatos
Ruoxi Wang, Chunshuang Li, Ping Qiao, Yaoyao XUE, Xu Zheng, Hongyu Chen, Xianlu Zeng,Wenguang Liu, Istvan Boldogh, XUEqing Ba
Cell Death&Disease(2018) DOI： 10.1038/s41419-018-0680-0
应用方向：流式分析
2.VEGF-C/VEGFR-3 axis protects against pressure-overload induced cardiac dysfunction through regulation of lymphangiogenesis
Qiu-Yue Lin, Yun-Long Zhang, Jie Bai, Jin-Qiu Liu, Hui-Hua Li
Clin Transl Med
参考文献
1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage
应用方向：细胞凋亡染色&流式分析
2.Notch gain of function in mouse periocular mesenchyme downregulates FoxL2 and impairs eyelid levator muscle formation, leading to congenital blepharophimosis
应用方向：切片染色