在新的样品类型中，如何验证样品的稀释和实现线性

◆免疫分析样品的验证实验——什么是基质干扰？

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于微孔板的技术，常用于检测和定量各种生物样品中人们所感兴趣的低丰度待测分析物。 该技术取决于两个要素：（1）通过由酶和标记二抗结合所产生的比色产物的显影来高度准确地测定抗体-抗原间的相互作用（2）基于上述相同的相互作用，以标准参考重组蛋白制作标准曲线， 然后再与之前的结果准确比对，从而得出生物样品中待测物的浓度。

在市售的ELISA试剂盒中，准确测量分析物的关键，是对您的独特样品和（或）未经试剂盒制造商验证的样品进行测试。由于不同的抗体-分析物有不同的结合特征，且目标分析物中样品基质的背景中存在固有内源物质的差异，可能会使得这些样品难以用试剂盒中的抗体获得稳健的检测和定量效果。这称为样品的基质干扰。这些干扰物质是结构相似但化学性质有差异的化合物，它会与靶向目标分析物发生抗体交叉反应。受到这种干扰时，样品基质中内源性干扰物质或外源性污染物会导致光学密度（OD值）错误地增加或减少，不能反映分析物浓度真实水平。会产生基质干扰的样品包括一些富含蛋白质的样品，或一些具有潜在基质干扰的样品， 如尿液、细胞裂解液和血液成分（血清和血浆）。

除了样品固有的内源性物质和由于人为错误产生的外源性污染物之外，使用者可能还需要评估测定用的稀释缓冲液与潜在的干扰组分之间的相容性。干扰组分可以是pH依赖性的、去垢型的或有机溶剂型的，缓冲溶液盐的组成和浓度会决定缓冲液的相容性。有时候可能需要更换缓冲液来排除干扰，以便能检测样品中分析物的真实浓度。另一方面，当分析物的水平显著升高到超过测定的定量限（LOQ）时，优化样品的稀释度成为克服这种干扰的一种策略。为了确保样品能准确地检测和定量，并减轻样品基质效应，终端用户可能需要考虑通过加标-回收以及稀释线性实验来进行样品检验。

◆加标-回收实验

加标和回收实验的主要目标，是确定分析物的检测是否受到使用者制备标准曲线时所用的测定稀释剂/缓冲液与样品基质之间的差异的影响。样品基质可以是纯的（未稀释的）生物样品或以测定稀释剂稀释的生物样品。这是通过将已知量的重组蛋白质标准品加入天然测试样品基质中（加标），并观察其相对于向测定稀释剂中加入相同已知量的重组蛋白质标准品的响应（回收）来实现的。响应（终浓度）可以根据添加的重组蛋白质标准物的量从标准曲线和OD值来计算得出。在运行两组响应并从标准曲线计算出浓度后，终端用户可以计算出回收百分比，以确定观察到的加标样品值与观察到的未加标样品值相对于实际已知量的百分比偏差，从而确定稀释剂和样品基质的兼容性。作为使用者，他们希望在样品基质和测定稀释剂/缓冲液中对给定的目标分析物实现相同的响应。换句话说，完全相容的样品基质应该获得100％的回收率，因为加标后所观察到的回收率在稀释剂测定时和样品基质测定时所获得的回收率是应该相同的。回收率最大可能会偏离20％。如果回收的值与预期的量有显著出入（根据加入已知的量来计算得出），那么与100％回收率对比所发生的偏差可能能够表明稀释剂与样品基质的不相容性/差异程度，在这种情况下必须进行调整来尽量减少偏差。在样品回收率非常差的情况下， 建议使用其他不同的、其组成与样品基质更加接近的分析稀释剂。

◆稀释线性实验

如样品在系列稀释下未呈现出线性，则表明在给定稀释度下，基质组分干扰了对目标分析物的准确检测。因此，使用者将样品稀释至观察不到干扰时，有必要校正稀释因子。进行稀释线性实验是为了证明，加标浓度高于定量上限的样品可稀释至工作标曲范围内的浓度，并仍可以产生准确可靠的结果。钩状效应所带来的不良线性，也可通过实现稀释线性来减轻。当分析物的浓度开始超过抗体的量时，会产生钩状效应。这时候，随着分析物浓度开始远远超出可用的抗体的量时，剂量反应曲线的平台在进一步增长时的斜率会开始变负，说明出现了潜在的基质干扰且的分析物浓度定量的准确性开始降低。使用合适的、精选的稀释剂在分析范围内来对样品进行系列梯度稀释。当稀释线性出现时，连续的稀释点OD值会出现线性变化，或者每个稀释点乘以稀释倍数后，将计算得到大致相同的样品浓度。例如，如果使用者进行两倍连续稀释，则每个点之间的OD值大致应该有两倍的差异。对于已知最小所需稀释度（MRD）的已测样品，在理论上该值可作为起始点，然后通过一系列的稀释来确定该起始点是否合适。如果样品尚未经过检测，则可能需要通过以一个更大范围的稀释度的滴定来确定MRD， 从而实现线性。稀释线性能保证测试的高度准确性并且表明该测试在不同稀释度下具有灵活性。

进行稀释线性实验也可以通过制备几种具有低浓度分析物的样品的稀释液，将已知量的相同分析物掺入每一个稀释液中，然后通过比较未加标和（或）未稀释样品的所观察到的值和预期的值，从而来测试和评估测定回收率。在稀释后，拥有理想线性的样品，所被观察到的样品浓度相对于其终浓度来说不应该出现变化。当样品回收率可在预期值的80％至120％范围之内，即可实现线性。考虑到稀释数据在测定范围内的低端会有统计学上的限制，因此应该避免有低于测定中定量限两倍的值。

◆总结

Enzo Life Sciences有着各式各样的ELISA试剂盒，旨在检测各种生物标志物，有着多种样品基质可供测试。我们的试剂盒广受欢迎，而Enzo Life Sciences在开发和优化商业免疫检测方面有着数十年的经验，可以满足科学界不断变化的需求。我们提供广泛的免疫测定试剂盒，用于监测野生动物的压力，生殖，健康，福利和生存。我们较受欢迎的用于量化17β-雌二醇，黄体酮，睾酮，皮质醇和皮质酮的ELISA用于许多出版物和协议，已被全世界的动物园，水族馆和保护科学家所使用。我们很乐意为您的研究需求提供简单而实用的技巧和指导。如需订购请联系客服。