小鼠精子冻存液和体外受精培养基

FERTIUP^® 和 CARD MEDIUM^®

该试剂可以保证和促进实验小鼠精子的冷冻保存效果，并能提高体外受精率。

FERTIUP^® 小鼠精子冻存液
FERTIUP^® 小鼠精子预孵培养基
CARD MEDIUM^® 小鼠体外受精用培养基

FERTIUP^® PM -CARD MEDIUM^® 套装

     

◆原理

 

       FERTIUP^®（小鼠精子冻存液、小鼠精子预孵培养基）和 CARD MEDIUM^®（高性能体外受精用培养基）是冻存小鼠精子、预孵培养、体外受精的高性能试剂。可以通过试剂冷冻保存精子，建立高效经济的小鼠系统（转基因小鼠等）。大大提高了传统 C57BL/6与129 品系小鼠“冻存-精子”的复苏和新鲜精子的体外受精率。

       使用了 FERTIUP^® 和 CARD MEDIUM^® 小鼠精子冻存・体外受精系统能够保证宝贵小鼠资源的安全性及可靠性。研究人员发现使用液氮低温保存小鼠品系的精子，成本约是单克隆保存的三十分之一。

(图片是用 FERTIUP® 和 CARD MEDIUM® 的冻存精子进行体外受精而产出的小鼠)

FERTIUP® 和 CARD MEDIUM®  系列

◆产品介绍

FERTIUP^® 和 CARD MEDIUM^® 是什么?

FERTIUP^® 和 CARD MEDIUM^® 是能保证和促进实验小鼠精子的冷冻保存效果，并能提高体外受精率的试剂。产品系列如下：
1. FERTIUP^® Mouse Sperm Cryoprotectant 小鼠精子冻存液 (KYD-001-EX)
→该试剂用来冻存精子。

2. FERTIUP^® Mouse Sperm Preincubation Medium 小鼠精子预孵培养基 (KYD-002-EX)
→该试剂用于在体外受精前，预孵复苏后的精子。

3.CARD MEDIUM^® Mouse Fertilization Medium 小鼠体外受精培养基(KYD-003-EX)
→该培养基用于体外受精

单独使用 FERTIUP 能得到较高的体外受精率，但如果配用上 CARD MEDIUM 就能达到更高的受精率，取得进一步成功。

◆优点・特色

FERTIUP®（小鼠精子冻存液）能防止冻存时的精子受到损伤。
FERTIUP®（小鼠精子预孵培养基）是能显著提高精子的受精能力。
CARD MEDIUM® 作用于卵子的透明带，使其更容易受精。

●   受精率高达80%以上

●   有效维系转基因小鼠（Tg/KO）

●   降低人工、设备和养殖成本

●   缩短小鼠繁殖时间

●   高效繁殖了以往难以繁殖的品系

 

◆案例・应用

【案例1】用 FERTIUP^® 和 CARD MEDIUM^® 冷冻复苏精子的体外受精率

【案例2】 不同品系小鼠的新鲜和冻存精子，使用了 FERTIUP^® 预孵培养基和 CARD MEDIUM^® 后的体外受精率比较

【使用流程】

       使用 FERTIUP^®（小鼠精子冻存液），用冻存的精子代替新鲜的精子，能够保存小鼠的系统。此方法能大幅度减少饲养小鼠的成本及空间。复苏冻存的精子，使用 FERTIUP^® （小鼠精子预孵培养基）和 CARD MEDIUM^® ，进行高效受精，移植胚胎至代育雌鼠体内，才能繁衍后代。

 

 

       即使自然交配程序困难，但只要在 FERTIUP^® （小鼠精子预孵培养基）中预孵从雄性小鼠取出新鲜的精子，接着和使用了 CARD MEDIUM^® 的卵子进行体外受精，移植胚胎，就能在短期内繁殖小鼠。

 

       取替雄性小鼠，用冷藏运输试剂盒运输小鼠的附睾尾，即经济又安全。然后把从尾部取下的精子放在 FERTIUP^®（小鼠精子预孵培养基）里预孵，接着和使用了 CARD MEDIUM^®的卵子进行体外受精，移植胚胎，就能简便地预孵小鼠。

 

 

 

       即使在低受精率的 129 和 BALB/c 系統中，ba取出的精子放在 FERTIUP^®（小鼠精子预孵培养基）里预孵，与在 CARD MEDIUM^® 的卵子进行体外受精，就能得到高受精率。

   具体操作见“相关资料”。

 

 

【相关资料】

FERTIUP^® 和CARD MEDIUM^® 系列

操作手册

CARD MEDIUM^®.pdf

 注意：CARD MEDIUM^®在体外受精时根据所用的精子的不同，调试方法液不一样。请详细阅读相关说明及正确使用试剂。

 

其他操作方法：

■采用新鲜精子的体外受精方法

小鼠的体外受精方法（使用FERTIUP^®孵育培养基和CARD MEDIUM^®）

■使用冷冻运输的附睾尾的体外受精方法

使用冷藏运输试剂盒进行附睾尾的低温运输

取出冷藏运输后的附睾尾进行体外受精（使用FERTIUP^®孵育培养基和CARD MEDIUM^®）

 

■小鼠精子的冻存、融解、解冻精子的体外受精方法

冻存小鼠精子（使用FERTIUP^®冻存液）

解冻已冻存的精子后进行体外受精（使用FERTIUP^®孵育培养基和CARD MEDIUM^®）

用CARD以外的方法来冻结的精子进行体外受精（使用FERTIUP^®孵育培养基和CARD MEDIUM^®）

◆产品选择

冻存小鼠精子
(使用FERTIUP^®Cryoprotectant冻存液、mHTF培养基、精子吸管、吸管接头和冷冻罐)
使用复苏精子进行体外受精
(使用FERTIUP^® Preincubation medium预孵培养基、CARD MEDIUM^®体外受精培养基、mHTF 培养基和吸管接头)
低温采集运输附睾尾

(使用Cold Transport Kit冷藏运输试剂盒)
使用低温运输的附睾尾精子进行体外受精
(使用FERTIUP^®Preincubation medium预孵培养基： PM 和mHTF培养基)
低温运输2-细胞期胚胎
(使用Cold Transport Kit冷藏运输试剂盒M2 和 KSOM)
体外受精
(使用FERTIUP^® Preincubation medium预孵培养基、CARD MEDIUM^® 体外受精培养基和mHTF培养基)
简易的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎
(使用DAP213 和 DMSO)
胚胎移植入输卵管
用以前保存的冻存精子进行体外受精
(使用FERTIUP^®Preincubation medium预孵培养基: PM, CARD MEDIUM^® 体外受精培养基和mHTF培养基)
复苏玻璃化冷冻后的胚胎的步骤
(使用0.25M 蔗糖and KSOM)
在氮气安瓿瓶里存储试剂和相关处理方法

玻璃化冷冻小鼠卵母细胞

(使用mHTF培养基)
试剂的组成

1M DMSO, DAP213, 0.25M蔗糖, mHTF培养基和 KSOM

◆产品系列

FERTIUP^®

我们提供了各种尺寸方便你使用  (0.5ml, 1ml, 5*0.5ml, 5*1ml)。

请注意，一旦开封了安瓿瓶，建议尽快一次性使用完，不要留到下次使用。

CARD MEDIUM^®

[试剂盒的组成]
一个装有培养基的安瓿瓶(A)：3 mL
一个装有粉末的小瓶(B)：30 mg
一个1.5ml的塑料管(C)
一个1.5ml的塑料管(D)
一个2.5毫升的一次性注射器
一根针
一套过滤器（孔径：0.22μm）

套装产品(FERTIUP^® + CARD MEDIUM^®) 

FERTIUP(R)   PM 1ML-CARD MEDIUM(R) 套装(KYD-004-EX) [试剂盒的组成]   一个装有培养基的安瓿瓶(A)：3 mL   一个装有粉末的小瓶r (B)：30 mg   一个1.5ml的塑料管(C)   一个1.5ml的塑料管(D)   一个2.5毫升的一次性注射器   一根针   一套过滤器（孔径：0.22μ） 一个装有PM的安瓿瓶 (1.0ml)

FERTIUP(R)   PM 0.5ML-CARD MEDIUM(R) 套装(KYD-005-EX) [试剂盒的组成]   一个装有培养基的安瓿瓶(A)：3 mL   一个装有粉末的小瓶r (B)：30 mg   一个1.5ml的塑料管(C)   一个1.5ml的塑料管(D)   一个2.5毫升的一次性注射器   一根针   一套过滤器（孔径：0.22μ）   一个装有PM的安瓿瓶(0.5ml)

ARK and KYD-宣传页	CARD&FERTIUP-宣传页	HyperOva-宣传页

○常规问题

Q1：    请告知 FERTIUP^®小鼠精子冻存液、小鼠精子孵育培养基以及 CARD MEDIUM^® 的保存方法以和保质期。
A1：    1. 请在 2～10℃ 冷藏 FERTIUP^®小鼠精子孵育培养基和 CARD MEDIUM^®。
            2. 请在 18～28℃ 室温，保存 FERTIUP^®小鼠精子冻存液 。
            3. 关于保质期，请查看与产品附带的说明书或者安瓿瓶上的注释。

Q2：    产品开封后能否少量分装冻存？
A2：    不可以。因为无法保证冻存后的质量，所以不建议此做法；

Q3：    产品里面含有对人体有害的物质吗？
A3：    不，里面不含有对人体有害的物质。

Q4：    要怎样购买 FERTIUP^®和 CARD MEDIUM^® 试剂呢？
A4：    如需购买，请与我司联系。

Q5：    产品的货期需要多久？
A5：    我司产品均为日本原装进口，货期3~4周。

Q6：    如果产品中混有杂质，可以更换吗？
A6：    我司从生产到出货都实行严谨的品质管理体制，但如果在产品中混入类似玻璃片等杂物这情况，请立即拍照并与我们联系，会有专人为您

            解决。

Q7：    发现未开封的小鼠精子冻存液中出现结晶的现象。
A7：    极少数情况下，受低温影响会产生结晶。只要在使用前1小时，把小鼠精子冻存液放进 37℃ 的孵育器中保温，搅拌后结晶就会融解。融

            解后冻存液的效力不会产生任何问题。

○关于FERTIUP^®系列产品的疑问

Q1：    采用FERTIUP^®小鼠精子冻存液/小鼠精子孵育培养基冷冻而成的精子进行体外受精的C57BL/6小鼠虽然得到了较高体外受精率，但是否也

            能提高其他系统小鼠的体外受精率呢？

A1：    经验证，几乎都能提高 C57BL/6 小鼠之外的系统的体外受精率。

Q2：    FERTIUP^®小鼠精子冻存液不会一次性用完，如果用试管分装保存，冷藏数周后还可以使用吗？
A2：    不可以。建议尽快使用完开封后的冻存液。请尽量购买可以一次性使用完的规格。

Q3：    FERTIUP^®小鼠精子冻存液在保质期间呈乳白色，请问能够使用呢？
A3：    可以使用。之所以呈乳白色是因为保存液成分中的脱脂牛奶里的酪蛋白胶团沉淀。酪蛋白胶团对冻存精子没有帮助，生产过程中我们已尽

            量去除，但长期保存是还是有可能出现酪蛋白胶团沉淀。

            轻拍安瓿瓶混合溶液时，冻存液可能呈乳白的，但是不会影响体外受精率。

Q4：    FERTIUP^®系列产品的使用方法中，用流动液体石蜡会不会造成不良影响。
A4：    不会。因为一般的精子悬浊液（保存液中悬浊的精子）不会与流动石蜡混合，所以不会造成不良影响。

Q5：    冻存精子在FERTIUP^®小鼠精子孵育培养基里培养后，在体外受精培养基上进行体外受精时，精子浓度是多少？

A5：    通常冻存液的精子浓度是 100,000～200,000 精子/μL，在小鼠培养基（90μL）里加入冻融后的精子悬浊液（10μL），被稀释了 10 倍后，

            精子孵育培养基中的精子浓度变成10,000～20,000精子/μL。

            然后，加入孵育精子悬浊液（10μL），又被稀释了 10 倍，体外受精培养基中精子的浓度是 1,000～2,000 精子/μL。

            最后冻融后的运动精子比例大约是 20%，体外受精培养基中运动精子的浓度是 200～400 精子/μL。

Q6：    我想下载 FERTIUP^®系列产品说明，要去哪里下载呢？
A6：    请在官网查找，或者联系我们。

Q7：    请告知能确认精子冻结融解的方法。
A7：    1. 比较简单地确认冻融后精子的质量的方法是，冻结后在孵育培养基培养，以滴液周边活跃的精子数来作判断。

            2. 采取精子的方法是先确认未受精卵进行体外受精时，受精率是否最低达到 30%。
             （现销售的产品，在确保质量时，进行体外受精，已确认了 C57BL/6 小鼠的体外受精率达到 30% 以上。）

Q8：    请问有没有传统方法和在国外冻结精子的溶解方法？
A8：    请参考熊本大学的网上指南，里面提供了除 CARED 以外用冻结精子进行体外受精的方法。

○关于CARD MEDIUM^®的疑问

Q1：    CARD MEDIUM^®生产后能保质几个月呢？
A1：    目前为“生产后18个月”，今后若技术进步有可能进一步延长保质期。

Q2：    如果不与FERTIUP^®系列一起使用的话，就不能得到较高的受精率吗？
A2：    是的。FERTIUP^®对精子起作用，CARD MEDIUM^®对卵子起作用，从而提高受精率。因此，如果两者同时使用，C57BL/6 小鼠就得到

            高达 80% 的受精率。

Q3：    除 C57BL/6 小鼠以外的系统也能得到很高的体外受精率吗？
A3：    可以。其他系统也能得到较高的体外受精率。

【参考文献】

[1]	Takeo, T., Hoshii, T., Kondo, Y., Toyodome, H., Arima, H., Yamamura, KI., Irie, T. and Nakagata, N. Methyl-beta-cyclodextrin improves the fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after freezing and thawing by facilitating cholesterol efflux from the cells. Biol Reprod. 78(3):546-51. 2008.
[2]	Takeo, T and Nakagata, N. Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamine and methyl-{beta}-cyclodextrin in a preincubation medium yields a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab Anim. 44(2):132-7. 2010
[3]	Nakagata N. 2011. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods Mol Biol. 693: 57-734
[4]	Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.Nakagata N.Methods Mol Biol. 2011 693:57-73. PMID: 21080274,<链接>
[5]	Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamine and methyl-{beta}-cyclodextrin in a preincubation medium yields a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm.Takeo T,Nakagata N.Lab Anim. 2010 Apr;44(2):132-7. PMID: 20357317<链接>
[6]	Short-term storage and transport at cold temperatures of 2-cell mouse embryos produced by cryopreserved sperm.Takeo T, Kondo T, Haruguchi Y, Fukumoto K,Nakagawa Y, Takeshita Y, Nakamuta Y, Tsuchiyama S, Shimizu N, Hasegawa T, Goto M, Miyachi H, Anzai M, Fujikawa R, Nomaru K, Kaneko T, Itagaki Y,Nakagata N.J Am Assoc Lab Anim Sci. 2010 Jul;49(4):415-9. PMID: 20819385<链接>
[7]	Birth of mice from vitrified/warmed 2-cell embryos transported at a cold temperature.Takeo T, Kaneko T, Haruguchi Y, Fukumoto K, Machida H, Koga M, Nakagawa Y, Takeshita Y, Matsuguma T, Tsuchiyama S, Shimizu N, Hasegawa T, Goto M, Miyachi H, Anzai M, Nakatsukasa E, Nomaru K, Nakagata N.Cryobiology. 2009 Apr;58(2):196-202. PMID: 19168045<链接>
[8]	Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after freezing and thawing by facilitating cholesterol efflux from the cells.Takeo T, Hoshii T, Kondo Y, Toyodome H, Arima H, Yamamura K, Irie T, Nakagata N.Biol Reprod. 2008 Mar;78(3): 546-51. PMID: 18046011<链接>